激光共聚焦顯微鏡原理和操作（課堂PPT）

1、1激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 樣品要求樣品要求 原理原理 功能功能 在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用The techniques and application of Confocal Laser Scanning Microscopy3激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)人眼分辨率：人眼分辨率：0.2mm光學(xué)顯微鏡分辨率：光學(xué)顯微鏡分辨率：0.25m25mm電子顯微鏡分辨率：電子顯微鏡分辨率：0.2nm共焦顯微鏡分辨率：共焦顯微鏡分辨率：0.18m mm4 二、二、 原理原理激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共

2、焦顯微鏡技術(shù)5原理小結(jié)原理小結(jié):Confocal 利用放置在光源后的利用放置在光源后的照明針孔照明針孔和放置在檢測和放置在檢測器前的器前的探測針孔探測針孔實現(xiàn)實現(xiàn)點點照明照明和和點點探測探測，來自光源的光通過照，來自光源的光通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點上，該點所發(fā)明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點上，該點所發(fā)射的熒光成像在探測針孔上，該點以外的任何發(fā)射光均被探射的熒光成像在探測針孔上，該點以外的任何發(fā)射光均被探測針孔阻擋。測針孔阻擋。照明針孔照明針孔與與探測針孔探測針孔對對被照射點被照射點或或被探測點被探測點來來說是說是共軛共軛的，因此被探測點即共焦點，被探測點所在的平

3、面的，因此被探測點即共焦點，被探測點所在的平面即共焦平面。計算機以像點的方式將被探測點顯示在計算機即共焦平面。計算機以像點的方式將被探測點顯示在計算機屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像共焦圖像。只要載。只要載物臺沿著物臺沿著Z軸上下移動，將樣品新的一個層面移動到共焦平軸上下移動，將樣品新的一個層面移動到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷移軸的不斷移動，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像

4、動，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像 。激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)6激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)7激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)8激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別區(qū)別1.抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像9激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別區(qū)別2. 具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學(xué)切片具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學(xué)切片conventionalconfocal10激光掃描共焦顯微

5、鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別區(qū)別3. 增加側(cè)向分辨率增加側(cè)向分辨率d2alconventionconfocaldd11激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別區(qū)別4. 由于點對點掃描去除了雜散光的影響由于點對點掃描去除了雜散光的影響12激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)三三. 激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計特點激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計特點:1.點照明點照明2.具有照明具有照明pinhole和探測和探測pinhole3.照明照明pinhole和探測和探測pinhole共軛共軛(共焦

6、共焦), 共焦點即共焦點即被探測點，被探測點所在的平面為共焦平面被探測點，被探測點所在的平面為共焦平面4.具有掃描系統(tǒng)具有掃描系統(tǒng) 逐點掃描成像逐點掃描成像 5.具有多個（四個）具有多個（四個） 熒光通道，可同時探測多個熒光通道，可同時探測多個被標記物被標記物 13激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 技術(shù)指標（技術(shù)指標（Leica TCS SP2) : 1. xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x 傳統(tǒng)顯微鏡傳統(tǒng)顯微鏡: Rxy=0.61 /NA （0.25 m mm ) Confocal: Rxy=0.4 /NA（0.18 m mm )2. 樣品的最大厚度樣品的最大厚

7、度: 取決于取決于: 物鏡的物鏡的NA、物鏡的、物鏡的工作距離工作距離 激光的穿透力、樣品的透明度激光的穿透力、樣品的透明度 Z軸的最大移動范圍軸的最大移動范圍(166m mm、Z-wide)3. 樣品的最小光切厚度樣品的最小光切厚度: (載物臺最小移動距離為載物臺最小移動距離為40nm） 取決于取決于: 物鏡的物鏡的NA、針孔大小、針孔大小 Z軸的最小移動步距軸的最小移動步距: 40nm Z軸的分辨率軸的分辨率: 0.35 m mm 14激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)4. 激光器激光器 Ar激光器激光器: 458nm, 476nm, 488nm, 514nm GreNe : 5

8、43nm; HeNe: 633nm Ar激光器激光器(UV): 361nm 激光器的特點激光器的特點: 1) 方向性好方向性好: 激光基本延直線傳播激光基本延直線傳播 2) 單色性好單色性好 :=10-8nm 3) 高亮度高亮度: 激光方向性好激光方向性好, 其在空間上的能量分布是高度其在空間上的能量分布是高度 集中的。集中的。 4) 偏振性偏振性: 激光為平面偏振光激光為平面偏振光, 光纖耦合光纖耦合15激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)5. 四個熒光通道四個熒光通道, 一個透射光通道一個透射光通道 即除了可同時采集多標記熒光圖像外即除了可同時采集多標記熒光圖像外還可以同時采集透射

