分子生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)

1、整理ppt分子生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)老師：肖靚整理ppt分子生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)已成為生物化學(xué)及分子生物學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)已成為生物化學(xué)及分子生物學(xué)以及相關(guān)學(xué)科院系教學(xué)科研不可缺少的一部分。為以及相關(guān)學(xué)科院系教學(xué)科研不可缺少的一部分。為提高學(xué)生在分子生物學(xué)技術(shù)方面的動(dòng)手能力，分子提高學(xué)生在分子生物學(xué)技術(shù)方面的動(dòng)手能力，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室主要開設(shè)常用而基本的分子生物學(xué)實(shí)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室主要開設(shè)常用而基本的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。它的內(nèi)容包括質(zhì)粒驗(yàn)技術(shù)。它的內(nèi)容包括質(zhì)粒DNA的制備；的制備；DNA的重的重組；組；PCR基因擴(kuò)增等等?；驍U(kuò)增等等。 整理ppt實(shí)驗(yàn)要求n上課時(shí)間與紀(jì)

2、律：嚴(yán)格遵守老師的安排。n實(shí)驗(yàn)室內(nèi)禁止飲食、勿高聲談話、隨意走動(dòng)。n課前預(yù)習(xí)、課中認(rèn)真操作、課后的實(shí)驗(yàn)報(bào)告。n妥善保管好每組的實(shí)驗(yàn)器具。n實(shí)驗(yàn)操作要求人人動(dòng)手。n值日制度：每天五位同學(xué)。整理ppt一、 質(zhì)粒DNA小量制備的實(shí)驗(yàn)原理n 要把一個(gè)有用的外源基因通過基因工程手段，送進(jìn)細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)，需要運(yùn)載工具，攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的這種工具就叫載體（vector）。載體的設(shè)計(jì)和應(yīng)用是DNA體外重組的重要條件。整理ppt作為基因工程的載體必須具備下列條件n是一個(gè)復(fù)制子，載體有復(fù)制點(diǎn)才能使與它結(jié)合的外源基因復(fù)制繁殖。n載體在受體細(xì)胞中能大量增殖，只有高復(fù)制率才能使外源基因在受體細(xì)胞中大量擴(kuò)

3、增。n載體DNA鏈上有1到幾個(gè)限制性內(nèi)切酶的單一識(shí)別與切割位點(diǎn)，便于外源基因的插入。n載體具有選擇性的遺傳標(biāo)記，如有抗四環(huán)素基因（Tcr），抗新霉素基因（Ner）等，以此知道它是否已進(jìn)入受體細(xì)胞，也可根據(jù)這個(gè)標(biāo)記將受體細(xì)胞從其他細(xì)胞中分離篩選出來。 細(xì)菌質(zhì)粒具備上述條件，它是基因工程中常用的載體之一。整理pptn質(zhì)粒（plasmid）是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小在1120kb之間，具有雙鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA分子，主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中。質(zhì)粒具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能使子代細(xì)胞保持它們恒定的拷貝數(shù)，可表達(dá)它攜帶的遺傳信息。它可獨(dú)立游離在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，也可以整合到細(xì)菌染色體中，它離

4、開宿主的細(xì)胞就不能存活，而它控制的許多生物學(xué)功能也是對(duì)宿主細(xì)胞的補(bǔ)償。整理ppt質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的兩種類型n嚴(yán)密控制型（stringent control）：質(zhì)粒只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制，染色體不復(fù)制時(shí)，它也不復(fù)制。每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只含有1個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒分子。n松弛控制型（relaxed control）：質(zhì)粒在整個(gè)細(xì)胞周期中隨時(shí)復(fù)制，在細(xì)胞里，它有許多拷貝，一般在20個(gè)以上。 通常大的質(zhì)粒如F因子等，拷貝數(shù)較少，復(fù)制受到嚴(yán)格控制。小的質(zhì)粒，如ColE 質(zhì)粒（含有產(chǎn)生大腸桿菌素E1基因），拷貝數(shù)較多，復(fù)制不受嚴(yán)格控制。在使用蛋白質(zhì)合成抑制劑氯霉素時(shí)，染色體DNA復(fù)制受阻，而松弛型ColE質(zhì)粒繼續(xù)

