石墨烯納米金復(fù)合材料的無酶葡萄糖生物傳感器制備

1、石墨烯納米金復(fù)合材料的無酶葡萄糖生物傳感器制備摘要htss以抗壞血酸（aa）為還原劑，通 過同步還原法制得石墨烯/納米金復(fù)合材料。采用電化 學(xué)方法，構(gòu)建了一種基于石墨烯/納米金復(fù)合材料修飾 電極的無酶葡萄糖生物傳感器。實驗中，通過伏安法 考察了不同修飾電極在葡萄糖溶液中的電化學(xué)行為。 同時，探討了溶液中0h?_?離子強度、溶解氧、掃 描初始電位及石墨焼與納米金的比例對傳感器響應(yīng)特 性的影響。在優(yōu)化實驗條件下，采用線性掃描伏安法 檢測葡萄糖的線性范圍為0.120 mmol/l,檢出限為 1.6x10? 5? mol/l （s/n 二3）。對 1 mmol/l 葡萄糖 平行測定10次，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏

2、差為2.7%。實驗結(jié)果 表明，此傳感器具有較高的靈敏度、較好的重現(xiàn)性、穩(wěn) 定性及抗干擾能力。本方法可用于人血清樣品中葡萄 糖含量的測定，回收率為96.2%103.2%，結(jié)果令人 滿意。關(guān)鍵詞htss石墨烯；納米金（gnps）；葡萄 糖；無酶傳感器；電化學(xué)？1引言?葡萄糖的分析與檢測對人體的健康及疾病的診斷、 治療和控制有著重要意義，因此，葡萄糖傳感器的研 宄始終是化學(xué)與生物傳感器研宄的熱點之一。在諸多 類型的葡萄糖傳感器中，有關(guān)葡萄糖電化學(xué)傳感器的 研究較多?1,2?。常見的葡萄糖電化學(xué)傳感器主要分 為有酶和無酶兩種類型。有酶傳感器是基于酶對底物 的特異性識別功能，具有專一性及高度選擇性。然而

3、，由于酶的活性易受到周圍環(huán)境如溫度、濕度及化學(xué)環(huán) 境等因素的影響?3?，且固載的酶可能會泄漏，以致 影響傳感器的穩(wěn)定性及使用壽命，在一定程度上限制 了該類傳感器的應(yīng)用范圍。無酶葡萄糖傳感器是一種 基于葡萄糖分子在相關(guān)催化活性材料表面的電催化氧 化信號對其進行定性及定量檢測的傳感裝置。近年來， 一些具有催化性能的納米材料已被廣泛用于制備新型 的無酶葡萄糖傳感器，此類傳感器因制備簡單、穩(wěn)定 性好，可重復(fù)利用，價格低廉，能在無酶情況下直接 檢測葡萄糖，目前己成為葡萄糖電化學(xué)傳感器研宄領(lǐng)域的熱點?4?。kumiawan等?5?研究了金納米顆粒修飾的金電極與未修飾的金電極分別在堿性溶液中對 葡萄糖的響應(yīng)

4、情況，結(jié)果表明：在相同條件下，金納 米顆粒修飾的電極對葡萄糖的催化氧化電流高于未修 飾的金電極。俞建國等?6?采用電刻蝕法制得微鎳電極，利用堿性條件下葡萄糖在該修飾電極表面的電催 化氧化性質(zhì)，制備了新型抗干擾無酶葡萄糖微傳感器。 目前，基于金屬納米材料與碳納米管等碳基材料復(fù)合 物的無酶葡萄糖傳感器研宄多有報道?710?。石墨 烯作為一種具有二維結(jié)構(gòu)的新型碳基材料，因其具有 更大的比表面積及高電子傳導(dǎo)能力、原料易得且價格 便宜等優(yōu)點，已成為繼碳納米管后新一代的理想電極 修飾材料?11,12?。將其代替碳納米管等材料應(yīng)用到 無酶葡萄糖傳感器的制備尚未見報道。？本研究結(jié)合金納米顆粒與石墨烯的優(yōu)點，通