9、光圖像還可以同時采集透射光圖像,但透射光但透射光圖像為圖像為非共焦圖像非共焦圖像。16激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)6.掃描速度掃描速度: slow 220lines/s 512 512 2-3秒秒 slow2 440lines/s（2：雙向掃描）：雙向掃描） medium 450lines/s 512 512 1.7秒秒 medium2 900lines/s fast 1000lines/s 512 512 0.7秒秒 128 128 0.2秒秒 fast2 2000lines/s7. 掃描密度掃描密度: 64 64 128 128 512 512 1024 1024 2048

10、 2048 激光掃描共焦顯微鏡激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用The application of Confocal Laser Scanning Microscopy18激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 功能功能.1.多熒光標記樣品的高清晰度、高分辨率圖像采集多熒光標記樣品的高清晰度、高分辨率圖像采集2.無損傷、連續(xù)光學(xué)切片，顯微無損傷、連續(xù)光學(xué)切片，顯微“CT”3.真正的三維重組真正的三維重組4.假三維圖的顯示假三維圖的顯示5.可沿可沿Z軸（軸（xy平面）和平面）和Y軸（軸（xz平面）方向進行光切平面）方向進行光切6.定量分析定量分析7.時間序列掃描時間序列掃描: xyt

11、 、xyzt 和和 xt 掃描掃描8.圖像處理圖像處理9. 旋轉(zhuǎn)掃描旋轉(zhuǎn)掃描10.感興趣區(qū)域掃描感興趣區(qū)域掃描11.光譜掃描光譜掃描 19激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用應(yīng)用應(yīng)用 定位、定量定位、定量 三維重組三維重組 動態(tài)測量動態(tài)測量 活細胞或組織內(nèi)游離活細胞或組織內(nèi)游離Ca2+分布和濃度的變化分布和濃度的變化 測量測量 (Mg2+ 、Zn+ 、Na+ 、K+) 自由基的檢測自由基的檢測 藥物進入細胞的動態(tài)過程、定位分布及定量藥物進入細胞的動態(tài)過程、定位分布及定量 蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位20激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 活細胞內(nèi)活細胞內(nèi)H+濃度（濃度（ pH值值

12、）的測量）的測量 線粒體線粒體膜電位膜電位的測量的測量 熒光漂白恢復(fù)（熒光漂白恢復(fù)（FRAP）的測量）的測量 籠鎖解籠鎖的測量籠鎖解籠鎖的測量 熒光能量共振轉(zhuǎn)移（熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）的測量）的測量 其他應(yīng)用其他應(yīng)用21激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用一、定位、定量一、定位、定量 免疫熒光標記（單標、雙標或三免疫熒光標記（單標、雙標或三 標）的定位、標）的定位、定量：如：細胞膜受體或抗原的分布，定量：如：細胞膜受體或抗原的分布， 微絲、微管的分布、微絲、微管的分布、 兩種或三種蛋兩種或三種蛋 白的白的共存共存與與共定位共定位、蛋白與細胞器的、蛋白與細胞器的 共定位、核轉(zhuǎn)錄因子

13、轉(zhuǎn)位和干細胞的共定位、核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位和干細胞的 增值、分化增值、分化 細胞凋亡細胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI 末端原位雜交末端原位雜交-fitc + PI 熒光原位雜交：熒光原位雜交： 染色體基因定位染色體基因定位 22激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 定位、定量研究中常用熒光探針定位、定量研究中常用熒光探針1.Amine-Reactive Probes 與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標記等耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標

14、記等 Green Red Fura-red FITC 494/518 TRITC 544/572 Cy5 650/690 (異硫氰基熒光素異硫氰基熒光素) (四甲基異硫氰基羅丹明四甲基異硫氰基羅丹明)Alexa Fluor 488 488/530 PE 565/578 (藻紅蛋白藻紅蛋白) Texas Red 595/615 (德州紅德州紅) Cy3 558/568BODIPY FL 503/512 BODIPY TMR 543/569 BODIPY TR 592/61823激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用1)細胞表面抗原、胞內(nèi)某種蛋白細胞表面抗原、胞內(nèi)某種蛋白 免役熒光標記：免役

