Infusion技術(shù)學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1Infusion技術(shù)技術(shù)December 5, 20212 TA克隆限制性酶切克隆平滑末端克隆缺點：連接效率低 耗時較長 需要特定限制性酶切位點第1頁/共32頁December 5, 20213 Clontech專利In-Fusion HD Cloning System任意載體任意基因片段這是一款讓您隨心所欲地實現(xiàn)基因定向克隆的產(chǎn)品！ 第2頁/共32頁4 第3頁/共32頁December 5, 20215 2In-Fusion優(yōu)點及應(yīng)用實例3In-Fusion系列產(chǎn)品介紹4常見問答1In-Fusion克隆技術(shù)的原理第4頁/共32頁December 5, 20216 主要內(nèi)容2In-Fu

2、sion優(yōu)點及應(yīng)用實例3In-Fusion系列產(chǎn)品介紹4常見問答1In-Fusion克隆技術(shù)的原理第5頁/共32頁In-Fusion專利酶Clontech專利In-Fusion是一種快速、簡單、高效的基因克隆技術(shù)！50 ，15 min單管反應(yīng)7 第6頁/共32頁December 5, 20218 主要內(nèi)容2In-Fusion優(yōu)點及應(yīng)用實例3In-Fusion系列產(chǎn)品介紹4常見問答1In-Fusion克隆技術(shù)的原理第7頁/共32頁December 5, 20219 不附加任何多余序列2不受限制性內(nèi)切酶酶切位點的限制3可同時克隆兩個或多個DNA片段 41簡便、快速、高效的克隆技術(shù)第8頁/共32頁D

3、ecember 5, 202110 快速！第9頁/共32頁December 5, 202111 In-Fusion HD無論是克隆長基因片段還是克隆多個基因片段都能保持較高的克隆效率。 高效！簡便、快速、高效的克隆技術(shù)第10頁/共32頁December 5, 202112 線性化載體任意載體克隆位點目的DNA片段不需要的堿基序列引物設(shè)計PCR擴增與載體相同的15 個堿基 序列In-Fusion連接反應(yīng)15 min 不附加任何多余序列的重組載體無縫克?。翰桓郊尤魏味嘤嘈蛄蠥BC第11頁/共32頁December 5, 202113 In-Fusion克隆不受限制性內(nèi)切酶酶切位點的限制: 在cDN

4、A序列中插入內(nèi)含子,熒光蛋白基因 在cDNA序列添加UTRs 轉(zhuǎn)換純化標(biāo)簽例如Myc 轉(zhuǎn)換為His 缺失蛋白表達區(qū)域表達載體選擇插入位點PCR擴增純化目的DNA片段混合In-FusionIn-Fusion引物設(shè)計PCR擴增 重組載體第12頁/共32頁December 5, 202114 Step 2: 目的DNA片段擴增Step 3: 一次In-Fusion連接反應(yīng)Step 1: 制備線性化載體片段1片段2片段3線性化載體重組載體第13頁/共32頁December 5, 202115 克服其它克隆技術(shù)的限制其它克隆技術(shù)的限制In-Fusion解決方案載體的限制 不同克隆試劑盒都需要與之匹配的載

5、體必須使用提供的載體只要載體末端和插入片段末端具有15個同源堿基， In-Fusion就可以將任意PCR片段插入任意線性化載體中。必須進行限制性內(nèi)切酶酶切和連接需要獨一無二、兼容的酶切位點極少的合適酶切位點In-Fusion不受限制性酶切位點的限制，因此在目的片段及使用的載體中是否存在合適的酶切位點并不妨礙克隆。亞克隆繁瑣多片段不能同時克隆In-Fusion能夠在一次反應(yīng)中同時克隆多個片段，無需進行亞克隆。對于大片段克隆效率較低對于插入片段有限制In-Fusion系統(tǒng)能夠高效克隆0.05-15 kb DNA片段。非定向克隆需要篩選目的片段插入方向 正確的克隆In-Fusion是基因定向克隆技術(shù)