5、過同 步還原法制得石墨烯/納米金復(fù)合材料，再采用滴涂法 并利用nation的穩(wěn)定作用將該復(fù)合材料修飾在玻碳電 極表面，研制出一種高性能的無酶葡萄糖生物傳感器。 該傳感器可用于對臨床樣品的檢驗，具有靈敏度高， 選擇性和穩(wěn)定性好等特點。2實驗部分？2.1儀器與試劑？chi660d電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）；電 化學(xué)測量采用三電極系統(tǒng)：玻碳電極（？二3 mm） 或修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極（sce）為參比 電極，鉑絲電極為對電極；kq?100e型超聲清洗機（昆 山市超聲儀器有限公司）；bsz24s型分析天平（北京 賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；gl?16ii型離心機（上 海安亭科學(xué)儀器廠）

6、；5500型原子力顯微鏡（afm，美國安捷倫科技有限公司）。葡萄糖（上海生物工程有 限公司）；nation （5%, sigma?aldrich 公司）;納米級 石墨粉（40 nm）,抗壞血酸（aa），尿酸（ua），氯金 酸（阿拉丁試劑公司）；實驗所用試劑均為分析純，實 驗用水均為二次去離子水。？2.2石墨烯的合成？氧化石墨烯（go）的制備在hummers法?13?的基礎(chǔ)上進行了改進。即稱取1 g納米級石墨粉和0.5 gnano?3于250ml燒杯中，在冰浴中混合并攪拌，緩慢加入23 ml h?2so?4,控制溶液溫度在20 °c以下 在劇烈攪拌下加入3 g kmno?4,在冰浴中控

7、制溶液溫 度低于20 °c;隨后移去冰浴升溫到（35±3）°c，保持反應(yīng)30 min （在20 min后，液體變粘稠且有少量 氣體揮發(fā)）；然后將46 ml h?20緩慢加入到粘稠組分 中，攪拌（有大量氣泡產(chǎn)生，溫度會升到98 °c）;保 持溫度反應(yīng)15 min,隨后用溫水稀釋至140 ml，用3% h?2o?2還原過量的kmno?4,還原后溶液呈亮黃色。？以8000r/min離心lomin，移去上層清液，重復(fù) 3次；以4000 r/min離心5 min，取上層亮黃色氧化石 墨稀溶液；最后將氧化石墨儀還原，即得石墨爆產(chǎn)品， 產(chǎn)率約為10%。？2.3石墨烯/

8、納米金復(fù)合材料的制備？采用同步還原法制備石墨焼/納米金復(fù)合材料。首先將80?symbolma l5 mmol/l hauci?4•3h?2o 溶液與?20?symbolma l? 1.0 g/l go溶液混合；隨后加入800?symbolma l h?2o稀釋、并使之混合均勻，在超聲振蕩條件下加入100?symbolma l ?0.1 mol/l?抗壞血酸溶液，維持該條件反應(yīng)20 min,所得混合物于室溫下靜置48 h。 在復(fù)合材料的制備過程中，石墨烯表面含氧官能團的 數(shù)量對其與金納米顆粒間的連接起至關(guān)重要作 用?14?。未加入抗壞血酸前，go表面大量的含氧官 能團為au?

9、3 + ?在其表面的有效吸附提供了保證；加 入抗壞血酸后，go表面的au?3 + ?首先被還原成微 小的金核，隨后逐漸形成金納米顆粒，而g表面未 吸附有au?3 + ?的含氧官能團則直接被抗壞血酸還 原，最終得到穩(wěn)定的石墨烯/納米金復(fù)合材料。該復(fù)合 材料的原子力顯微鏡圖像（？圖1?）表明，所得的石 墨烯材料的厚度約為lnm,其上面負(fù)載納米金顆粒的 粒徑約為5nm。？ts (ht5” ss圖1石墨烯/納米金復(fù)合材料的 afm形貌圖？fig. 1 afm topography of grapheme (gr) /gold nanoparticle (gnps) nanocompsites ts)2

10、.4修飾電極的制備？將玻碳電極用ai?2o?3粉在拋光布上拋光，然后 依次用蒸餾水，無水乙醇和二次蒸餾水超聲清洗?1 min?。洗凈的電極再用二次蒸餾水沖洗，最后用n?2 吹干，備用。？實驗前將電極修飾材料(石墨烯、石墨烯/納米金 復(fù)合物)預(yù)先超聲分散30min，移取5?symbolma l懸浮液滴涂于已拋光好的玻碳電 極表面，置于紅外燈下干燥2 h，然后在修飾過的電極 表面滴5?symbolma l 1% nafion?乙醇溶液，置于室溫下晾干，即制得相應(yīng)材料修飾的玻碳電極。用伏安法測 定前，修飾電極需置于?k?3fe (cn) ?6?溶液中循環(huán) 掃描(電位掃描范圍一0.60.6 v,掃描速

