陜北地區(qū)馬鈴薯卷葉病毒的RT-PCR檢測與序列分析

1、    陜北地區(qū)馬鈴薯卷葉病毒的rtpcr檢測與序列分析    馮光惠+杜虎平+李夏隆+亢福仁摘要：以陜北8個縣（區(qū)）種植23代疑似帶毒的馬鈴薯葉片為材料，用trizol法提取馬鈴薯葉片總rna，以已公布的馬鈴薯卷葉病毒外殼蛋白（cp）基因序列設計特異引物，通過rt-pcr擴增目的dna片段，對cp基因進行克隆和測序，采用dnastar軟件分析序列的一致性。結(jié)果表明，從陜北8個縣（區(qū)）馬鈴薯葉片中均擴增到與預期大小一致、長度為336 bp的目的片段，說明馬鈴薯均感染了卷葉病毒。陜北8個縣（區(qū)）馬鈴薯卷葉病毒cp基因之間的序列一致性達99.6%以上，與國內(nèi)

2、外其他地區(qū)10個樣品cp基因的序列一致性為96.2%99.8%，表明馬鈴薯卷葉病毒的cp基因序列比較保守。關鍵詞：馬鈴薯卷葉病毒；cp基因；rt-pcr檢測；序列分析：s435.32 ：a ：0439-8114（2014）19-4734-03doi：10.14088/ki.issn0439-8114.2014.19.060rt-pcr detection and cp gene sequence analysis of potato leaf roll virus in northern shaanxi provincefeng guang-hui，du hu-ping，li xia-long

3、，kang fu-ren（college of life science，yulin university， yulin 719000，shaanxi，china）abstract： taking 2-3 generations of suspected poisonous potato leaf planted in eight counties （districts） of northern shaanxi province as materials， the total rna was extracted from potato leaves by trizol method. spec

4、ific primers were published coat protein（cp） gene sequence of potato leaf roll virus. the dna fragment was amplified by rt-pcr. then the cp gene was cloned and sequenced. sequence identity was analyzed by dnastar software. the results showed that the gene sequence amplified from potato leaves from 8

5、 counties in northern shaanxi area were consistent with the expected size with length of 336 bp. these potatoes were all infected with potato leaf roll virus. the cp gene sequence identity between potato leaf roll virus in 8 counties （districts） of northern shaanxi was more than 99.6%. 10 samples of

6、 cp gene sequences from other regions at home and abroad had identity ranged from 96.2% to 99.8%. it is indicated that the cp gene of potato leaf roll virus is more conservative.key words： potato leaf roll virus； cp gene； rt-pcr detection； sequence analysis馬鈴薯卷葉病毒（potato leaf roll virus，plrv）是馬鈴薯主要的

7、病毒之一，分布于世界各地馬鈴薯種植區(qū)。卷葉病毒可通過種薯、蚜蟲或嫁接傳播，感染卷葉病毒會造成馬鈴薯減產(chǎn)30%90%1。近年來，脫毒馬鈴薯在全國各地大面積推廣，但隨著脫毒種薯種植代（年）數(shù)的增加，病毒在植株體內(nèi)不斷積累和傳播，導致馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)逐漸下降，而且還會感染其他種類的病毒和類病毒。因此，及時、準確地檢測田間種植馬鈴薯的帶毒情況，采用莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒法、熱處理法、抗病毒藥劑法等2脫毒技術控制病毒的蔓延，可為脫毒馬鈴薯的推廣種植奠定基礎。檢測馬鈴薯病毒常用的方法有雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（das-elisa）、反轉(zhuǎn)錄pcr法（rt-pcr）和實時熒光定量pcr法。das-elisa法操

