張克龍的畢業(yè)論文

1、本科生畢業(yè)論文（設計）題 目:VB6聯(lián)合海金沙對草酸鈣結石大鼠脾腎組織結構的影響 姓 名: 張克龍 學 院: 動物科學學院 專 業(yè): 動物醫(yī)學 班 級: 2011級2班 學 號: 1222110231 指導教師: 李靜 職稱: 副教授 2015 年 5月 24 日安徽科技學院教務處制目錄摘要- 1 -關鍵詞- 1 -引言- 1 -1 材料與方法- 2 -1.1 試驗材料- 2 -1.1.1 試驗動物- 2 -1.1.2 試驗藥品與試劑- 2 -1.1.3 試驗主要儀器設備- 2 -1.2 試驗方法- 2 -1.2.1 動物分組與給藥- 2 -1.2.2草酸鈣成石液的配制- 3 -1.2.3 動

2、物飼養(yǎng)- 3 -1.3 樣品采集與檢測指標- 4 -1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析- 4 -2 結果與分析- 4 -2.1宰前活重和脾腎臟指標的變化- 4 -2.2各組腎脾臟切片觀察- 5 -3 討論- 6 -3.1草酸鈣結石大鼠模型的建立以及成石液對大鼠腎組織結構的影響- 6 - 3.2草酸鈣結石大鼠模型的建立以及成石液對大鼠脾組織結構的影響- 6 -4 結論- 8 -致謝- 8 -參考文獻- 8 -英文摘要- 9 -VB6聯(lián)合海金沙對草酸結石小鼠脾腎組織結構的影響動物醫(yī)學專業(yè)2011級2班 張克龍 指導老師：李靜（副教授）摘要：目的：探討VB6聯(lián)合海金沙對草酸結石小鼠脾腎組織結構的影響。方法：42只

3、大鼠按體重相近原則分為7組，I組作為對照組大鼠自由飲用純凈水，II至組作為實驗組大鼠主要飲用成石液，成石液由1%氯化銨和1%乙二醇配置而成，至每組大鼠灌服藥液，、組大鼠灌服生理鹽水。組大鼠灌服定量VB6和低劑量海金沙水提取液， 組大鼠灌服定量VB6和高劑量聯(lián)合海金沙提取液，組大鼠灌服定量VB6溶液，組大鼠灌服定量海金沙水提取液。灌服30d后，選取每組大鼠，宰殺并解剖獲取脾腎臟。脾腎臟作常規(guī)切片,觀察組織變化。結果：結石組小鼠腎小球萎縮，腎小管中可見塊狀黑色的草酸鈣晶體；、組小鼠腎小管腔草酸鈣晶體明顯減少。結論VB6聯(lián)合海金沙可有效減少腎臟內(nèi)草酸鈣結晶的數(shù)量，使脾結構恢復，白髓中脾小結較結石組明

4、顯減少。關鍵詞:VB6；海金沙；草酸鈣結石；組織結構；脾；腎 泌尿系結石是泌尿系統(tǒng)的常見病，又稱為尿石，是指在泌尿系統(tǒng)內(nèi)因尿液濃縮沉淀形成顆?；虺蓧K樣聚集物，中醫(yī)文獻稱其石淋、砂淋、血淋，發(fā)生于腎、膀胱、輸尿管和尿道的任何部位，阻遏尿液的正常排出，以腎與輸尿管結石為常見，腎結石成分多為草酸鈣結晶1-2。泌尿系結石造成的機械性刺激性炎癥可使腎小管上皮細胞受損，加速草酸鈣結晶的附著3，引起尿路損傷，繼發(fā)性細菌性感染，致使腎功能受損，以尿路梗阻、下腹部輕微疼痛或腎絞痛、排尿不暢為主要臨床表現(xiàn)。近些年來，雖然泌尿系結石的防治研究取得了一定的進展，但仍無非常有效的治療藥物，發(fā)病率依舊居高不下，并且還有上