15、熒光標記： 與抗體耦聯(lián)與抗體耦聯(lián), 直標直標: 一抗一抗+熒光探針熒光探針 間標間標: 二抗二抗+熒光探針熒光探針 如如: 微管蛋白微管蛋白tublin ( 抗抗 tublin抗體抗體+熒光探針熒光探針) 肌動蛋白肌動蛋白actin ( Palloidine+熒光探針熒光探針)2)細胞膜表面受體細胞膜表面受體配體配體+熒光探針熒光探針 如如: nAchR、mAchR、多巴胺受體、多巴胺受體(D1,D2) 標記標記 Gm1: 霍亂毒素受體霍亂毒素受體 霍亂毒素霍亂毒素+FITC 24激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用2.標記標記細胞器細胞器熒光探針熒光探針1)線粒體線粒體 Mitoch

16、ondria Rodamin 123 505/534 ，可染活細胞，陽離子，可染活細胞，陽離子, 可檢可檢 測線粒體膜電位測線粒體膜電位, 且在多數(shù)細胞中停留且在多數(shù)細胞中停留 時間短時間短 JC1 線粒體膜電位低時為單體線粒體膜電位低時為單體 490/527 發(fā)綠光發(fā)綠光 線粒體膜電位高時為多聚體線粒體膜電位高時為多聚體 490/590 發(fā)紅光發(fā)紅光 可標記活細胞線粒體，且為檢測線粒體膜電位最可標記活細胞線粒體，且為檢測線粒體膜電位最 佳探針佳探針Mitotracker Green FM 490/516, 染活細胞或固定細胞染活細胞或固定細胞 , 穩(wěn)定不漏出穩(wěn)定不漏出Mitotracker

17、Orange CMTMRos 551/576, (氧化型氧化型)Mitotracker Orange 還原型還原型, 只能染活細胞只能染活細胞 25激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用2)溶酶體溶酶體 Lysosome 中性紅中性紅 541/640: 微偏堿性微偏堿性, 可標記溶酶體等酸性器官可標記溶酶體等酸性器官 為非特異性為非特異性 AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活細胞染活細胞 LysoTracker Blue LysoTracker Red3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500:

18、非特異性非特異性, 較較高高濃度標記濃度標記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng), 較較低低濃度標記濃度標記線粒體線粒體4)高爾基體高爾基體 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死細胞可染活或死細胞 26激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 細胞器的單克隆抗體細胞器的單克隆抗體5)細胞核細胞核 PI propidium iodide 536/617 DNA/RNA 死細胞死細胞碘化丙啶碘化丙啶EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死細胞死細胞Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活細胞活細胞Hoches

19、t 33258 352/461 DNA A-T 活細胞活細胞DAPI 358/461 DNA A-T 半通透細胞半通透細胞Chromomycin A3 450/470 DNA G-CAO 500/526 DNA 活細胞活細胞 560/650 RNATOTO-1 514/533 DNA 死細胞死細胞SYTO1116 2024 488/ 520 活細胞活細胞SYTO1116 2024 521/ 556 活細胞活細胞SYTO 17 621/634 活細胞活細胞273. GFP 綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白GFP的的發(fā)現(xiàn)：的的發(fā)現(xiàn)：60年代，年代，Shimomura等首先從水母中分離出一等首先從水母中分離

20、出一種種水母發(fā)光蛋白水母發(fā)光蛋白(aequoren)，該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)，該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍色熒光。然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證實生藍色熒光。然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證實在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 GFP, 后后經(jīng)研究表明，在水母體內(nèi)經(jīng)研究表明，在水母體內(nèi)CaCa2+2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后，和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍色熒光，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍色熒光，GFPGFP在藍光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色在藍光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色熒光熒光 。 將外源基因與將外源基因與G

21、FP DNA 相連相連, GFP可作為外源基因的報告基可作為外源基因的報告基因?qū)崟r監(jiān)測外源基因的表達因?qū)崟r監(jiān)測外源基因的表達.激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用28激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用GFP主要應(yīng)用主要應(yīng)用: 對活細胞中的蛋白質(zhì)進行準確定位及動態(tài)觀察對活細胞中的蛋白質(zhì)進行準確定位及動態(tài)觀察 可實時原位跟蹤特定蛋白在細胞生長、分裂、分化過程中可實時原位跟蹤特定蛋白在細胞生長、分裂、分化過程中或外界刺激因子的作用下的時空表達或外界刺激因子的作用下的時空表達, 如某種轉(zhuǎn)錄因子的如某種轉(zhuǎn)錄因子的核核轉(zhuǎn)位轉(zhuǎn)位、蛋白激酶、蛋白激酶C的的膜轉(zhuǎn)位膜轉(zhuǎn)位等。等。 GFP基因與分