8、作簡單、實用性強，準確度較高，但檢測病毒含量較低的馬鈴薯時，靈敏度和準確度不高，會出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。rt-pcr檢測技術在病毒含量極低時也可以快速檢測馬鈴薯病毒，該方法具有靈敏、快速、準確度高、特異性強等優(yōu)點，適用于馬鈴薯3、葡萄4等其他植物病毒的檢測。在rt-pcr檢測技術基礎上，研究者應用多重rt-pcr對馬鈴薯多種病毒同時進行檢測5-7。隨著實時熒光定量pcr技術的發(fā)展，bright等8利用該方法檢測了馬鈴薯pvx、pvy、pva和plrv 4種病毒；sheila等9采用該方法檢測了pvx、pvs、tswv和plrv 4種病毒。多重rt-pcr和實時熒光定量pcr方法大大提高了馬鈴薯病毒的

9、檢測效率，并逐漸應用到其他植物、動物病毒以及微生物的檢測上，但多重rt-pcr和熒光定量pcr方法易出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象10，11。國內(nèi)研究者采用rt-pcr方法檢測了不同地區(qū)的馬鈴薯卷葉病毒12-14，但尚未見用rt-pcr法檢測和分析陜北地區(qū)馬鈴薯卷葉病毒的報道。因此，本試驗以陜北8個縣（區(qū)）種植23代的疑似帶毒馬鈴薯為研究對象，采用rt-pcr方法檢測該地區(qū)的馬鈴薯卷葉病毒，并對馬鈴薯卷葉病毒的外殼蛋白（coat protein，cp）基因序列進行分析，從而掌握病毒的變異程度，以期為脫毒馬鈴薯的種薯繁育和推廣種植提供依據(jù)。 1 材料與方法1.1 材料1.1.1 樣品的采集 于2013年7-10

10、月在馬鈴薯生長盛期至成熟期，采集馬鈴薯疑似帶病毒植株葉片，常溫下保存于保濕組織培養(yǎng)瓶中，4 冰箱保存。供試馬鈴薯的具體情況見表1。1.1.2 儀器與試劑 主要儀器有pcr儀（朗基，杭州朗基科學儀器有限公司）、電泳儀、分光光度計、凝膠成像系統(tǒng)（bio-rad，美國伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品上海有限公司）。trizol試劑、cdna合成試劑盒、dna膠回收試劑盒、pgem-teasy載體、taq dna聚合酶、dntp、10×buffer均購自北京全式金生物科技有限公司。1.1.3 引物設計 根據(jù)genbank數(shù)據(jù)庫中登錄的馬鈴薯卷葉病毒cp基因序列，利用引物設計軟件primer 5設計1對特異引

11、物，上游引物為5-cgcgctaacagagttcagcc-3，下游引物為5-gcaatgggggtccaactcat-3。預期擴增片段長度為336 bp，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，將其用滅菌te（ph 8.0）稀釋至濃度為10 mol/l。1.2 方法1.2.1 馬鈴薯卷葉病毒的rt-pcr檢測1）馬鈴薯總rna的提取。采用trizol法參照文獻15的方法進行，略做改動。稱取0.1 g馬鈴薯葉片在研缽中用液氮研磨，取1.5 ml離心管加入1 ml trizol，將研磨液與trizol溶液混合均勻；4 、12 000 r/min離心15 min；轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中，加入0.2

12、 ml氯仿，渦旋混勻，室溫放置5 min，4 、12 000 r/min離心15 min；取上清液（水相）于另一離心管中，按上清液體積分別加入1/2體積的異戊醇、0.8 mol/l檸檬酸鈉和1.2 mol/l氯化鈉，混合均勻，室溫放置510 min，4 、12 000 r/min離心8 min，棄上清液，用1 ml 75%乙醇洗滌沉淀2次，4 、12 000 r/min離心15 min，小心倒掉乙醇，室溫自然干燥后溶于用depc處理過的ddh2o，于-80 條件下保存。2）cdna的合成。按照cdna合成試劑盒說明書操作，對提取的馬鈴薯葉片總rna進行反轉(zhuǎn)錄。具體反應體系如下：馬鈴薯總rna

13、5 l，anchored oligo（dt）18（0.5 g/l） 1 l，2×es reaction mix 10 l，easyscript rt enzyme mix 1 l，加rnase-free water至20 l?；靹蚝?，水浴鍋中42 孵育30 min，pcr儀中85 條件下加熱失活5 min。3）pcr反應及產(chǎn)物檢測。pcr反應體系：cdna 3 l，上游引物1 l，下游引物1 l，10×buffer 5 l，2.5 mmol/l dntps 4 l，taq dna聚合酶1 l，加ddh2o至50 l。pcr反應程序：94 5 min；94 30 s，60 3