5、升的趨勢。VB6 包括磷酸吡哆醛、磷酸吡哆胺、磷酸吡哆醇, 是氨基酸代謝中轉氨酶的輔酶。VB6 在草酸生成上有極重要的作用。 當有足量的 VB6 時, 大部分的乙醛酸可以氨基化為甘氨酸, 減少草酸生成。 陳志強等4 發(fā)現(xiàn), 給乙二醇結石模型大鼠補充大劑量 VB6 能明顯的抑制脾腎草酸鈣沉積。中藥海金沙Lygodium japonicum( Thunb) sw是蕨類植物海金沙科海金沙屬一年生草質藤本植物，廣泛分布于廣東、廣西等地5 海金沙可全草入藥，味甘淡，性寒，富含糖、酚和黃酮類化合物，臨床用于治療尿路感染、尿路結石、腎炎、水腫，具有清熱解毒、利尿除濕之功效 6。對濃度1乙二醇與1氯化銨溶液采

6、用飲水模式模擬的大鼠草酸鈣結石模型采用灌胃干預，制做腎臟脾臟組織切片并觀察腎內(nèi)草酸鈣結晶及腎臟的變化，脾臟的變化，以探討VB6聯(lián)合海金沙對草酸鈣結石大鼠脾臟.腎臟組織結的影響，為開發(fā)新藥提供理論和實驗依據(jù)。1 材料與方法1.1 試驗材料1.1.1 試驗動物 由安徽醫(yī)科大學提供的45日齡的SD級小鼠42只，雄性，體重250-300g，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2011-002。1.1.2 試驗藥品與試劑 氯化銨（NH4Cl），滬試生產(chǎn)，分析純，批號：F20050621。乙二醇（C2H6O2），國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)，分析純，批號：T20110608。維生素B6（1ml：50mg），貴

7、州天地藥業(yè)有限公司，批號：H52020742；海金沙全草提取物（20:1），西安森然生物技術有限公司，批號SR2014517；生理鹽水，國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)，分析純，批號：F20090105。安徽長臨河醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)飼料，主要營養(yǎng)含量：水份（10）、粗蛋白（18）、粗脂肪（4）、粗纖維（5）、粗灰分（8）。1.1.3 試驗主要儀器設備分光光度計（SFZ1606016276型，由上海精密科學儀器有限公司生產(chǎn)）；低速離心機（TDL-50B型，由上海安亭科技儀器廠生產(chǎn)）；立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50FBS型，由上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)）；生物蘇泊爾電磁爐（SDHC04-210x型，

8、浙江蘇泊爾股份有限公司）；立式美菱冰箱（BCD-350W型，合肥美菱股份有限公司）；微型漩渦混合儀（XW-80A型，由上海滬西分析器廠有限公司生產(chǎn)）；IEICA-RM-2128型切片機；LY-1型 展片機；OLYMPUS-CH30顯微攝影系統(tǒng)；小鼠飼養(yǎng)籠具等實驗中所涉及的常用儀器設備均由安徽科技學院動物醫(yī)學試驗室提供。1.2 試驗方法1.2.1 動物分組與給藥SD級雄性大鼠42只適應性飼養(yǎng)1W后，按體重相近原則分組，每組6只，染色筆標記然后編號。對照組、成石組、海金沙組、VB6組、定量VB6與低劑量海金沙組、定量VB6與中劑量海金沙組、定量VB6與高劑量海金沙組。1.2.2實驗藥品的配制建立草

9、酸鈣結石模型小鼠(方法來自文獻7)，草酸鈣成石液為質量濃度1%氯化銨與體積分數(shù)1%乙二醇混合配置而成的溶液，具體操作是用電子天平稱取氯化銨5g，用10ml規(guī)格的量筒量取5ml的乙二醇，同時用500ml的量筒量取500ml的純凈水，一并倒入量杯中，并用玻璃棒混勻。海金沙：原料（采回后，切碎，在真空干燥箱中60,0.08MPa真空干燥后，置于干燥器中備用）水提（將粉碎后的海金沙稱取100g，加入八倍水浸泡，置于超聲波清洗器中進行超聲提取，抽濾，濾渣再重復過濾兩次，收集濾液，再用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至膏狀，定容到200ml容量瓶里，置于冰箱中冷藏備用）濃縮（將定容好的溶液脫水濃縮）浸膏噴霧干燥粉碎、混合、

