人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則

1、人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則    一、引言    由于分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)及重組DNA（rDNA）技術(shù)的迅速發(fā)展，現(xiàn)已能夠確定和獲得許多天然活性蛋白的編碼基因，將其插入表達(dá)載體或引入某種宿主細(xì)胞后，能有效地表達(dá)該基因產(chǎn)物，再經(jīng)分離、純化和檢定，可得到用于預(yù)防和治療某些人類疾病的制品，諸如現(xiàn)有的乙型肝炎疫苗、胰島素、生長激素、干擾素等。    用不同于常規(guī)方法的rDNA技術(shù)生產(chǎn)的制品，是近年來出現(xiàn)的新產(chǎn)品，評價其安全性和有效性亦不同于常規(guī)方法。這一領(lǐng)域中的知識和技術(shù)還在不斷發(fā)展，為了有利于這類制

2、品在我國的研究和發(fā)展，并為這類制品的審評提供依據(jù)，有必要制定一個原則性指導(dǎo)文件，以保證在人群中試驗或應(yīng)用時安全有效。    本“人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則”（以下簡稱指導(dǎo)原則）不可能面面俱到，可能有許多專門技術(shù)問題會出現(xiàn)，對于這類問題或某一特定制品，則應(yīng)視具體問題具體研究決定。本指導(dǎo)原則亦將隨科學(xué)技術(shù)發(fā)展和經(jīng)驗積累而逐步完善。    二、總則    （一）本指導(dǎo)原則適用于rDNA技術(shù)生產(chǎn)并在人體內(nèi)應(yīng)用的蛋白質(zhì)、肽類制品。    （二）凡屬與一般生物制品有關(guān)的質(zhì)量控

3、制，均按現(xiàn)行版中國藥典有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。有關(guān)生產(chǎn)設(shè)施的要求應(yīng)參照國家藥品監(jiān)督管理局藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范執(zhí)行。    三、質(zhì)量控制要求    （一）原材料的控制    1表達(dá)載體和宿主細(xì)胞    應(yīng)提供有關(guān)表達(dá)載體詳細(xì)資料，包括基因的來源、克隆和鑒定，表達(dá)載體的構(gòu)建、結(jié)構(gòu)和遺傳特性。應(yīng)說明載體組成各部分的來源和功能，如復(fù)制子和啟動子來源，或抗生素抗性標(biāo)志物。提供至少包括構(gòu)建中所用位點的酶切圖譜。應(yīng)提供宿主細(xì)胞的資料，包括細(xì)胞株（系）名稱、來源、傳代歷史、檢定結(jié)果及基本生物學(xué)特性等。

4、 應(yīng)詳細(xì)說明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)（是否整合到染色體內(nèi)）及拷貝數(shù)。應(yīng)提供宿主和載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性資料。    2克隆基因的序列    應(yīng)提供插入基因和表達(dá)載體兩側(cè)端控制區(qū)的核苷酸序列。所有與表達(dá)有關(guān)的序列均應(yīng)詳細(xì)敘述。    3表達(dá)    應(yīng)詳細(xì)敘述在生產(chǎn)過程中，啟動和控制克隆基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)所采用的方法及表達(dá)水平。4原輔料    原輔料應(yīng)按照國家藥品監(jiān)督管理局有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。動物源性原料的使用應(yīng)提供來源及質(zhì)控檢測

5、資料；發(fā)酵用培養(yǎng)基不能添加內(nèi)酰胺類抗生素。（二）生產(chǎn)的控制    1主細(xì)胞庫（MASTERCELLBANK）    rDNA制品的生產(chǎn)應(yīng)采用種子批（SEEDLOT）系統(tǒng)。從已建立的主細(xì)胞庫中，再進(jìn)一步建立生產(chǎn)細(xì)胞庫（WCB）。    含表達(dá)載體的宿主細(xì)胞應(yīng)經(jīng)過克隆而建立主細(xì)胞庫。在此過程中，在同一實驗室工作區(qū)內(nèi)，不得同時操作兩種不同細(xì)胞（菌種）；一個工作人員亦不得同時操作兩種不同細(xì)胞或菌種。    應(yīng)詳細(xì)記述種子材料的來源、方式、保存及預(yù)計使用壽命。應(yīng)提供在保存和復(fù)蘇條件下宿

