CCK-8操作說明與檢測(cè)步驟

1、DOJINDC操作說明細(xì)胞活性檢測(cè)1 在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100 ml /孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng) （在37 C, 5% CC2的條件下）。2. 向每孔加入10 ml的CCK- 8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響 C.D值的讀數(shù)）。3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。4用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。5. 如果暫時(shí)不測(cè)定C.D值，打算以后測(cè)定的話，可以向每孔中加入10 ml 0.1 M HCI溶液或者1% w/vSDS容液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時(shí) 內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)1在96孔板中配制100 ml的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)

2、箱預(yù)培養(yǎng)24小時(shí) （在37 C , 5% CO2的條件下）。2. 向培養(yǎng)板加入10 ml不同濃度的待測(cè)物質(zhì)。3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（例如：6,12, 24 或 48 小時(shí)）。4向每孔加入10 ml CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響O.D 值的讀數(shù)）。5. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。6. 用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。7. 如果暫時(shí)不測(cè)定O.D值，打算以后測(cè)定的話，可以向每孔中加入10 ml 0.1M HCI溶液或者1 % w/vSDS容液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在 24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可

3、在加 CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng) 基，去掉藥物的影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng) 基中加入藥物后的空白吸收即可。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線1. 先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞。2. 按比例（例如：比例）依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做3-5個(gè)細(xì)胞濃 度梯度，每組3-6個(gè)復(fù)孔。3接種后培養(yǎng)2-4小時(shí)使細(xì)胞貼壁，然后加CCK-8式劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)定 O.D值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)（X軸），O.D值為縱坐標(biāo)（Y軸）的標(biāo)準(zhǔn)曲 線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測(cè)定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量（使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提條件 是實(shí)驗(yàn)的條件要一致，便于確定細(xì)胞的

4、接種數(shù)量以及加入CCK-8后的培養(yǎng)時(shí)間）。 DOJINDO僉測(cè)步驟CCK-8僉測(cè)步驟1 向各孔中加入100"細(xì)胞懸液。a）2在37C下預(yù)孵育培養(yǎng)板。b）3. 向各孔中加入各濃度的待測(cè)溶液c） 10"1 °4. 37C下孵育。5向各孔中加入10"的CCK-8溶液d）。6. 37C下孵育1-4小時(shí)。e）7測(cè)定450 nm處的OD值a）使用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基制備50,000-100,000個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。b）建議使用CO2培養(yǎng)箱過夜預(yù)培養(yǎng)。c）使用培養(yǎng)基或PBS來制備溶液。d）如果待測(cè)溶液有還原性，測(cè)定不含細(xì)胞，但含有CCK-8的待測(cè)溶液在450nm處的空白吸光

5、度。如果該吸光度很小，則可以直接加入CCK-8如果吸光度相對(duì)較大，則需要除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的 100" 培養(yǎng)基和10" CCK-8進(jìn)行檢測(cè)。e）白細(xì)胞可能需要培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間?；盍τ?jì)算細(xì)胞活力* （%）二:A （加藥）-A （空白）/ A （0加藥）-A （空白）X 100 （加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度A （空白）：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度A （ 0加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度*細(xì)胞活力：細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力問答：1 一個(gè)xx接種多少個(gè)細(xì)胞?當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，

6、貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000個(gè)/孔（100"培養(yǎng)基）。檢測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于 2,500個(gè)/孔（100 "I培養(yǎng)基）。如果要使用24孔板或6孔板實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種 量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。2. 能否用384孔板進(jìn)行試驗(yàn)？可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8體積 太少，可以先將CCK-8溶液稀釋1倍，然后加入培養(yǎng)基體積20%的量。3. 能否用24孔板進(jìn)行試驗(yàn)?可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液。4. 酚紅會(huì)影響檢測(cè)嗎？不會(huì)。培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在