10、包裝產(chǎn)品。VB6：規(guī)格為（1ml：50mg)的注射液，貴州天地藥業(yè)有限公司。1.2.3 動物飼養(yǎng) 大鼠飼養(yǎng)在安徽科技學院動物科學學院實驗動物房進行，在蘇州市新區(qū)楓橋凈化設備廠生產(chǎn)的獨立送排風籠具(Individual Ventitaled Cage,IVC)中進行飼養(yǎng)，大鼠的飼養(yǎng)管理及飼養(yǎng)環(huán)境、用具的清洗、消毒均嚴格按照標準化操作規(guī)范進行即每天固定時間換水換料，固定的時間給藥，大鼠用水瓶每天固定時間清洗，用具每日固定時間紫外線消毒。使用刨花作為大鼠墊料，墊料首先在陽光下曬干，然后紫外燈照射34h，再裝入自制的布袋中121高溫蒸汽滅菌20min，最后置入干燥箱內(nèi)60鼓風干燥后備用。 成石組和實驗

11、組大鼠飲用配制好的成石液，空白對照組大鼠飲用自來水，大鼠自由飲水，環(huán)境溫度2024，濕度5065%，光照1213h，每周定期稱重一次。大鼠給藥采用灌胃方式，對照組給予生理鹽水，VB6組0.2g/kg體重，海金沙組按0.3g/k海金沙全提取物給藥，高中低不同濃度海金沙-VB6三組，分別采用0.3g/kg海金沙+0.2g/kg VB6、0.6g/kg海金沙+0.2g/kg VB6和0.9g/kg海金沙+0.2g/kg VB6，持續(xù)4周。試驗過程中認真進行大鼠的一般檢查記錄大鼠的精神狀態(tài)、采食、飲水、活動、臨床癥狀、環(huán)境溫度與濕度及通風等情況。1.3 樣品采集與檢測指標試驗期結束后，全部小鼠禁食12

12、h，不禁水，稱量各組大鼠體重并作記錄，然后各組小鼠雙側眼球摘除采血，采血后大鼠迅速解剖，取出兩側腎臟和脾臟，稱量左右兩側腎臟的重量和脾臟，并計算腎體比、體比，腎體比（）=腎臟重量（g）/宰前體重（g）×100,體比（）=脾臟重量（g）/宰前體重（g）×100。腎臟用4中性甲醛固定，經(jīng)不同梯度乙醇脫水、再用二甲苯透明、石蠟包埋，修塊，用IEICA-RM-2128型切片機切片57m，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察腎臟組織切片，用OLYMPUS-CH30顯微攝影系統(tǒng)拍攝，通過所拍攝圖片來觀察比較脾腎組織結構的病理變化。1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（M

13、77;SD）表示。本實驗用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用Oneway ANOVA 數(shù)據(jù)分析方法進行差異性比較，<0.05為具有統(tǒng)計學意義。 2 結果與分析2.1宰前活重和脾腎指標的變化宰前活重腎體比（%）脾體比（%）285.13±37.151.74±0.50 0.24±0.04218.20±47.281.54±0.540.25±0.08 217.07±48.081.33±0.36 0.14±0.05 AB 194.48±44.08 1.26±0.29 0.17

14、7;0.05 B 宰前活重腎體比（%）脾體比（%）194.48±35.561.22±0.140.19±0.07 B 235.37±26.72 B1.32±0.26 0.17±0.05 B253.37±29.82 1.58±0.26 0.18±0.06 B注：與對照組比較， a表示 P<0.05，A表示 P<0.01；與結石組比較，b表示P <0.05，B表示P<0.01表1數(shù)據(jù)顯示，結石組組腎體比略低于對照組組，但差異不顯著(P0.05），組腎體比與對照組相近，差異不顯著（P0.0