5、復(fù)制1216h，由原來20多個(gè)拷貝可擴(kuò)增至10003000個(gè)拷貝，此時(shí)質(zhì)粒DNA占總DNA的含量由原來的2增加到4050。本實(shí)驗(yàn)分離提純化的質(zhì)粒pBR322、pUC19就是由ColE 衍生的質(zhì)粒。整理ppt分離質(zhì)粒DNA的三個(gè)基本步驟:n培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；n收集和裂解細(xì)菌；n分離和純化質(zhì)粒DNA。 采用溶菌酶可破壞菌體細(xì)胞壁，十二烷基硫酸鈉（SDS）可使細(xì)胞壁解，經(jīng)溶菌酶和陰離子去污劑（SDS）處理后，細(xì)菌染色體DNA纏繞附著在細(xì)胞壁碎片上，離心時(shí)易被沉淀出來，而質(zhì)粒DNA則留在清液中。用乙醇沉淀、洗滌，可得到質(zhì)粒DNA。整理ppt整理pptn質(zhì)粒DNA的相對(duì)分子量一般在106107范圍內(nèi)，

6、如質(zhì)粒pBR322的相對(duì)分子質(zhì)量為2.8106，質(zhì)粒pUC19的相對(duì)分子質(zhì)量為1.7106。n在細(xì)胞內(nèi)，共價(jià)閉環(huán)DNA（covalently closed circular DNA，簡稱cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，這種松弛型的分子叫作開環(huán)DNA（open circular DNA，簡稱ocDNA）。在電泳時(shí)，同一質(zhì)粒如以cccDNA形式存在，它比其開環(huán)和線狀DNA的泳動(dòng)速度快，因此在本實(shí)驗(yàn)中，自制質(zhì)粒DNA在電泳凝膠中呈現(xiàn)3條區(qū)帶。 整理ppt二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c內(nèi)容二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c內(nèi)容n目的：學(xué)會(huì)使用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。n

7、內(nèi)容：細(xì)菌培養(yǎng)及菌體的收獲、堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。 整理ppt三、實(shí)驗(yàn)材料和試劑三、實(shí)驗(yàn)材料和試劑n材料材料：大腸桿菌E.coli，含pBR322質(zhì)粒。 n儀器：儀器： 臺(tái)式高速離心機(jī)、臺(tái)式小型振蕩器、EP管(1.5mL微量離心管)、加樣器(20uLlmL)、吸頭。 整理ppt高壓蒸汽滅菌鍋整理ppt超凈工作臺(tái)整理ppt臺(tái)式高速離心機(jī)整理ppt恒溫?fù)u床整理ppt恒溫培養(yǎng)箱整理ppt試劑1.溶液（ pH8.0G.E.T緩沖液）：50 mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA。滅菌后存放。臨用前加溶菌酶4mg/mL。2.溶液： 0.2mol/L NaOH

8、(內(nèi)含1 SDS)，現(xiàn)配現(xiàn)用。3.溶液（ pH4.8乙酸鉀溶液）：5mol/L乙酸鉀60mL、冰乙酸11.5mL、雙蒸餾水28.5mL。4.酚/氯仿液(V/v1/1)：酚為重蒸酚，配制時(shí)，先將氯仿中加入異戊醇，使其體積比為24：1，然后等量的加入重蒸酚，混勻，并用0.1mol/L Tris-HCl (pH7.6)抽提幾次以平衡這一混合物，于棕色瓶中存放，并在上面覆蓋等體積的0.01 mol/L Tris-HCl (pH7.6)，4保存。5.pH8.0 TE緩沖液：10mmol/LTris-HCl、1mmol/L EDTA，其中含RNA酶20g/mL。6.無水乙醇 7.70乙醇 8. LB培養(yǎng)基