14、0 s，72 30 s，35個循環(huán)；72 10 min。取6 l pcr擴增產(chǎn)物與1 l loading buffer混勻，用15 g/l瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr產(chǎn)物，于凝膠成像系統(tǒng)中照相。1.2.2 cp基因的克隆及序列分析 用dna膠回收試劑盒回收純化pcr產(chǎn)物，將其與pgem-teasy載體連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌trans1-t1感受態(tài)細胞，在加有iptg和x-gal的lb平板上篩選白色菌落，于lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用堿裂解法提取質(zhì)粒，采用ecor和hind 限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒進行鑒定。將含目的條帶的陽性重組質(zhì)粒送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。用dnastar軟件分析cp基因的序

15、列相似性，并與genbank中搜索的國內(nèi)外10個不同地區(qū)的馬鈴薯卷葉病毒cp基因（表2）進行序列相似性分析。2 結(jié)果與分析2.1 馬鈴薯卷葉病毒cp基因的rt-pcr檢測對采自陜北8個縣（區(qū)）馬鈴薯葉片所含病毒cp基因的rt-pcr產(chǎn)物進行檢測，結(jié)果如圖1所示，這8個樣品均能擴增出預期長度為336 bp的目的條帶，表明8個采樣點的馬鈴薯植株均感染了卷葉病毒。2.2 馬鈴薯卷葉病毒cp基因的序列一致性分析用dnastar軟件對馬鈴薯卷葉病毒cp基因序列進行分析，結(jié)果表明，陜北8個縣（區(qū)）卷葉病毒 cp基因之間的一致性達到99.6%以上，序列之間變異率很低。以榆陽區(qū)馬合鎮(zhèn)的馬鈴薯卷葉病毒cp基因為

16、對照（ck），與國內(nèi)外其他地區(qū)10個馬鈴薯樣品cp基因的序列一致性為96.2%99.8%（表3），表明馬鈴薯卷葉病毒的cp基因序列比較保守，不易發(fā)生變異。3 討論本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，陜北8個縣（區(qū)）最近幾年都在推廣種植脫毒馬鈴薯，但一級脫毒種薯種植23年后，馬鈴薯葉片開始出現(xiàn)卷曲、小葉、花葉、皺縮等癥狀，薯塊性狀發(fā)生變化，產(chǎn)量也呈下降趨勢，說明馬鈴薯卷葉病毒等單一病毒或各種復合病毒感染了馬鈴薯。可能是對馬鈴薯脫毒苗及各級種薯的檢驗、檢疫、監(jiān)督不夠嚴或者蚜蟲通過汁液傳播使馬鈴薯感染病毒。rt-pcr分子檢測技術可快速、準確地檢測馬鈴薯的帶毒情況，是近年來國內(nèi)外應用較為普遍的病毒檢測技術。在普通rt-

17、pcr體系中，只要提取的馬鈴薯總rna質(zhì)量高，在檢測不同種類的病毒和類病毒時，設計不同的特異引物，就能擴增出預期的目的條帶，不會發(fā)生假陰性現(xiàn)象，檢測效果好。另外，在用rt-pcr檢測常見的6種病毒pvx、pvy、pvs、pva、pvm和plrv以及類病毒pstvd時，可通過改變pcr反應體系中的溫度，實現(xiàn)多種病毒的同步檢測。 通過克隆測序，可了解馬鈴薯病毒的變異程度。馬鈴薯不同病毒的變異也有差異，本試驗研究表明，陜北8縣（區(qū)）馬鈴薯卷葉病毒cp基因序列的一致性在99.6%以上，而同地區(qū)馬鈴薯x病毒cp基因序列的一致性卻在95.2%99.4%。病毒變異率高低以及不同病毒變異率差異大小對馬鈴薯的產(chǎn)