15、5），、的腎體比與結石組差異不顯著（P0.05），無統(tǒng)計學比較意義，由表1可明顯看出對照組的腎體比最高，可能與VB6聯(lián)合海金沙的藥配伍有關。與對照組相比，其余各組大鼠體重都有所下降，可能是由于成石液對消化道粘膜的刺激和腎組織的結構所導致的。結石租脾體比略高于對照組但差異不顯著（P0.05），組脾體比與對照組差異極顯著（P0.01），、與對照組脾體比差異顯著（P0.05），與對照組相比，其余各組大鼠脾體比都有所下降，可能是由于VB6聯(lián)合海金沙對脾臟的保護作用，使脾臟組織細胞恢復正常 ，脾腫大減輕。2.2各組腎脾臟臟切片觀察各組腎臟圖片 對照組成石組低劑量海金砂與定量VB6圖1 圖 2 圖 3 定

16、量VB6和中劑量海金砂 定量VB6與高劑量海金砂 海金砂圖4 圖5 圖 6 VB6 圖7各組脾臟圖片 成石組 對照組 低劑量海金砂與定量VB6圖8圖9圖10 中劑量海金砂與定量VB6 高劑量海金砂與定量VB6 VB6圖11 圖12 圖13圖1可見正常對照組小鼠腎小球、腎小管結構正常，排列整齊，無草酸鈣結晶。圖2結石組中可見腎小囊、腎小球結構異常，排列雜亂，腎小管上皮細胞損傷，能見到不規(guī)則的大塊黑色結晶體。圖3低劑量海金砂與定量VB6組大鼠腎小球結構異常排列整齊,腎小球萎縮,腎小管結石減少,較結石組減少，圖4腎小管腔內(nèi)有大顆粒粒結晶體排列異常腎小球囊腫。圖5中劑量海金砂與定量VB6組腎小球結構異

17、常有大顆粒結晶，圖6腎小管內(nèi)有較大結晶體，與結石組相似。圖7組中腎小球結構異常,排列異常有大顆粒結晶。低劑量的海金沙和定量VB6、中劑量的V海金沙與定量VB6可相對有效保護腎臟的功效，高劑量的海金沙與定量VB6、定量VB6、定量海金沙效果相對較差。圖8III組中對照組大鼠脾臟紅髓和白髓結構清晰,白髓比較發(fā)達有明顯的明區(qū),暗區(qū),與小結帽。圖8結石組脾小結增多增大，較對照組有明顯增多。圖10脾結構較正常，白髓中脾小結較結石組明顯減少。從圖11可以看出脾小結相對正常，藥物起到保護脾臟的功能。圖12、13脾小結增多增大可能與藥物的劑量過大引起體液免疫應答。由上所列舉圖片，可以得出低劑量的海金沙和定量V

18、B6、中劑量的海金沙與定量VB6可較有效地保護脾臟組織，抑制脾小結的的數(shù)量，有使脾臟組織結構恢復正常的趨勢，有較好的治療效果，但高劑量的海金沙與定量VB6和定量VB6組效果較差。3 討論3.1 草酸鈣結石小鼠模型的建立以及成石液對大鼠腎臟組織結構的影響乙二醇和氯化銨是制備草酸鈣結石模型常用藥物，但所用的劑量和給藥途徑目前尚無統(tǒng)一的標準，試驗動物的品系、性別不同也會產(chǎn)生一定的差別，小鼠一般需要28-42d可形成草酸鈣結石8。乙二醇在機體內(nèi)可轉化為草酸，從腎臟分泌排泄，氯化銨為酸性物質，可酸化尿液，具有腎毒作用，可損害腎小管，二者協(xié)同作用于機體，可形成泌尿系統(tǒng)的草酸鈣結晶9。本試驗中草酸鈣結石模型