11、率100mv/s)， 直到獲得重復(fù)性響應(yīng)且氧化還原峰電位差在80 mv以內(nèi)0 ?2.5實驗方法？實驗采用三電極體系，以naoh溶液作為支持電 解質(zhì)，加入適量葡萄糖溶液，分別采用循環(huán)伏安法和 線性掃描法進行測試。電位掃描范圍為一0.60.6 v (vs.sce)，掃描速率為100mv/s;電化學(xué)測量均在室 溫條件下進行。除特別說明，所有測試底液均通高純 氮氣20 min除氧，并在整個實驗過程中保持氮氣氣氛。3結(jié)果與討論？3.1葡萄糖在不同修飾電極上的電化學(xué)行為？將制得的石墨烯/納米金修飾電極、石墨稀修飾電 極及裸玻碳電極分別置于含0.01 mol/l葡萄糖的 naoh溶液進行循環(huán)伏安掃描，實驗前

12、未通n?2除氧， 結(jié)果如圖2所示。？ts (ht5” ss圖2葡萄糖在石墨烯/納米金修 飾電極(a)、石墨煤修飾電極(b)以及裸玻碳電極(c) 上的循環(huán)伏安曲線？fig. 2 cvs of glucose at gr/gnp/gce (a) , gr/gce (b) and bare gce (c) in 0.20 mol/l naoh solutionts)由圖2可知，葡萄糖在裸玻碳電極及石墨烯修飾電極上均無明顯電化學(xué)響應(yīng)，而在石墨烯/納米金修飾 電極上則可觀察到明顯的氧化還原信號。表明納米金 顆粒在無酶葡萄糖傳感器的構(gòu)建中具有產(chǎn)生電化學(xué)氧 化還原信號的重要作用。相對于裸玻碳電極，葡萄糖 在

13、石墨焼修飾電極上具有更高的背景電流，表明石墨 烯的高電子傳導(dǎo)能力可有效地增強修飾電極的信號強 度，進而提高傳感器的靈敏度。在石墨烯/納米金修飾 電極上，當(dāng)掃描電位由一0.60 v向?0.60 v變化時？，分 別在_0.30，0.08和0.35 v處觀察到3個氧化峰，其 中一0.30 v處的氧化峰歸因于葡萄糖的直接電化學(xué)氧 化，0.08 v的氧化峰對應(yīng)著葡萄糖氧化產(chǎn)物“葡萄糖 酸內(nèi)醋”的進一步氧化?15，16?，表明石墨稀/納米 金修飾電極對葡萄糖的電化學(xué)氧化具有良好的電催化 活性，0.35 v處的氧化峰對應(yīng)著在堿性條件下金氧化 物的形成?5?。在電位由0.60 v向？一0.60 v反向掃 描的

14、過程中？，在一0.04 v處可觀察到一個明顯的氧化 峰同時該峰在一0.3 v附近還伴有一個肩峰。位于？一 0.04? v處的氧化峰是由反向掃描過程中金氧化物被 還原后，葡萄糖的二次氧化產(chǎn)生的?17??？紤]到實 驗之前未進行通n?2除氧步驟，位于一0.3 v處的肩峰 是由于溶液中溶解氧的還原產(chǎn)生的?18?。介于？一 0.04? v處的氧化峰具有良好的峰形和顯著的峰電流，在隨后的實驗中將以該氧化峰的電流強度與葡萄糖的 濃度做工作曲線對葡萄糖進行定量分析。？3.2檢測條件對傳感器響應(yīng)特性的影響？ 3.2.1oh? ?離子強度的影響葡萄糖氧化電流的強度不僅與其自身的濃度有關(guān)，0h? ?濃度也是 重要的