18、量和品種有何影響，有待進一步研究。參考文獻：1 路 平，王 蒂，司懷軍.馬鈴薯卷葉病毒的rt-pcr快速檢測j.甘肅農(nóng)業(yè)大學學報，2005，40（4）：532-534.2 李鳳云.馬鈴薯莖尖脫毒效果影響因素的研究j.中國馬鈴薯，2008，22（4）：201-204.3 吳興泉，時 妍，楊慶東，等.馬鈴薯病毒的rt-pcr檢測技術評述j.中國馬鈴薯，2011，25（4）：251-254.4 王建輝，劉建軍，陳克玲，等.三種葡萄病毒的rt-pcr檢測和系統(tǒng)進化分析j.果樹學報，2013，30（2）：197-201.5 nie x，singh r p. a novel usage of random

19、 primers for multiplex rt-pcr detection of virus and viroid in aphids，leaves，and tubersj. journal of virological methods，2001，91（1）：37-49.6 王中康，夏玉先，袁 青，等.馬鈴薯種苗復合感染病毒多重rt-pcr同步快速檢測j.植物病理學報，2005，35（2）：109-115.7 董代幸，張祥林，羅 明，等.馬鈴薯病毒一步法多重rt-pcr檢測技術的構建j.微生物學通報，2011，38（1）：131-137.8 bright o a，patrick j s，p

20、hilip h b. simultaneous dection of potato viruses，plrv，pva，pvx and pvy from dormant potato tubers by tanman real-time rt-pcrj.journal of virological methods，2007，142（1-2）：1-9.9 sheila m m，michael g k，roger a c. a single tube，quantitative real-time rt-pcr assay that detects four potato viruses simult

21、aneouslyj. journal of virological methods，2009，161（2）：289-296.10 gambino g，gnbaudo i.simultaneous detection of nine grapevine viruses by multiplex rt-pcr with coamplification of a plant rna as internal controlj.virology，2006，96（11）：1223-1229.11 牛建新，馬兵鋼，何 梅，等.庫爾勒香梨主要病毒多重rt-pcr檢測技術研究j.植物病理學報，2006，36（1

22、）：12-21.12 丁 銘，方 琦，李婷婷，等.馬鈴薯卷葉病毒云南分離物外殼蛋白基因的克隆與序列分析j. 植物病理學報，2006，36（5）：473-476.13 吳興泉，譚曉榮，陳士華，等.馬鈴薯卷葉病毒福建分離物的基因克隆與序列分析j.河南農(nóng)業(yè)大學學報，2006，40（4）：391-393.14 周 云，楊永智，王 艦.青海省馬鈴薯卷葉病毒的rt-pcr法檢測j.西北農(nóng)業(yè)學報，2007，16（6）：210-211.15 courtney e j，amy o c，david k w. evaluation of isolation methods and rna integrity for

23、 bacterial rna quantitationj. journal of microbiological methods，2008，75（2）：318-324. 通過克隆測序，可了解馬鈴薯病毒的變異程度。馬鈴薯不同病毒的變異也有差異，本試驗研究表明，陜北8縣（區(qū)）馬鈴薯卷葉病毒cp基因序列的一致性在99.6%以上，而同地區(qū)馬鈴薯x病毒cp基因序列的一致性卻在95.2%99.4%。病毒變異率高低以及不同病毒變異率差異大小對馬鈴薯的產(chǎn)量和品種有何影響，有待進一步研究。參考文獻：1 路 平，王 蒂，司懷軍.馬鈴薯卷葉病毒的rt-pcr快速檢測j.甘肅農(nóng)業(yè)大學學報，2005，40（4）：532

24、-534.2 李鳳云.馬鈴薯莖尖脫毒效果影響因素的研究j.中國馬鈴薯，2008，22（4）：201-204.3 吳興泉，時 妍，楊慶東，等.馬鈴薯病毒的rt-pcr檢測技術評述j.中國馬鈴薯，2011，25（4）：251-254.4 王建輝，劉建軍，陳克玲，等.三種葡萄病毒的rt-pcr檢測和系統(tǒng)進化分析j.果樹學報，2013，30（2）：197-201.5 nie x，singh r p. a novel usage of random primers for multiplex rt-pcr detection of virus and viroid in aphids，leaves，an

