病原生物實(shí)驗(yàn)課：實(shí)驗(yàn)十六、細(xì)胞免疫功能檢測(cè)（免疫實(shí)驗(yàn)3）

1、學(xué)習(xí)要求學(xué)習(xí)要求1.了解細(xì)胞免疫試驗(yàn)技術(shù)的概念和內(nèi)容；2.熟悉E花環(huán)形成試驗(yàn)原理；3.熟悉淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)原理；4.掌握吞噬細(xì)胞的小吞噬試驗(yàn)原理和方法；5.掌握吞噬細(xì)胞的大吞噬試驗(yàn)原理和方法；6.了解變態(tài)反應(yīng)原理、方法和意義； 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1. E花環(huán)花環(huán)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)試驗(yàn)示教片示教片2.吞噬試驗(yàn)吞噬試驗(yàn) 小吞噬小吞噬 、大吞噬大吞噬每人做每人做+示教示教動(dòng)物技術(shù)錄像動(dòng)物技術(shù)錄像3. 豚鼠過敏試驗(yàn)豚鼠過敏試驗(yàn)錄像錄像+示教示教一、一、E花環(huán)形成試驗(yàn)花環(huán)形成試驗(yàn)1.原理原理人類T淋巴細(xì)胞表面具有綿羊紅細(xì)胞（SRBC）的受體， SRBC能粘附于T細(xì)胞周圍，形成玫瑰花環(huán)樣的細(xì)

2、胞團(tuán)，稱為E花環(huán)，形成E花環(huán)的細(xì)胞也稱為紅細(xì)胞花環(huán)形成細(xì)胞（ERFC）。 試驗(yàn)方法有兩種:不經(jīng)4低溫作用，短時(shí)間形成的玫瑰花環(huán)，稱活性玫瑰花環(huán)（Ea-RFC）。而在4下較長時(shí)間作用形成的玫瑰花結(jié)，是由全部T細(xì)胞與SRBC結(jié)合形成的，稱總玫瑰花環(huán)（ET-RFC）。目前認(rèn)為Ea-RFC代表著某些T細(xì)胞的亞群，更能敏銳地反映出細(xì)胞免疫的功能狀態(tài)。因此，在某些狀態(tài)下ET-RFC百分?jǐn)?shù)正常，而Ea-RFC百分?jǐn)?shù)卻已顯示出改變。2.ET-RFC試驗(yàn)方法試驗(yàn)方法（1）淋巴細(xì)胞的分離；（2）淋巴細(xì)胞與SRBC的計(jì)數(shù)；（3）按淋巴細(xì)胞與SRBC 1：60的比例混 勻，置4作用2小時(shí)；（4）離心，取沉淀涂片，染色

3、鏡檢。 高倍鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，算出E花環(huán)陽性細(xì)胞百分率。SRBCT淋巴細(xì)胞正常值：正常值：ET-RFC為為 50%80%E花環(huán)錄像E花環(huán)花環(huán)二、二、淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)1.原理原理淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（LTT）是將體外培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞用非特異性的有絲分裂原如PHA、ConA等刺激，使之轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞的試驗(yàn)。 淋巴母細(xì)胞體積較T淋巴細(xì)胞大，其中胞漿豐富，DNA和RNA合成增加，細(xì)胞可發(fā)生核分裂。T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力可反映機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。 取抗凝血加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中； 培養(yǎng)液中加PHA，置37 溫箱培養(yǎng)72小 時(shí)； 離心、涂片、固定、染色、鏡檢過渡型過渡型轉(zhuǎn)化型轉(zhuǎn)化型 在油鏡

4、下觀察淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況，計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，計(jì)數(shù)其中轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞（含過渡型）的百分率，即淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。 轉(zhuǎn)化型細(xì)胞數(shù) 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率= 轉(zhuǎn)化型細(xì)胞數(shù)+未轉(zhuǎn)化型細(xì)胞數(shù)X100% 正常值：淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率為正常值：淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率為60%80% 機(jī)體中具有吞噬功能的細(xì)胞大致分為兩大類：即小吞噬和大吞噬細(xì)胞。小吞噬細(xì)胞一般指血液中的中性粒細(xì)胞，大吞噬細(xì)胞則是存在于組織中的巨噬細(xì)胞和血液中的大單核細(xì)胞，它們構(gòu)成機(jī)體天然防御機(jī)制的一部分，對(duì)外來異物具有吞噬和消化作用。2.中性粒細(xì)胞吞噬中性粒細(xì)胞吞噬功能試驗(yàn)（小吞噬）功能試驗(yàn)（小吞噬）（1）方法 a.小鼠腹腔內(nèi)注射金葡球菌菌液1ml； b.30min后斷

5、髓處死，打開腹腔，取腹腔液涂片； c.涂片干后，瑞氏姬姆薩染色液乙液染色30秒。 d.用瑞氏姬姆薩染色液甲液染35分鐘，待干鏡檢。（2）結(jié)果觀察 油鏡下，先找中性粒細(xì)胞，觀察胞漿中有無吞噬細(xì)菌，如結(jié)果正確，可見染成紫色的細(xì)胞核及被吞噬的細(xì)菌，細(xì)胞質(zhì)則為淡紅色。小吞噬小吞噬小吞噬小吞噬3.小白鼠腹腔小白鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)（大吞噬）試驗(yàn)（大吞噬）（1）方法）方法a.試驗(yàn)前3天，于小白鼠腹腔內(nèi)注射6%可溶性淀粉肉湯1ml；b.試驗(yàn)當(dāng)天，每只小白鼠腹腔內(nèi)再注射1%紅細(xì)胞懸液 1ml；c.注射后30分鐘，用注射器吸取腹腔液少許，置于載玻片 上，推成涂片，干后先用瑞氏姬姆薩染色液乙液染色30秒，然后用瑞氏姬姆薩染色液甲液染35分鐘，待干鏡檢。 （2）結(jié)果觀察）結(jié)果觀察 油鏡觀察小白鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬紅細(xì)胞現(xiàn)象。 細(xì)胞吞噬錄像大吞噬大吞噬大吞噬大吞噬end4.溶菌酶測(cè)定溶菌酶測(cè)定 （1）制備瓊脂板板中含有微球菌 （2）打孔 （3）加樣標(biāo)準(zhǔn)溶菌酶、雞蛋清（陽性對(duì)照）、