6、主載體表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性證據(jù)。采用新的種子批時，應(yīng)重新作全面檢定。真核細(xì)胞用于生產(chǎn)時，細(xì)胞的鑒別標(biāo)志，如特異性同功酶或免疫學(xué)或遺傳學(xué)特征，對鑒別所建立的種子是有用的。有關(guān)所用傳代細(xì)胞的致癌性應(yīng)有詳細(xì)報告。如采用微生物培養(yǎng)物為種子，則應(yīng)敘述其特異表型特征。    一般情況下，在原始種子階段應(yīng)確證克隆基因的DNA序列。但在某些情況下，例如傳代細(xì)胞基因組中插入多拷貝基因。在此階段不適合對克隆基因作DNA序列分析。在此情況下，可采用總細(xì)胞DNA的雜交印染分析，或作mRNA的序列分析。對最終產(chǎn)品的特征鑒定應(yīng)特別注意。    種子批不應(yīng)含有外源致癌

7、因子，不應(yīng)含有感染性外源因子，如細(xì)菌、支原體、真菌及病毒。    有些細(xì)胞株含有某些內(nèi)源病毒，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒，且不易除去。但當(dāng)已確知在原始細(xì)胞庫或載體部分中污染此類特定內(nèi)源因子時，則應(yīng)能證明在生產(chǎn)純化過程可使之滅活或清除。    2有限代次生產(chǎn)    用于培養(yǎng)和誘導(dǎo)基因產(chǎn)物的材料和方法應(yīng)有詳細(xì)資料。對培養(yǎng)過程及收獲時，應(yīng)有敏感的檢測措施控制微生物污染。    應(yīng)提供培養(yǎng)生長濃度和產(chǎn)量恒定性方面的數(shù)據(jù)，并應(yīng)確立廢棄一批培養(yǎng)物的指標(biāo)。根據(jù)宿主細(xì)胞載體系統(tǒng)的穩(wěn)定性資料，確定在生產(chǎn)過

8、程中允許的最高細(xì)胞倍增數(shù)或傳代代次，并應(yīng)提供最適培養(yǎng)條件的詳細(xì)資料。    在生產(chǎn)周期結(jié)束時，應(yīng)監(jiān)測宿主細(xì)胞載體系統(tǒng)的特性，例如質(zhì)粒拷貝數(shù)、宿主細(xì)胞中表達(dá)載體存留程度、含插入基因的載體的酶切圖譜。一般情況下，用來自一個原始細(xì)胞庫的全量培養(yǎng)物進(jìn)行監(jiān)測，必要時應(yīng)做一次目的基因的核苷酸序列分析。    3連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)    基本要求同2項。    應(yīng)提供經(jīng)長期培養(yǎng)后所表達(dá)基因的分子完整性資料，以及宿主細(xì)胞的表型和基因型特征。每批培養(yǎng)的產(chǎn)量變化應(yīng)在規(guī)定范圍內(nèi)。對可以進(jìn)行后處理及應(yīng)廢棄

9、的培養(yǎng)物，應(yīng)確定指標(biāo)。從培養(yǎng)開始至收獲，應(yīng)有敏感的檢查微生物污染的措施。    根據(jù)宿主載體穩(wěn)定性及表達(dá)產(chǎn)物的恒定性資料，應(yīng)規(guī)定連續(xù)培養(yǎng)的時間。如屬長時間連續(xù)培養(yǎng)，應(yīng)根據(jù)宿主載體穩(wěn)定性及產(chǎn)物特性的資料，在不同間隔時間作全面檢定。    4純化    對于收獲、分離和純化的方法應(yīng)詳細(xì)記述，應(yīng)特別注意污染病毒、核酸以及有害抗原性物質(zhì)的去除。    如采用親和層析技術(shù)，例如用單克隆抗體，應(yīng)有檢測可能污染此類外源性物質(zhì)的方法，不應(yīng)含有可測出的異種免疫球蛋白。  &

10、#160; 對整個純化工藝應(yīng)進(jìn)行全面研究，包括能夠去除宿主細(xì)胞蛋白、核酸、糖、病毒或其它雜質(zhì)以及在純化過程中加入的有害的化學(xué)物質(zhì)等。    關(guān)于純度的要求可視制品的用途和用法而確定，例如，僅使用一次或需反復(fù)多次使用；用于健康人群或用于重癥患者；對純度可有不同程度要求。    （三）最終產(chǎn)品的控制    應(yīng)建立有關(guān)產(chǎn)品的鑒別、純度、穩(wěn)定性和活性等方面的試驗方法。檢測的必要性和純度要求取決于多種因素：產(chǎn)品性質(zhì)和用途、生產(chǎn)和純化工藝及生產(chǎn)工藝的經(jīng)驗。一般說來下列試驗對控制產(chǎn)品質(zhì)量是可以采用的。新的分析技術(shù)及對現(xiàn)