15、影響因素。0h?_?的存在能夠使葡萄糖分子 更容易吸附于電極表面的石墨烯/納米金上，并降低了葡萄糖氧化的活化能?16?。本實驗將10?symbolma l 1 mol/l葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入10 ml 濃度為 0.02, 0.05, 0.10, ?0.20 和 0.30 mol/l 的 naoh底液中？，用循環(huán)伏安法考察了 oh? ?濃度對 葡萄糖氧化峰電流的影響（圖3）。？由圖3可知，隨著naoh濃度，即溶液中oh?_? 濃度的增加，葡萄糖的氧化峰電流逐漸增大，當(dāng)oh? 一?濃度高于0.20 mol/l時，峰電流隨底液濃度增加而 降低。因此，本實驗以0.20 mol/l naoh溶液作為葡

16、萄 糖電化學(xué)檢測的支持電解質(zhì)。？3.2.2溶解氧對傳感器的影響實驗中所配制的溶液在存放過程中均會溶解一定 量的氧氣，溶液中的溶解氧對測定有一定的影響。因此，本實驗采用通氮氣20 min除氧，然后在氮氣保護 氣氛下進行測定，以消除溶解氧的干擾。實驗結(jié)果如 圖4所示。？ts (ht5” ss圖4a.修飾電極在naoh支持電 解質(zhì)中未除氧(a)與除氧后(b)的循環(huán)伏安曲線；b.修飾電極在含葡萄糖的naoh溶液中未除氧(a)與除氧后(b)的循環(huán)伏安曲線？fig. 4 a. cvs of modified electrode in naoh supporting electrolyte solution

17、 without exclusion 0?2 (a) and with the exclusion of 0?2(b) ; b: cvs of modifiedelectrode in the naoh solution of glucose without exclusion 0?2 (a) and with the exclusion of o?2 (b) ts)由圖4可知，向樣品溶液中通氮氣20 min后，修 飾電極在naoh底液中的循環(huán)伏安曲線更加平整，在 含葡萄糖的naoh底液進行循環(huán)伏安掃描時，通氮氣 前位于一0.3 v處的肩峰消失，此結(jié)果進一步表明了原 一0.3 v處的肩峰與溶解

18、氧的還原有關(guān)。？3.2.3掃描初始電位對傳感器的影響線性掃描伏 安法是一種常見的定量分析手段，通過線性掃描的峰 電流與標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度之間的關(guān)系即可確定傳感器的 工作曲線。在線性掃描的過程中初始電位的正確選擇與否會直接影響到傳感器的檢測性能。本實驗在0.20 mol/lnaoh溶液中加入適量葡萄糖，使其最終濃度為 0.01 mol/l,并通過線性掃描伏安法測定了不同初始電 位對葡萄糖氧化峰電流的影響，實驗中掃描初始電位分別為 0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 和 0.8v，掃描終 止電位為_0.6v，掃描速率100mv/s，結(jié)果如圖5所示。?ts(ht5”ss圖 5 a.不同初始電

19、位下 0.01 mol/l 葡萄糖在0.2 mol/l naoh溶液中的反向線性掃描伏安(lsv)曲線；b. lsv的初始電位對葡萄糖氧化峰電 流的影響？fig. 5 a. linear scanning voltammetric (lsv) curves of 0.2 mol/l naoh solution containing 0.01 mol/l glucose with different initial ?potentials? in negative scans; b. effect of initial potentials of lsv on peak ?current? of

20、 glucose oxidationts)由圖5可知，隨著線性掃描初始電位的正移，響 應(yīng)電流呈先增大再減小的變化趨勢，在掃描初始電位 為0.6 v處傳感器的響應(yīng)電流達到最大值，即在該初始 電位下該傳感器的靈敏度最高，因此，本實驗以0.6 v 作為線性掃描初始電位。？3.2.4石墨烯與納米金的比例對傳感器的影響在石墨烯/納米金復(fù)合材料的制備過程中，固定？5 mmol/l? hauci?4•3h?2o 溶液與 1.0 g/lgo溶液的總體積為100?symbolma l，改變兩者的體積比分別為1 : 9, 2 : 8, 3 : 7, 4 : 6, 5 : 5, 6 : 4、7

21、: 3, 8 : 2, 9 : 1,制得不同 石墨烯/納米金比例的復(fù)合材料，在上述優(yōu)化條件下 對?0.01mol/l?葡萄糖進行線性掃描伏安法測定，葡 萄糖氧化峰電流與 v(hauci?4•3h?2?o : v(go) 的關(guān)系見圖6。ts (ht5” ss圖 6hauci?4•3h?2oz go的比例與葡萄糖氧化峰電流的關(guān)系？fig. 6 relationship between the ratio of hauci?4•3h?2o and graphene oxide (go) and the peak currents of gl