9、整理pptLB培養(yǎng)基的配制n每升含有胰蛋白胨10g,酵母提取物5g，NaCl10g,瓊脂糖或瓊脂（固體培養(yǎng)基時(shí)用）15g,用NaOH調(diào)pH至7.5。整理ppt微量移液器（pipetman）的使用n微量移液器是連續(xù)可調(diào)的，計(jì)量和轉(zhuǎn)移液體的專用儀器，其裝有直接讀數(shù)容量計(jì)，讀數(shù)由三位撥號(hào)數(shù)字組成，在移液容量范圍內(nèi)能連續(xù)調(diào)節(jié)，從上（最大數(shù)）到下（最小數(shù)）讀取。整理ppt整理ppt整理ppt 微量移液器的構(gòu)造整理ppt微量移液器的操作1）將微量移液器按鈕輕輕壓至第一停點(diǎn)；2）垂直握持微量移液器，將吸嘴浸入液樣面下幾毫米，千萬別將吸嘴直接插到液體底部；3）緩慢，平穩(wěn)的松開控制按鈕，吸上樣液。否則液體進(jìn)入吸

10、嘴太快，導(dǎo)致液體倒吸入移液器內(nèi)部，或吸入體積減少；4）等一秒鐘后將吸嘴提離液面；5）平穩(wěn)得把按鈕壓到第一停點(diǎn)，再把按鈕壓至第二停點(diǎn)以排出剩余液體；6）提起微量移液器，讓吸嘴在容器壁擦過；7）然后按吸嘴彈射器除去吸嘴。整理ppt微量移液器的操作n注意：n1）未裝吸嘴（tip）的微量移液器絕對(duì)不可用來吸取任何液體；n2）一定要在允許范圍內(nèi)設(shè)定容量，千萬不要將讀數(shù)的調(diào)節(jié)超出其適用的刻度范圍，否則會(huì)造成損壞；n3）不要橫放帶有殘余液體吸嘴的移液器；n4）不要用大量程的移液器移取小體積樣品。整理ppt離心機(jī)的使用n應(yīng)注意保持離心管放置位置的對(duì)稱以及離心管中樣品的平衡，離心管放進(jìn)離心機(jī)前應(yīng)先用衛(wèi)生紙擦干，

11、此外應(yīng)注意離心機(jī)在離心機(jī)內(nèi)的放置方向。整理ppt整理ppt電子天平的使用n注意在天平的最大稱量范圍內(nèi)使用。n天平應(yīng)放在無振動(dòng)、無空氣對(duì)流處，使用前須先調(diào)節(jié)水平泡至中央位置。n使用后應(yīng)保持儀器的潔凈。整理ppt微波爐的使用n微波爐內(nèi)不可使用金屬容器以及空載。整理ppt四、操作步驟四、操作步驟n(一) 培養(yǎng)細(xì)菌n將帶有質(zhì)粒pBR322的大腸桿菌接種在含50g/mL氨芐青霉素(Amp)的LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜。注意：添加Amp時(shí)，須待LB培養(yǎng)基冷卻到50左右方可加入。 整理ppt(二) 從菌落中快速提取制備質(zhì)粒DNAn1. 取1.4mL菌液置于1.5mL Ep管中，轉(zhuǎn)速10000r/mi

12、n，離心3min。整理pptn2. 棄上清，加入150L GET緩沖液，充分混勻，在室溫下放置10min。整理pptn3. 加入200L新配制的0.2mol/L NaOH(內(nèi)含1 SDS)，加蓋，顛倒23次，使之混勻，冰上放置4min，最多不能超過5min。整理pptn4 加入150L冰冷的乙酸鉀溶液。加蓋后，顛倒數(shù)次使之混勻，冰上放置15min。整理pptn5. 4，10000r/min，離心5min，上清液吸至另一干凈的1.5mL Ep離心管中，如上清液渾濁則需重新離心一次。整理pptn6. 于上清液中加等體積酚/氯仿液，振蕩混勻，4，12000r離心2min，小心吸取上清液，轉(zhuǎn)移至另一1