7、計(jì)算時(shí)，通過扣除空白孔中本底的吸光度而 消去，因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。5. CCK-8與胸莒結(jié)合檢測(cè)之間是否有相尖性？有。然而，請(qǐng)注意由于CCK-8使用的檢測(cè)原理與胸背檢測(cè)的不同，因此結(jié)果可 能不同。6. CCK-8能否檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞？可以檢測(cè)E.coli,但不能檢測(cè)酵母細(xì)胞。向100 "E.coli培養(yǎng)液中加入10 “ CCK-8 溶液，并培養(yǎng)1-4個(gè)小時(shí)或過夜。7. CCK-8穩(wěn)定嗎？CCK-8在05C下能夠保存至少6個(gè)月，在-20 C下避光可以保存1年。如果需 要長(zhǎng)期保存，我們推薦-20C的儲(chǔ)藏條件。8如果沒有450 nm的濾光片，還可以使用哪些其他濾光片？還可使用450 nm到

8、490 nm之間的濾光片。9如何減少由于CCK-8式劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來的誤差？可以在加樣前用培養(yǎng)基稀釋CCK-8式劑并混勻后加樣。10. CCK-8是什么顏色？應(yīng)該是粉紅色。若顏色不一樣，有可能會(huì)影響測(cè)定。11 CCK8能否對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色?不能。因?yàn)镃CK8的主要成分是一種水溶性的四口坐鹽（WST8,并通過電子載 體 IMethoxy PMS將活細(xì)胞中的電子交換到培養(yǎng)基中的WST8上。由于生成的甲d也是 高度水溶性的，因此CCK8不能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。12. CCK8僉測(cè)溶液對(duì)細(xì)胞是否有毒?CCK8容液自身因?yàn)楦邼舛鹊腎Methoxy PMS的存在而具有一點(diǎn)毒性。但是，加 到培養(yǎng)基

9、中的CCK8是沒有毒性的，因?yàn)楸幌♂屃?10倍。因此，長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，如 過夜或者培養(yǎng)數(shù)天是可以的。同一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)液在CCK8僉測(cè)后還可以用于其他細(xì)胞增殖檢測(cè)，如結(jié)晶紫檢測(cè)，中1生紅檢測(cè)或者DNA熒光檢測(cè)等。由于每種細(xì)胞對(duì)于CCK8的耐受力都不同，因此在需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)，先檢測(cè)一 下細(xì)胞在加入CCK8培養(yǎng)后的活力。13. 在做加藥實(shí)驗(yàn)時(shí)，藥物對(duì)測(cè)定是否有影響？如何解決？有時(shí)會(huì)有影響。如果藥物具有還原性，會(huì)和CCK8發(fā)生顯色反應(yīng)，增加吸光 度。解決辦法：首先要確認(rèn)藥物是否有吸收，在含有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8測(cè)定450 nm的 吸光度，如果它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基（加CCK8的吸光度高，

10、則證明藥物 有影響，可在加CCK8之前更換培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。14. 每次測(cè)定的數(shù)值不一樣，是什么原因？如何解決?可能會(huì)有以下幾個(gè)原因：1 當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易 干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不 作為測(cè)定孔用。2有可能會(huì)因?yàn)镃CK8占在壁上而產(chǎn)生誤差，建議在加入CCK8后， 輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。3每孔的細(xì)胞數(shù)量過多或過少。請(qǐng)預(yù)先在 1,000100,000個(gè)/孔范圍內(nèi)摸索條件。15. 如何設(shè)定空白對(duì)照？在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入CCK8培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450 nm的吸光度即 為空白對(duì)照。在做加藥實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)）時(shí)

11、，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在不含細(xì)胞，加 入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450 nm的吸光度作為空白對(duì) 昭。八、16. 哪些物質(zhì)會(huì)影響CCK8的測(cè)定？當(dāng)有還原性物質(zhì)存在時(shí)會(huì)影響CCK8的測(cè)定，例如含有維生素C的Glucose等 （一般培養(yǎng)基中的量不多，酚紅或血清不影響測(cè)定）。在有酚紅存在的情況下，會(huì) 增加空白吸收，但不影響測(cè)定，扣除空白吸收即可。17. 在實(shí)驗(yàn)中吸光度值太高，如果不能減少細(xì)胞數(shù)量，如何解決？可以縮短加入CCK8后的培養(yǎng)時(shí)間。例如：可以把加入CCK8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間由2小時(shí)縮短為1小時(shí)。18設(shè)定參比波長(zhǎng)的目的是什么？必須設(shè)定嗎？不一定要設(shè)定。CCK-8式劑在參比波