25、d tubersj. journal of virological methods，2001，91（1）：37-49.6 王中康，夏玉先，袁 青，等.馬鈴薯種苗復合感染病毒多重rt-pcr同步快速檢測j.植物病理學報，2005，35（2）：109-115.7 董代幸，張祥林，羅 明，等.馬鈴薯病毒一步法多重rt-pcr檢測技術的構建j.微生物學通報，2011，38（1）：131-137.8 bright o a，patrick j s，philip h b. simultaneous dection of potato viruses，plrv，pva，pvx and pvy from dor

26、mant potato tubers by tanman real-time rt-pcrj.journal of virological methods，2007，142（1-2）：1-9.9 sheila m m，michael g k，roger a c. a single tube，quantitative real-time rt-pcr assay that detects four potato viruses simultaneouslyj. journal of virological methods，2009，161（2）：289-296.10 gambino g，gnba

27、udo i.simultaneous detection of nine grapevine viruses by multiplex rt-pcr with coamplification of a plant rna as internal controlj.virology，2006，96（11）：1223-1229.11 牛建新，馬兵鋼，何 梅，等.庫爾勒香梨主要病毒多重rt-pcr檢測技術研究j.植物病理學報，2006，36（1）：12-21.12 丁 銘，方 琦，李婷婷，等.馬鈴薯卷葉病毒云南分離物外殼蛋白基因的克隆與序列分析j. 植物病理學報，2006，36（5）：473-476

28、.13 吳興泉，譚曉榮，陳士華，等.馬鈴薯卷葉病毒福建分離物的基因克隆與序列分析j.河南農(nóng)業(yè)大學學報，2006，40（4）：391-393.14 周 云，楊永智，王 艦.青海省馬鈴薯卷葉病毒的rt-pcr法檢測j.西北農(nóng)業(yè)學報，2007，16（6）：210-211.15 courtney e j，amy o c，david k w. evaluation of isolation methods and rna integrity for bacterial rna quantitationj. journal of microbiological methods，2008，75（2）：318

29、-324. 通過克隆測序，可了解馬鈴薯病毒的變異程度。馬鈴薯不同病毒的變異也有差異，本試驗研究表明，陜北8縣（區(qū)）馬鈴薯卷葉病毒cp基因序列的一致性在99.6%以上，而同地區(qū)馬鈴薯x病毒cp基因序列的一致性卻在95.2%99.4%。病毒變異率高低以及不同病毒變異率差異大小對馬鈴薯的產(chǎn)量和品種有何影響，有待進一步研究。參考文獻：1 路 平，王 蒂，司懷軍.馬鈴薯卷葉病毒的rt-pcr快速檢測j.甘肅農(nóng)業(yè)大學學報，2005，40（4）：532-534.2 李鳳云.馬鈴薯莖尖脫毒效果影響因素的研究j.中國馬鈴薯，2008，22（4）：201-204.3 吳興泉，時 妍，楊慶東，等.馬鈴薯病毒的rt-

30、pcr檢測技術評述j.中國馬鈴薯，2011，25（4）：251-254.4 王建輝，劉建軍，陳克玲，等.三種葡萄病毒的rt-pcr檢測和系統(tǒng)進化分析j.果樹學報，2013，30（2）：197-201.5 nie x，singh r p. a novel usage of random primers for multiplex rt-pcr detection of virus and viroid in aphids，leaves，and tubersj. journal of virological methods，2001，91（1）：37-49.6 王中康，夏玉先，袁 青，等.馬鈴薯種苗復合感染病毒多重rt-pcr同步快速檢測j.植物病理學報，2005，35（2）：109-115.7 董代幸，張祥林，羅 明，等.馬鈴薯病毒一步法多重rt-pcr檢測技術的構建j.微生物學通報，2011，38（1）：131-137.8 bright o a，patrick j s，philip h b. simultaneous dection of potato viruses，plrv，pva，pvx and pvy from dormant potato tubers by tanman real-time rt-pcrj.journal of viro