22、ucose oxidationts)由圖6可知，隨著混合物中 hauci?4•3h?2o比例的增加，葡萄糖在修飾電極表面的氧化峰電流強度逐漸增加。當(dāng)兩者體積比達 到8 : 2時，峰電流達到最大值，之后呈微弱的下降趨 勢。即在原料比為8 : 2時得到的復(fù)合材料修飾電極可 使傳感器獲得最大電流響應(yīng)，故最終選用該復(fù)合材料修飾電極構(gòu)建無酶葡萄糖生物傳感器。？3.3線性檢測范圍及檢出限？在上述選定的最佳實驗條件下，用線性掃描伏安法測定葡萄糖的氧化峰電流與濃度之間的關(guān)系。傳感 器的線性范圍為0.120 mmol/l；線性回歸方程為y?symbolma a） = 2.4544+0.665

23、9x （mmol/l）, 相關(guān)系數(shù)為0.9994；其檢出限為1.6x10?_5?mol/l （s/n = 3），？5次平行實驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（rsd）在 2%5%之間？，表明方法重現(xiàn)性良好。本傳感器具有 較寬的線性范圍和較低的檢出限，其性能可與無酶葡 萄糖傳感器相媲美。由于正常人體內(nèi)的葡萄糖含量在3.0?8.0 mmol/l范圍內(nèi)？?19?，本傳感器可滿足人血清樣品中葡萄糖含量測定的要求。曇3.4傳感器的選擇性？在實際樣品測定時，一些葡萄糖共存物可能對測 定會產(chǎn)生影響。本實驗對可能產(chǎn)生干擾的物質(zhì)，如尿 酸（ua），抗壞血酸（aa）等，進行了干擾測試。據(jù) 文獻21報道，健康人血清中的ua與aa的

24、含量分別 是 0.02 和?0.1 mmol/l?,在含 5 mmol/l 葡萄糖的 0.2 mol/l naoh溶液中分別加入0.2 mmol/l ua和？1.0mmol/l?aa后，葡萄糖氧化峰電流分別增加了 1.3%和2.6%,表明ua和aa的加入對葡萄糖的測定幾乎 不產(chǎn)生影響。這主要是由于修飾電極表面的nafion膜 具有排斥中性分子和陰離子的能力，從而可以選擇性 地透過某些電活性物?22?。在堿性條件下，ua和 aa均為明離子，被nation陽離子交換膜擋在傳感器 外，有效阻止了 ua和aa向電極表面擴散，因而可有 效消除這些電活性物質(zhì)的干擾。？3.5傳感器的重復(fù)性及穩(wěn)定性？在優(yōu)化實

25、驗條件下使用同一支修飾電極對葡萄糖 濃度為1 mmol/l的溶液重復(fù)測定10次，電流氧化峰 電流平均值為3.47?symbolma a,其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%。實驗 后將傳感器于4 °c下懸于0.2 mol/l naoh溶液中保存， 每天檢測一次，10 d后電極的響應(yīng)信號為初始的 87.4%。表明該傳感器具有較好的穩(wěn)定性。這主要是由 于石墨烯/納米金修飾電極表面所滴涂的nafion膜可 防止電極修飾材料在溶液中脫落，進而提高了傳感器 的穩(wěn)定性。？3.6血清中葡萄糖的檢測？分別取1.0 ml血清樣品（商丘市中心醫(yī)院提供），用0.2 mol/l naoh溶液稀釋至10.0 ml,按上述

26、方法測定；同時，為了進一步考察此修飾電極的實用性，與 常用市售血糖檢測儀進行了測試比較。結(jié)果見表1。 連續(xù)測定5次，3份樣品的分析結(jié)果的rsd均小于3%， 樣品加標(biāo)回收率在96.2%103.2%之間，本方法13.81?a、4.3?b, 4.9?c0.50022.07?al03.2?a 27.42?a、8.0?b, 7.6?c0.5004.33?a97.6?a 317.26?az 18.2?bz 17.6?c0.50012.30?a96.2?a bhdfg 3 *2,wkzq0w a.本方法，b.羅氏卓越型血糖儀，c.強生穩(wěn)豪倍優(yōu)型血糖儀(a. the present method; b: by

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