12、長(zhǎng)沒有吸光度。設(shè)定參比波長(zhǎng)的目的是為 了取出由于樣品混濁所帶來的吸收。19說明書上僅寫了 96孔板的測(cè)定方法，如果使用24孔板貨12孔板，應(yīng)該 加多少量CCK-8試劑？一般情況下建議加入CCK-8試劑的量是培養(yǎng)基體積的1/10 ° 2O.ft CCK-8顯色 過程中，如何終止反應(yīng)？有一下幾種方法（96孔板）：1、在顯色反應(yīng)后，將培養(yǎng)板放置4C冰箱內(nèi)。2、每孔加10卩10.1 MHC溶液。3、每孔加10 "1% （w/v）的SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液。注意：7/8反應(yīng)停止后'應(yīng)在24小時(shí)之內(nèi)測(cè)定。21. 必須預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞嗎？不一定。如果要向保持細(xì)胞的最好狀態(tài)，建議預(yù)培

13、養(yǎng)細(xì)胞。如果不做細(xì)胞預(yù)培 養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶可能會(huì)不穩(wěn)定。也有人不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)，但在做標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè) 時(shí)需要統(tǒng)一檢測(cè)條件。22. 如果加入的藥物中含有金屬，是否會(huì)有影響？金屬對(duì)CCK-8顯色有影響。當(dāng)終濃度為1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì) 抑制5%、15% 90%的顯色反應(yīng)，使靈敏度降級(jí)。如果終濃度是10 Mm的話，將會(huì) 100%抑制。23. CCK-8試劑的保存條件？在避光條件下CCK-8試劑在4C可保存一年。如果需要保存較長(zhǎng)時(shí)間的話，推 薦在-20C下保存。但是CCK-8若反復(fù)解凍和冰凍將會(huì)增加空白吸收，從而影響檢測(cè) 結(jié)果，若經(jīng)常使用可將試劑存放在4C冰箱內(nèi)保存。24. 預(yù)培養(yǎng)后，更

14、換培養(yǎng)基需要細(xì)胞計(jì)數(shù)嗎？一般情況下用胰蛋白酶處理對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)盤計(jì)數(shù)，制備成一定 濃度的細(xì)胞懸液即可。如果想要精密計(jì)數(shù)細(xì)胞的話，可以預(yù)培養(yǎng)后取培養(yǎng)基用血球計(jì) 數(shù)盤進(jìn)行計(jì)數(shù)。25. CCK-8對(duì)于不同的細(xì)胞，靈敏度是否一樣?不一樣，懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難染色。對(duì)于貼壁細(xì)胞，一般加入CCK-8 培養(yǎng)1-4小時(shí)吸光度已經(jīng)很高，但對(duì)于懸浮細(xì)胞則可能吸光度較低，可以通過延長(zhǎng) CCK-8的加入時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量來解決。26. 懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞在數(shù)量上有何區(qū)別？懸浮細(xì)胞由于染色比較困那，一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。貼 壁細(xì)胞染色比較容易，若細(xì)胞數(shù)量過大，有時(shí)吸光度會(huì)超過酶標(biāo)儀的讀數(shù)。27. 應(yīng)該每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎？建議每次做。雖然細(xì)胞是一樣的，但是細(xì)胞的狀態(tài)不一定一樣，對(duì)于狀態(tài) 不一樣 的細(xì)胞，建議每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果試劑的批號(hào)不一樣，靈敏度可能會(huì) 有輕微的差 異，對(duì)于不同的批號(hào)建議分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線。28有時(shí)在藥物作用情況下，細(xì)胞已經(jīng)死 亡，但是脫氫酶的活