22、泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細胞基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細胞, 可動態(tài)觀察可動態(tài)觀察 該分泌蛋白分泌到細胞外的過程該分泌蛋白分泌到細胞外的過程 GFP基因與定位于某一細胞器特殊蛋白基因相連基因與定位于某一細胞器特殊蛋白基因相連,就能顯就能顯 示活細胞中細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細胞器示活細胞中細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細胞器的結(jié)構(gòu)及病理過程的結(jié)構(gòu)及病理過程 可用于觀察分子的運動（可用于觀察分子的運動（FRAP） 蛋白之間的相互作用（蛋白之間的相互作用（FRET）29激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用三三.動態(tài)測量動態(tài)測量Physiology:細胞內(nèi)離子動態(tài)變化測量細胞內(nèi)離

23、子動態(tài)變化測量1).游離游離Ca2+測量測量 檢測游離檢測游離Ca2+變化熒光探針的原理：這類探針多為變化熒光探針的原理：這類探針多為Ca2+螯合劑，不與螯合劑，不與Ca2+結(jié)合時不發(fā)熒光，通常也不能進入細胞膜，只有與乙酰甲酯結(jié)合時不發(fā)熒光，通常也不能進入細胞膜，只有與乙酰甲酯AM相相連方可進入細胞內(nèi)，被細胞內(nèi)酯酶水解后并與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒連方可進入細胞內(nèi)，被細胞內(nèi)酯酶水解后并與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒光。光。Kd值為值為Ca2+解離常數(shù)，表明檢測解離常數(shù)，表明檢測Ca2+濃度的范圍濃度的范圍:0.1xKd-10 xkd, Kd和很多因素有關(guān)，如和很多因素有關(guān)，如pH、 Mg2+、與蛋白的

24、結(jié)合、溫度等。細胞內(nèi)生理、與蛋白的結(jié)合、溫度等。細胞內(nèi)生理Ca2+濃度值濃度值(10-100n M)，細胞內(nèi)，細胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的濃度的1010倍倍左右）左右） 30熒光探針熒光探針 激發(fā)波長激發(fā)波長發(fā)射波長發(fā)射波長 KdFLuo3-AM, K+, dextran 506nm 525nm 390nMFluo4 506nm 525nmCalcium Green-1 507nm 530nm 190nMCalcium Green-2 507nm 535nm 550nMFura red 420/480nm 637nm 140nMOregon Green 488

25、494nm520nm 20,000nMCalcium Crimson 583nm 602nm 328nMIndo-1 356nm 405/458nm 230nMFura-2 340/380 476nm 145nM激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用31程序化測量：用程序化測量：用timelapse中的編程按鈕可進行不同時間序列的掃描測中的編程按鈕可進行不同時間序列的掃描測 量。量。 F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)Ca2+濃度絕對測量濃度絕對測量1）單波長公式法）單波長公式法Fluo3: 530nm Kd=450nMCa2+I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)

26、Fmin: 細胞內(nèi)無鈣時的熒光強度細胞內(nèi)無鈣時的熒光強度( MnCl2)Fmax：細胞內(nèi)鈣飽和時的熒光強度：細胞內(nèi)鈣飽和時的熒光強度(A23187)測量時切記細胞內(nèi)靜息測量時切記細胞內(nèi)靜息Ca2+濃度的相對熒光強度值不能太低（濃度的相對熒光強度值不能太低（F值值不低于不低于40）激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用32細胞內(nèi)生理細胞內(nèi)生理Ca2+濃度值（濃度值（10-8 -10-7 M）細胞內(nèi)細胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的濃度的1010倍左右）倍左右）2 2）標準曲線法）標準曲線法根據(jù)儀器條件和負載條件，以不同根據(jù)儀器條件和負載條件，以不同CaCa2+2+

27、濃度的濃度的Buffer(EGTA- Buffer(EGTA- CaCa2+2+) )做標準曲線，橫軸為做標準曲線，橫軸為CaCa2+2+濃度，縱軸為熒光強度濃度，縱軸為熒光強度3 3）比例熒光的測量）比例熒光的測量.雙波長雙波長(比例熒光：比例熒光：ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380, 440)Ca2+I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用33激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用快速快速Ca2+變化的測量變化的測量1.改變掃描速度改變掃描速度2.采用雙向掃描采用雙向掃描3.