11、有技術(shù)的改進(jìn)正在不斷進(jìn)行，適當(dāng)時應(yīng)使用這些新的技術(shù)。    1物理化學(xué)鑒定    （1）氨基酸組成    使用各種水解法和分析手段測定氨基酸的組成，并與目的蛋白基因序列推導(dǎo)的氨基酸組成或天然異構(gòu)體比較。如需要時應(yīng)考慮分子量的大小。多數(shù)情況下，氨基酸組成分析對肽段和小蛋白可提供有價值的結(jié)構(gòu)資料，但對大蛋白一般意義較小。在多數(shù)情況下，氨基酸定量分析數(shù)據(jù)可用于確定蛋白含量。    （2）氨基酸末端序列    氨基酸末端分析用于鑒別N-端和C-端氨基酸的

12、性質(zhì)和同質(zhì)性。若發(fā)現(xiàn)目的產(chǎn)品的末端氨基酸發(fā)生改變時，應(yīng)使用適當(dāng)?shù)姆治鍪侄闻卸ㄗ儺愺w的相應(yīng)變異數(shù)量。應(yīng)將這些氨基酸末端序列與來自目的產(chǎn)品基因序列推導(dǎo)的氨基酸末端序列進(jìn)行比較。    （3）肽譜    應(yīng)用合適的酶或化學(xué)試劑使所選的產(chǎn)品片段產(chǎn)生不連續(xù)多肽，應(yīng)用HPLC或其他適當(dāng)?shù)姆椒ǚ治鲈摱嚯钠巍?yīng)盡量應(yīng)用氨基酸組成分析技術(shù)，N-末端測序或質(zhì)譜法鑒別多肽片段。對批簽發(fā)來說,經(jīng)驗證的肽譜分析經(jīng)常是確證目的產(chǎn)品結(jié)構(gòu)/鑒別的適當(dāng)方法。    （4）巰基和二硫鍵    如果依據(jù)目的產(chǎn)品

13、基因序列存在半胱氨酸殘基時，應(yīng)盡可能確定巰基和/或二硫鍵的數(shù)量和位置。使用方法包括肽譜分析（還原和非還原條件下）、質(zhì)譜測定法或其他適當(dāng)?shù)姆椒ā?#160;   （5）碳水化合物結(jié)構(gòu)    應(yīng)測定糖蛋白中碳水化合物含量（中性糖、氨基糖、唾液酸）。此外盡可能分析碳水化合物的結(jié)構(gòu)、寡糖形態(tài)（長鏈狀）和多肽的糖基化位點。    （6）分子量    應(yīng)用分子篩層析法、SDS-PAGE（還原和/或非還原條件下）、質(zhì)譜測定法、和/或其他適當(dāng)技術(shù)測定分子量。    （7）

14、等電點    通過等電聚焦電泳或其他適當(dāng)?shù)姆椒y定。    （8）消光系數(shù)（或克分子吸光度）    多數(shù)情況下，可取目的產(chǎn)品于UV/可見光波長處測定消光系數(shù)（或克分子吸光度）。消光系數(shù)的測定為使用UV/可見光或分光光度計檢測已知蛋白含量的溶液，蛋白含量應(yīng)用氨基酸組成分析技術(shù)或定氮法等方法測定。    （9）電泳圖型    應(yīng)用PAGE電泳、等電聚焦、SDSPAGE電泳、免疫印跡、毛細(xì)管電泳法或其他適當(dāng)?shù)姆椒?獲得目的產(chǎn)品/藥物的一致性,同一性和純

15、度的電泳圖譜和數(shù)據(jù)。    （10）液相層析圖譜    應(yīng)用分子篩層析、反相液相層析、離子交換液相層析、親和層析或其他適當(dāng)方法，獲得目的產(chǎn)品/藥物的一致性、同一性和純度的層析圖譜和數(shù)據(jù)。    （11）光譜分析    適當(dāng)時，應(yīng)用紫外或可見光吸收光譜法測定，使用圓二色譜、核磁共振（NMR）、或其他適當(dāng)?shù)姆椒z測制品的高級結(jié)構(gòu)。    2雜質(zhì)檢測    （1）工藝相關(guān)雜質(zhì)    工藝相關(guān)雜

