PCR基因擴(kuò)增儀.PPT

1、1 PCRPCR基因擴(kuò)增儀基因擴(kuò)增儀 (PCR Gene Amplifier) 環(huán)境科學(xué)與工程環(huán)境科學(xué)與工程 余曉玲余曉玲2內(nèi)容提要1. PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理 PCR技術(shù)的原理及發(fā)展 PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理 2. PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu) 定性PCR擴(kuò)增儀實時熒光定量PCR擴(kuò)增儀 3. PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)、操作規(guī)程 PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)PCR擴(kuò)增儀的操作規(guī)程 4. PCR擴(kuò)增儀的應(yīng)用3第一節(jié) PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理 一、PCR技術(shù)的發(fā)展FKhorana (1971)等最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可合

2、成tRNA基因?！盕1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。Mullis要合成DNA引物來進(jìn)行測序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。F1983年4月的一個星期五晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上,猛然閃現(xiàn)出“多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”的想法。F1985年10月25日申請了PCR的專利，1987年7月28日批準(zhǔn)（專利號4,683,202 ），Mullis是第一發(fā)明人；F1985年12月20日在Science雜志上發(fā)表了第一篇PCR的學(xué)術(shù)論文，Mullis是共同作者；F1986年5月，Mullis在冷泉港實驗室做專題報告，全世界從此開始學(xué)習(xí)PCR的方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（P

3、CR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進(jìn)行比對。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在。4第一節(jié) PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理F二、PCR技術(shù)的原理F體外核酸擴(kuò)增，加熱使雙鏈DNA解開螺旋，在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交，在Taq DNA聚合酶，dNTPs(脫氧核糖核苷三磷酸)，Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物，重復(fù) “變性退火引物延伸”過程至2

4、5-40個循環(huán)，呈指數(shù)級擴(kuò)大待測樣本中的核酸拷貝數(shù)。F簡單的說，PCR儀就是利用DNA聚合酶對特定基因做體外或試管內(nèi)的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶進(jìn)行專一性的連鎖復(fù)制。目前常用的技術(shù)，可以將一段基因復(fù)制為原來的一百億至一千億倍。5第一節(jié) PCR基因擴(kuò)增儀的基因擴(kuò)增儀的工作原理工作原理模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；DNA模板與引物結(jié)合物在TaqD

5、NA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍6第一節(jié) PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理PCR基因擴(kuò)增儀的工作關(guān)鍵 DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。 從PCR反應(yīng)基本原理可以看出，PCR基因擴(kuò)增儀工作關(guān)鍵是溫度控制。 7第一節(jié) PCR基因擴(kuò)增基因擴(kuò)增儀的工作原理

6、儀的工作原理8第二節(jié) PCR擴(kuò)增儀的擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)分類與結(jié)構(gòu)9第二節(jié) PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)F熒光實時定量熒光實時定量PCR（real-time quantitative PCR,RQ-PCR）技術(shù)）技術(shù)F在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的熒光染料或探針 F 熒光信號的變化真實地反映了體系中模板的增加F通過檢測熒光信號，從而實時監(jiān)測整個PCR反應(yīng)過程F最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析10第二節(jié) PCR擴(kuò)增儀的擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)分類與結(jié)構(gòu)實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR儀儀 金屬板式實時定量金屬板式實時定量PCRPCR儀儀 離心式實時定量離心式實時定量PCRPCR儀儀 各孔獨立控溫的

7、定量各孔獨立控溫的定量PCRPCR儀儀 11第二節(jié) PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)金屬板式實時定量PCR儀 F可作為普通PCR儀使用F可帶梯度功能F可容納的樣本量大，無需特殊耗材F溫度均一性欠佳，有邊緣效應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)條件難以做到與樣品完全一致 12第二節(jié) PCR擴(kuò)增儀的分類與擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)ABI 7500熒光定量熒光定量PCR儀儀 MJ公司公司Chromo 4熒光定量熒光定量PCR儀儀 Bio-rad公司公司iCycler熒光定量熒光定量PCR儀儀 13第二節(jié) PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)離心式實時定量PCR儀 F溫度均一性較好F使用的是同一個激發(fā)光源和檢測器，隨時檢測旋轉(zhuǎn)到跟前的樣品，有

8、效減少系統(tǒng)誤差F可容納樣品量少，有的需用特殊毛細(xì)管作樣品管，增加了使用成本，也不帶梯度功能 14第二節(jié) PCR擴(kuò)增儀的分類與擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)Rotor-Gene 3000熒光定量熒光定量PCR儀儀 Light CycleTM熒光定量熒光定量PCR儀儀 15第二節(jié) PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)各孔獨立控溫的定量PCR儀F不同樣品槽分別擁有獨立的智能升降溫模塊，各孔獨立控溫，適合多指標(biāo)快速檢測。FSmartCycler的軟件允許一臺儀器同時操作六個樣品模塊，既滿足高速批量要求，又能靈活運用，還可實現(xiàn)任意梯度反應(yīng)。FSmartCycler上樣不如傳統(tǒng)方法方便，而且需要獨特的扁平反應(yīng)管，使用成本較高

9、。16第二節(jié) PCR擴(kuò)增儀的分類與擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)SmartCycler熒光定量熒光定量PCR儀儀 17第三節(jié)第三節(jié) PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)、擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)、操作規(guī)程及常見故障的排除操作規(guī)程及常見故障的排除 一、一、PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)擴(kuò)增儀的性能指標(biāo) 18（二）熒光檢測系統(tǒng)（二）熒光檢測系統(tǒng) 激發(fā)光源激發(fā)光源 檢測器檢測器 發(fā)光二極管發(fā)光二極管 鹵鎢燈光源鹵鎢燈光源 超低溫超低溫CCD 光電倍增管光電倍增管 19第三節(jié) PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)、操作規(guī)程 （三）軟件J簡便的人性化設(shè)計最能滿足其需求。J新型的PCR儀很注重程序編寫的簡易性，易學(xué)易用J具有實時信息顯示、記憶存儲多個程序、自動倒記時、自動斷電保護(hù)等功能，很多還可以免費升級。 20（四）其他J多樣化樣品基座設(shè)計、熱蓋等都使PCR儀越來越人性化。 第三節(jié) PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)、操作規(guī)程 21第三節(jié) PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)、操作規(guī)程 二、PCR擴(kuò)增儀的操作規(guī)程J普通PCR擴(kuò)增儀的操作非常簡便，接通電源，儀器自檢，設(shè)置溫度程序或調(diào)出儲存的程序運行即可。J定量