6、，因此無需進行目的基因片段正確插入的克隆的篩選。會附加多余堿基序列In-Fusion是無縫克隆：不附加任何多余堿基序列。不適合中型和大規(guī)模克隆工程In-Fusion技術(shù)已經(jīng)成功用于多項高通量克隆工程。第14頁/共32頁December 5, 202116 多片段克隆構(gòu)建載體模型插入突變位點高通量克隆第15頁/共32頁December 5, 202117 應(yīng)用實例實例：多個DNA片段（1 kb, 2 kb, 3 kb)同時克隆【方法】使用TaKaRa高品質(zhì)PCR酶分別擴增1 kb、2 kb、3 kb的目的DNA片段 和2.7 kb的載體，并將擴增產(chǎn)物混合，使用In-Fusion HD試劑盒完成

7、克隆。利用高效率的感受態(tài)細胞StellarTM Competent Cells（產(chǎn)品編 號：636763）轉(zhuǎn)化并進行藍/白斑篩選。第16頁/共32頁December 5, 202118 引物的5末端必須包含與載體末端相同的15個堿基序列引物的3末端必須包含與目的基因片段相互補的特異堿基序列第17頁/共32頁December 5, 202119 PCR擴增酶切處理第18頁/共32頁December 5, 202120 In-Fusion專利酶線性化載體目的基因片段反應(yīng)液直接轉(zhuǎn)化In-Fusion連接反應(yīng)50 15 min 【結(jié)果】Cloning Enhancer處理，37 15 min， 80

8、15 min 第19頁/共32頁引物的5末端必須包含與載體末端相同的15個堿基序列引物的3末端必須包含與目的基因片段相互補的特異堿基序列December 5, 202121 第20頁/共32頁December 5, 202122 第21頁/共32頁December 5, 202123 在線支持工具第22頁/共32頁December 5, 202124 主要內(nèi)容2In-Fusion優(yōu)點及應(yīng)用實例3In-Fusion系列產(chǎn)品介紹4常見問答1In-Fusion克隆技術(shù)的原理第23頁/共32頁December 5, 202125 第24頁/共32頁December 5, 202126 5X In-Fu

9、sion HD Enzyme Premix pUC19 Control Vector, linearized (50 ng / l)2 kb Control Insert (40 ng / l) In-Fusion HD Cloning Kit（ 639648/49/50)組分第25頁/共32頁December 5, 202127 Cloning Enhancer的作用：消除PCR反應(yīng)液中的引物二聚體和dNTP等的影響無需對PCR產(chǎn)物進行膠純化操作簡單In-Fusion HD Cloning Kit w/ Cloning Enhancer (639633/34/35)第26頁/共32頁Dece

10、mber 5, 202128 Up to 5X Higher Efficiency未經(jīng)處理Cloning Enhancer處理Cloning Enhancer的實用例第27頁/共32頁December 5, 202129 主要內(nèi)容2In-Fusion優(yōu)點及應(yīng)用實例3In-Fusion系列產(chǎn)品介紹4常見問答1In-Fusion克隆技術(shù)的原理第28頁/共32頁December 5, 202130 Q1.如何選擇PCR酶？A1.可以使用任何PCR酶。由于科研人員進行克隆表達的實驗較多，我們推薦使用高保真的PCR酶。Q2.載體和插入的DNA片段末端結(jié)構(gòu)有限制嗎？A2.沒有特別的限制。無論是平滑末端、粘性末端或者末端有無A尾均可 進行有效的連接反應(yīng)。 Q3.載體和插入的DNA片段的長度有限制嗎？A3.沒有特別的限制。載體和插入的DNA片段即使超過10 kb也可以進 行連接反應(yīng)，只是連接效率會有所降低。插入的DNA片段只要不少 于50 bp就可進行有效的連接反應(yīng)。Q4.線性化載體