16、質(zhì)來源于生產(chǎn)工藝，可分三大類：來源于細(xì)胞基質(zhì)、培養(yǎng)基和下游工藝。    來源于細(xì)胞基質(zhì)的雜質(zhì)包括源于宿主生物體的蛋白/多肽；核酸（宿主細(xì)胞/載體/總DNA）；多糖及病毒。對于宿主細(xì)胞蛋白，一般應(yīng)用能檢測出較寬范圍蛋白雜質(zhì)的靈敏的免疫檢測方法。應(yīng)用不含目的基因的生物體粗提物，即不含產(chǎn)品編碼基因的生產(chǎn)用細(xì)胞，制備上述試驗使用的多克隆抗體。可通過對產(chǎn)品的直接分析方法（如雜交技術(shù)法）檢測宿主細(xì)胞的DNA水平，和/或通過標(biāo)記實驗（實驗室規(guī)模）檢測證實通過純化工藝能去除核酸。對于有意導(dǎo)入的病毒，應(yīng)驗證生產(chǎn)工藝中去除/滅活病毒的能力。    來源于

17、培養(yǎng)基的雜質(zhì)包括誘導(dǎo)劑（多核苷酸,病毒）、抗生素、血清及其他培養(yǎng)基組分。    來源于下游工藝產(chǎn)生的雜質(zhì)包括酶、化學(xué)/生化處理試劑（如溴化氰、胍、氧化劑和還原劑）、無機(jī)鹽（如重金屬、砷、非有色金屬離子）、溶劑、載體/配體（如單克隆抗體），及其他可濾過的物質(zhì)。    （2）產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)    以下為最常見的目的產(chǎn)品的分子變異體，并列出了相應(yīng)的檢測方法：    化學(xué)修飾類型：應(yīng)考慮脫酰胺、異構(gòu)化、錯配S-S連接和氧化形式的分離和鑒別。對這些變異體的分離和鑒別，可應(yīng)用層析法和/或電

18、泳法（如HPLC、毛細(xì)管電泳、質(zhì)譜法、圓二色譜）。    降解物和聚合體：聚合體包括二聚體和多聚體：可用分子篩層析法（如SE-HPLC）進(jìn)行定量；降解物：應(yīng)建立降解物的判定標(biāo)準(zhǔn)，并對穩(wěn)定性試驗產(chǎn)生的降解產(chǎn)物進(jìn)行監(jiān)測。    3生物學(xué)測定    （1）鑒別試驗    應(yīng)用免疫印跡法，或者在可能情況下，應(yīng)用參考品將rDNA制品與天然產(chǎn)品通過生物學(xué)比較試驗，確定其與天然產(chǎn)品是一致的。    （2）效價測定    采用國際或

19、國家參考品，或經(jīng)過國家檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的參考品，以體內(nèi)或體外法測定制品的生物學(xué)活性，并標(biāo)明其活性單位。    （3）特異比活性測定    在測定生物學(xué)活性的基礎(chǔ)上，對有些制品還應(yīng)用適當(dāng)方法測定主藥蛋白含量，測定其特異比活性，以活性單位重量表示。    （4）熱原質(zhì)試驗    應(yīng)采用家兔法或鱟試驗法（LAL）作熱原質(zhì)檢測，控制標(biāo)準(zhǔn)可參照天然制品的要求。    （5）無菌試驗    參照現(xiàn)行版中國藥典有關(guān)規(guī)定進(jìn)行，應(yīng)證實最終制品無細(xì)菌污染。    （6）抗原性物質(zhì)檢查    必要時，如制品屬大劑量反復(fù)使用者，應(yīng)測定最終制品中可能存在的抗原性物質(zhì)，如宿主細(xì)胞、亞細(xì)胞組分及培養(yǎng)基成份等?；颊叻磸?fù)接受大劑量的這類制品時，應(yīng)密切監(jiān)測由這些抗原可能產(chǎn)生的抗體或變態(tài)反應(yīng)。    （7）異常毒性試驗    可參照現(xiàn)行版中國藥典有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。    4其他    根據(jù)產(chǎn)品劑型，應(yīng)有外觀（如固體、液體、色澤、澄明度等方面的描述）、水分