CRISPRCas基因編輯技術(shù)簡介學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1CRISPRCas基因編輯技術(shù)簡介基因編輯技術(shù)簡介 1987年，日本大阪大學(xué)（Osaka University） 在對一種細(xì)菌編碼的堿性磷酸酶基因進(jìn)行研究時，發(fā)現(xiàn)在這個基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，但一直不清楚功能。后來的研究發(fā)現(xiàn)，這種重復(fù)序列廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中。 2002年才正式命名為成簇的規(guī)律間隔性短回文重復(fù)序列CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats). 2013年之后，研究者們在science 和nature等國際著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹CRISPR/Cas9系

2、統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實現(xiàn)精準(zhǔn)的基因修飾。系統(tǒng)概述第1頁/共24頁 已測序的接近90%的古細(xì)菌和40%的細(xì)菌的基因組或是質(zhì)粒中至少存在CRISPR 基因座。 根據(jù)Cas 基因核心元件序列的不用，CRISPR/Cas 免疫體統(tǒng)分為3中類型：型、型和型。型和型CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)需要多個Cas蛋白形成復(fù)合體切割DNA雙鏈，而型CRISPR/Cas9免疫系統(tǒng)只需要一個Cas9蛋白來切割DNA雙鏈，目前型系統(tǒng)是被改造的最成功的人工核酸內(nèi)切酶。系統(tǒng)概述的分布與分類：的分布與分類：第2頁/共24頁 CRISPR/Cas系統(tǒng)是很多細(xì)菌和大部分古細(xì)菌的天然免疫系統(tǒng)，通過對入侵的病毒

3、和核酸進(jìn)行特異性的識別，利用Cas蛋白進(jìn)行切割，從而達(dá)到對自身的免疫。系統(tǒng)獲得：系統(tǒng)獲得：系統(tǒng)概述第3頁/共24頁系統(tǒng)結(jié)構(gòu)主要由兩部分組成：主要由兩部分組成：第4頁/共24頁結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)： CRISPR是一種特殊的DNA 重復(fù)序列家族，廣泛分布于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。CRISPR位點通常由短的高度保守的重復(fù)序列(repeats)組成，重復(fù)序列的長度通常為21-48bp，重復(fù)序列之間被26-72bp間隔序列(spacer)隔開。CIRSPR通過這些間隔序列(spacer)與靶基因進(jìn)行識別。系統(tǒng)結(jié)構(gòu)第5頁/共24頁家族：家族： Cas(CRISPR associated)存在于CRISPR位點附近，

4、是一種雙鏈DNA核酸酶，能在guide RNA 引導(dǎo)下對靶位點進(jìn)行切割。它與fokI酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。系統(tǒng)結(jié)構(gòu)第6頁/共24頁uCRISPR基因座的表達(dá)（包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的成熟加工）u當(dāng)該噬菌體再次入侵細(xì)菌時，CRISPR簇首先轉(zhuǎn)錄為長的crRNA前體，然后逐步加工成小的成熟的crRNA.uCRISPR/Cas系統(tǒng)活性的發(fā)揮或外源遺傳物質(zhì)的干擾ucrRNA結(jié)合相關(guān)的Cas蛋白后，形成crRNA-Cas蛋白復(fù)合體，通過堿基互補配對精確地與目標(biāo)DNA相結(jié)合，隨后Cas蛋白對目標(biāo)DNA 進(jìn)行斷裂和降解。系統(tǒng)作用機(jī)制第7頁/共24頁系統(tǒng)Type 因其簡單性及可操作性，被

5、改造成有力的基因工程工具-CRISPR/Cas9?，F(xiàn)在廣泛使用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)來源于釀膿鏈球菌。Type II系統(tǒng)具有以下特點：u在CRISPR/Cas基因座上游會表達(dá)tracrRNA;utracrRNA會參與crRNA的加工，這個工程亦需要RNaseIII的參與；utracrRNA會與crRNA形成二聚體指導(dǎo)Cas對雙鏈DNA的切割。第8頁/共24頁Cas9是一種核酸內(nèi)切酶,其具有：RuvC和HNH兩個內(nèi)切酶活性中心Jinek等發(fā)現(xiàn)Cas9在細(xì)菌和試管里對雙鏈DNA具有強(qiáng)烈的切割能力,但是這種切割能力需要的crRNA和tracrRNA介導(dǎo)。系統(tǒng)第9頁/共24頁Jinek等創(chuàng)造性的

6、把crRNA和部分tracrRNA融合成一條嵌合的RNA鏈,使其同時具有crRNA和tracrRNA的特性,隨后的切割實驗表明,這條嵌合的RNA同樣可以引導(dǎo)Cas9切割目標(biāo)DNA?，F(xiàn)在普遍使用的都是crRNA和全長tracrRNA 融合體,簡稱 sgRNA (single guide RNA)系統(tǒng)第10頁/共24頁系統(tǒng)釀膿鏈球菌第11頁/共24頁系統(tǒng)第12頁/共24頁系統(tǒng)gRNA 在線設(shè)計工具：第13頁/共24頁系統(tǒng)第14頁/共24頁u基因敲除或者敲入；u 基因修復(fù)；u 基因調(diào)控；u文庫篩選。系統(tǒng)CRISPR/Cas 作用：第15頁/共24頁脫靶效應(yīng)u2013年，研究者們發(fā)表多篇文章介紹CRI

7、SPR/Cas9系統(tǒng)，但CRISPR/Cas9目前仍存在一個很嚴(yán)重且無法避免的問題，即潛在的脫靶效應(yīng)不可消除。uCRISPR/Cas9與靶位點識別的特異性主要依賴于gRNA與靠近PAM處10-12bp堿基的配對，而其余遠(yuǎn)離PAM處8-10bp堿基的錯配對靶位點的識別影響不大。uCas9蛋白不具特異性第16頁/共24頁沈彬，20156.降低脫靶效應(yīng)Cas9切口酶通過點突變的方法，使Cas9只有單鏈切割活性，類似于切口酶第17頁/共24頁Yu Hisano et al.20146.降低脫靶效應(yīng)添加同源臂(homology arm,HR)第18頁/共24頁Nicolas Wyvekens et al.2015FoKI-dCas96.降低脫靶效應(yīng)第19頁/共24頁Feng Zhang et al. 20156.降低脫靶效應(yīng)CRISPR/Cpf1系統(tǒng)Cpf1系統(tǒng)更簡單一些，它只需要一條RNA。Cpf1酶也比標(biāo)準(zhǔn)SpCas9要小，使得它更易于傳送至細(xì)胞和組織內(nèi)。Cpf1以一種不同于Cas9的方式切割DNA。Cas9切割留下“平端”（blunt ends）。Cpf1復(fù)合物生成的兩條鏈切口是偏移的，在裸露端留下了短懸端（overhang）。這預(yù)計有助于精確插入。Cpf1切口遠(yuǎn)離識別位點。Cpf1 Is a Single RN