28、減少采樣點數(shù)減少采樣點數(shù)(犧牲空間分辨率）犧牲空間分辨率）4.采用線掃描采用線掃描(xt)34細胞器的細胞器的Ca2+測量測量1.線粒體內(nèi)游離線粒體內(nèi)游離Ca2+測量測量 Fluo-3 + TMRM(線粒體熒光探針，紅色）線粒體熒光探針，紅色）2. 特異定位的重組水母發(fā)光蛋白特異定位的重組水母發(fā)光蛋白 水母發(fā)光蛋白與水母發(fā)光蛋白與 Ca2+結(jié)合后發(fā)藍光結(jié)合后發(fā)藍光 用含有水母發(fā)光蛋白和含有特定細胞器蛋白的表達載體用含有水母發(fā)光蛋白和含有特定細胞器蛋白的表達載體轉(zhuǎn)染細胞，可測定亞細胞器內(nèi)的游離轉(zhuǎn)染細胞，可測定亞細胞器內(nèi)的游離Ca2+變化變化 目前已商品化的探針可檢測：線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核目前已

29、商品化的探針可檢測：線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核內(nèi)的游離內(nèi)的游離Ca2+，因生物發(fā)光很弱不能使用，因生物發(fā)光很弱不能使用Confocal檢測檢測 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用35 細胞內(nèi)游離細胞內(nèi)游離Ca2+測量的應(yīng)用測量的應(yīng)用l鈣的特性鈣的特性1細胞內(nèi)外的電化學(xué)梯度細胞內(nèi)外的電化學(xué)梯度10103 3-10-104 4倍倍2 2細胞膜滲透性稍有改變或鈣庫釋放稍有增加，導(dǎo)致細胞膜滲透性稍有改變或鈣庫釋放稍有增加，導(dǎo)致 胞內(nèi)鈣明顯升高胞內(nèi)鈣明顯升高3 3細胞內(nèi)鈣為細胞激活細胞內(nèi)鈣為細胞激活“開關(guān)開關(guān)”l細胞內(nèi)鈣的生理作用細胞內(nèi)鈣的生理作用1肌肉的興奮收縮肌肉的興奮收縮-收縮偶聯(lián)收縮偶聯(lián)2

30、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放神經(jīng)遞質(zhì)的釋放3學(xué)習(xí)記憶的增強學(xué)習(xí)記憶的增強4卵子受精卵子受精5細胞分裂和再生細胞分裂和再生6細胞調(diào)亡細胞調(diào)亡7細胞間通訊細胞間通訊激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用368細胞信號傳導(dǎo)細胞信號傳導(dǎo)9. DNA合成合成10. 基因表達基因表達l細胞內(nèi)鈣超載與疾病細胞內(nèi)鈣超載與疾病1高血壓、腦缺血、心臟病、內(nèi)分泌病胞內(nèi)鈣濃度異常2糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化病胞內(nèi)鈣濃度增高3人體缺鈣骨鈣大量丟失，神經(jīng)細胞的鈣濃度增高4老化和老年性癡呆-神經(jīng)細胞內(nèi)鈣濃度增高 細胞內(nèi)生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M）細胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的10倍左右）激光掃

31、描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用37電刺激引起骨骼肌 細胞的Ca2+振蕩激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用38激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 pH值的檢測：值的檢測： BCECF-AM 490nm 530nm 6.5-7.5 Snarf-1-AM 488nm 580/640nm 7.0-8.039自由基的檢測自由基的檢測熒光探針：熒光探針：H H2 2DCF-DA（504nm/529nm）2-2-氫，氫，2 2氯熒光素乙酰乙酸鹽氯熒光素乙酰乙酸鹽 胞外胞外H H2 2DCF-DA DCF-DA 擴散入細胞內(nèi)擴散入細胞內(nèi) 酯酶脫乙酰酯酶脫乙酰DCF-H(DCF-H(

32、不熒發(fā)光）不熒發(fā)光） DCFDCF（發(fā)熒光（發(fā)熒光）* *樣品不能在鏡下用汞燈照射及觀察樣品不能在鏡下用汞燈照射及觀察 Dihydrorhodamine 123（507nm/529nm）H H2 2rhod123 rhod123 被動擴散入細胞內(nèi)被動擴散入細胞內(nèi) 在細胞內(nèi)被氧化成在細胞內(nèi)被氧化成rod123rod123（發(fā)光）（發(fā)光）激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用40激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 藥物進入細胞的動態(tài)過程及定位分布藥物進入細胞的動態(tài)過程及定位分布 xyzt 掃描掃描 41激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用四四. . 膜電位的測量膜電位的測量標記膜電位探針標記膜電位探針( (慢反應(yīng)）：慢反應(yīng)）：JC1 510nm 530/590nmDioc5(3) 548nm 573nmDioc6(3) 484nm 500nm快反應(yīng)探針：快反應(yīng)探針：Di-4-ANEPPS 496nm 70