19、大鼠的制備方案中，成石液濃度為體積分數(shù)1%乙二醇與質量濃度1%氯化銨的混合溶液，自由飲水方式誘導，存在大鼠的攝入量控制不精確的問題，試驗設計周期為30d，由表可知，結石組大鼠腎體比最高；圖3、4結石組的腎臟切片顯示成石液對小鼠有損害作用，腎小管上皮細胞損傷，管腔分布有塊狀黑色的不規(guī)則結石晶體，腎小管上皮細胞的損傷是結石形成過程中不可或缺的條件，與結石形成的早期病理變化有著密切的聯(lián)系10-12，可以得出本次試驗成功的誘導了大鼠結石的形成，草酸結石模型建立成功。在試驗期間，對照組大鼠的精神狀態(tài)良好，給小鼠灌胃時有很強的應激反應， 5個干預組大鼠的精神狀態(tài)較差，不喜活動，造成此現(xiàn)象的主要原因可能是成

20、石液、各干預組藥液對大鼠的胃黏膜以及腎臟刺激的作用，使得這兩組大鼠的精神狀態(tài)較差。結石組腎體比最高，主要原因可能是鈣結晶在成石組大鼠腎中附著和沉積，也可能與成石液對尿路的損傷有關。3.2草酸鈣結石小鼠模型的建立以及成石液對大鼠脾組織結構的影響本試驗中草酸鈣結石模型大鼠的制備方案中，成石液濃度為體積分數(shù)1%乙二醇與質量濃度1%氯化銨的混合溶液，自由飲水方式誘導，存在大鼠的攝入量控制不精確的問題，試驗設計周期為30d，由表可知，結石組大鼠腎體比最高圖8III組中對照組大鼠脾臟紅髓和白髓結構清晰,白髓比較發(fā)達有明顯的明區(qū),暗區(qū),與小結帽。圖8結石組脾小結增多增大，較對照組有明顯增多。圖10脾結構較正

21、常，白髓中脾小結較結石組明顯減少。從圖11可以看出脾小結相對正常，藥物起到保護脾臟的功能。圖12、13脾小結增多增大可能與藥物的劑量過大引起體液免疫應答。 由上所列舉圖片，可以得出低劑量的海金沙和定量VB6、中劑量的海金沙與定量VB6可能較有效地保護脾臟組織，抑制脾小結的的數(shù)量，有使脾臟組織結構恢復正常的趨勢，有較好的治療效果，但高劑量的海金沙與定量VB6和定量VB6組效果較差4 結論VB6聯(lián)合海金沙可較有效減少腎小管內(nèi)草酸鈣結晶的數(shù)量，使脾結構恢復，白髓中脾小結較結石組明顯減少，發(fā)揮預防和治療草酸鈣結石的功效起到保護腎臟組織和保護脾組織中脾小結的作用。致謝值此論文結束之際，向我的論文指導老師

22、李靜副教授表示崇高的敬意和衷心的感謝，同時也非常地感謝幫我一起完成實驗的老師和同學們的支持與幫助。李老師在論文上嚴格要求、耐心指導、深入啟發(fā)，在論文的選題、設計、完成等方面傾注了大量的心血。老師孜孜不倦的追求精神，嚴謹?shù)闹螌W態(tài)度，高尚的人格是我永遠學習的楷模！感謝李靜、賀紹君、李文超等老師給予本論文試驗操作過程的熱情悉心的指導和大力的支持！參考文獻1黃明坦,梁國挺,葉澤兵.泌尿系統(tǒng)結石臨床綜合觀察J.當代醫(yī)學,2011,17(27):113-114.2An Z,Lee S,Oppenheimer H,et al. Attachment of calcium oxalate monohydrat

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27、ds on the structure of spleen kidney in mice with oxalic acid. Methods 42 rats according to the weight of similar principle is divided into 7 groups, I group as control group rats, drinking pure water, group II to VII as the rats of experimental group drinking liquid stone, stone liquid by 1% ammonium chloride and 1% ethylene glycol configuration, III to VII rats irrigation liquid, group I and group II rats filling the physiological sa