13、.5mL Ep管中，注意勿將兩液相中間的白色蛋白薄層吸出。整理pptn7. 向上清液加入2倍體積無水乙醇，混勻，室溫放置min。用離心機(jī)于10000rpm離心5min。整理pptn8. 小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。整理pptn9. 用0.5mL 70乙醇洗滌沉淀一次，除盡乙醇，室溫自然干燥，備用。整理pptn10. 用25uL含無DNA酶的胰RNA酶(20 ugmL)的TE重新溶解DNA，貯存于-20備用，可長期保存。整理ppt五、注意事項(xiàng)五、注意事項(xiàng)n1收集菌體提質(zhì)粒前，培養(yǎng)基要去除干凈，同時(shí)保證菌體在懸浮液中充分懸浮。n2在添加溶液與溶液后溶液的混合一定要柔

14、和，采用上下顛倒的方法，千萬不能在旋轉(zhuǎn)器上劇烈振蕩。其中加入溶液后，溶液變成澄清，并有黏性；加入溶液后，出現(xiàn)絮狀沉淀。n3苯酚具有腐蝕性，能造成皮膚的嚴(yán)重?zé)齻耙挛飺p壞，使用時(shí)應(yīng)注意。如不小心皮膚上碰到苯酚則應(yīng)用堿性溶液、肥皂及大量的清水沖洗。整理pptn4苯酚可以用于抽提純化DNA，由于苯酚的氧化產(chǎn)物可以使核酸鏈發(fā)生斷裂。所使用的苯酚在使用前必須經(jīng)過重蒸，且都必須用0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)進(jìn)行平衡。所以取酚/氯仿/異戊醇時(shí)應(yīng)取下層溶液，因?yàn)樯蠈邮荰ris-HCl液隔絕空氣層。n5酚/氯仿/異戊醇抽提時(shí)，應(yīng)充分混勻。經(jīng)酚/氯仿/異戊醇抽提后，吸取上清液時(shí)注意不要把中間的

15、白色層吸入，其中含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。n6有些質(zhì)粒本身可能在某些菌種中穩(wěn)定存在，但經(jīng)過多次移接有可能造成質(zhì)粒丟失。因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)挑單菌落。整理ppt六、問題和思考六、問題和思考n1裂解細(xì)菌時(shí)需注意的事項(xiàng)有哪些？n2質(zhì)粒的基本性質(zhì)有哪些？n3堿裂解法提取質(zhì)粒DNA中溶液、的作用是什么？n4抽提質(zhì)粒DNA的方法包括哪幾個(gè)步驟？n5如何提高質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量？ 整理ppt七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 1. 1.原理：簡明扼要地概括原理：簡明扼要地概括 2.2.材料與方法材料與方法 ：包括實(shí)驗(yàn)材料、試劑以及用具：包括實(shí)驗(yàn)材料、試劑以及用具( (廠家廠家) )。不要照。不要照抄，但要寫得明白，自己或他人日后能夠重復(fù)。抄，但要寫得明白，自己或他人日后能夠重復(fù)。 3.3.結(jié)果：實(shí)驗(yàn)記錄及數(shù)據(jù)處理結(jié)果：實(shí)驗(yàn)記錄及數(shù)據(jù)處理 4.4.討論：分析討論：分析-數(shù)據(jù)；解析數(shù)據(jù)；解析-現(xiàn)象、問題，定性地針對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、問題，定性地針對(duì)實(shí)驗(yàn)下結(jié)論。下結(jié)論。 (1)(1)結(jié)果的準(zhǔn)確性結(jié)果的準(zhǔn)確性 (2)(2)誤差（人為、儀器）誤差