菌種選育方法2

1、1生物工藝學(xué)生物工藝學(xué)2 菌種選育(2)22.2 菌種選育菌種選育主要內(nèi)容主要內(nèi)容n自然選育自然選育n誘變育種誘變育種n抗噬菌體菌株的選育抗噬菌體菌株的選育n雜交育種雜交育種n原生質(zhì)體融合技術(shù)原生質(zhì)體融合技術(shù)nDNA重組技術(shù)重組技術(shù)n菌種保藏菌種保藏3n經(jīng)典育種經(jīng)典育種：n自然選育自然選育n誘變育種誘變育種n帶有一定的盲目性，尚屬于經(jīng)典育種的范疇。帶有一定的盲目性，尚屬于經(jīng)典育種的范疇。n定向育種定向育種：n轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、原生質(zhì)體融合、代謝調(diào)控和基因工程等較轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、原生質(zhì)體融合、代謝調(diào)控和基因工程等較為定向的育種方法。為定向的育種方法。n國內(nèi)這些方法成功地用在生產(chǎn)上的例子較少，發(fā)達(dá)國家比較普

2、遍國內(nèi)這些方法成功地用在生產(chǎn)上的例子較少，發(fā)達(dá)國家比較普遍育種方法育種方法42.2.1 自然選育自然選育n自然選育自然選育n自然突變自然突變n自然分離自然分離51 自然選育自然選育n自然選育：自然選育：不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自然突變不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自然突變(spontaneous Mutation)而進(jìn)行菌種篩選的過程叫做自然選育。而進(jìn)行菌種篩選的過程叫做自然選育。n自然突變：自然突變：是指某些微生物在沒有人工參與下所發(fā)生的那是指某些微生物在沒有人工參與下所發(fā)生的那些突變。些突變。n自然突變的原因自然突變的原因n自然突變的頻率自然突變的頻率n正突變和負(fù)突變正突變和負(fù)突變62 自然

3、突變的原因自然突變的原因n多因素低劑量的誘變效應(yīng)多因素低劑量的誘變效應(yīng)n多因素低劑量的誘變效應(yīng)：由一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變因素引起的長(zhǎng)期綜合效應(yīng)，例如充滿宇宙空間的各種短波輻射、自然界中普遍存在的一些低濃度誘變物質(zhì)以及微生物自身代謝活動(dòng)中所產(chǎn)生的一些誘變物質(zhì)(如過氧化氫)的作用等。 n互變異構(gòu)效應(yīng)互變異構(gòu)效應(yīng)7n四種堿基的第六位上的酮基和氨基，胸腺嘧啶四種堿基的第六位上的酮基和氨基，胸腺嘧啶(T)和鳥嘌呤和鳥嘌呤(G)可以酮式或烯醇式出現(xiàn)，胞嘧啶可以酮式或烯醇式出現(xiàn)，胞嘧啶(C)和腺瞟呤和腺瞟呤(A)可以氨可以氨基式或亞氨基式出現(xiàn)。平衡一般傾向于酮式和氨基式，因基式或亞氨基式出現(xiàn)。平衡一般傾向

4、于酮式和氨基式，因此，在此，在DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中以雙鏈結(jié)構(gòu)中以AT和和GC堿基對(duì)為主。堿基對(duì)為主。 n可是在偶然情況下可是在偶然情況下T也會(huì)以稀有的烯醇式形式出現(xiàn)，因而也會(huì)以稀有的烯醇式形式出現(xiàn)，因而在在DNA復(fù)制到達(dá)這一位置的一瞬間，通過復(fù)制到達(dá)這一位置的一瞬間，通過DNA多聚酶的作多聚酶的作用，在它的相對(duì)位置上就不出現(xiàn)用，在它的相對(duì)位置上就不出現(xiàn)A而出現(xiàn)而出現(xiàn)G。n如果如果C以稀有的亞氨基形式出現(xiàn)，在新合成的以稀有的亞氨基形式出現(xiàn)，在新合成的DNA單鏈的單鏈的相對(duì)位置上就將是相對(duì)位置上就將是A而不是而不是G。89間接引起置換的誘變劑間接引起置換的誘變劑: 5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5-BU）

5、n5-BU是是T的代謝類似物。當(dāng)把某一微生物培養(yǎng)在含的代謝類似物。當(dāng)把某一微生物培養(yǎng)在含5-BU的培的培養(yǎng)液中時(shí)，細(xì)胞中有一部分新合成的養(yǎng)液中時(shí)，細(xì)胞中有一部分新合成的DNA的的T就被就被5-BU所取所取代。代。5-BU一般以酮式狀態(tài)存在于一般以酮式狀態(tài)存在于DNA中中，因而仍可正常地，因而仍可正常地與與A配對(duì)，這時(shí)并未發(fā)生堿基對(duì)的轉(zhuǎn)換。配對(duì)，這時(shí)并未發(fā)生堿基對(duì)的轉(zhuǎn)換。有時(shí)有時(shí)5-BU會(huì)以烯醇會(huì)以烯醇式狀態(tài)出現(xiàn)在式狀態(tài)出現(xiàn)在DNA中，于是當(dāng)中，于是當(dāng)DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，在其相對(duì)進(jìn)行復(fù)制時(shí)，在其相對(duì)位置上出現(xiàn)的就是位置上出現(xiàn)的就是G，而不是原來的而不是原來的A，因而引起了堿基對(duì)因而引起了堿基對(duì)從原

6、來的從原來的AT變至變至GC的轉(zhuǎn)換。的轉(zhuǎn)換。105-BU在以酮式或烯醇式狀態(tài)存在時(shí)引起在以酮式或烯醇式狀態(tài)存在時(shí)引起的的ATGC的轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)換n A:T G:Cn A:T A:Buk G:Bue G:Cn G:Bue A:T G:C A:Bukn A:BU G:C A:T A:BU11堿基的置換堿基的置換 直接引起置換的誘變劑直接引起置換的誘變劑HNO2CNH2腺嘌呤CO次黃嘌呤(Hk)A.THe.THk. THk. CA.THk. CG. CCOH次黃嘌呤(He)12n大量統(tǒng)計(jì)分析后，發(fā)現(xiàn)大量統(tǒng)計(jì)分析后，發(fā)現(xiàn)堿基對(duì)發(fā)生自然突變的機(jī)率約為堿基對(duì)發(fā)生自然突變的機(jī)率約為10-8-10-9。n自然突變

7、有兩種情況：自然突變有兩種情況：n一種是生產(chǎn)上所不希望有的，表現(xiàn)為菌種的衰退和生產(chǎn)一種是生產(chǎn)上所不希望有的，表現(xiàn)為菌種的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量的下降，稱為質(zhì)量的下降，稱為負(fù)突變負(fù)突變；n另一種是對(duì)生產(chǎn)有益的，表現(xiàn)為菌株生產(chǎn)性能的上升，另一種是對(duì)生產(chǎn)有益的，表現(xiàn)為菌株生產(chǎn)性能的上升，稱為稱為正突變正突變。自然突變的頻率，正突變和負(fù)突變自然突變的頻率，正突變和負(fù)突變133 自然分離自然分離n自然分離自然分離:生產(chǎn)菌株經(jīng)過一定時(shí)期的使用后須純化，生產(chǎn)菌株經(jīng)過一定時(shí)期的使用后須純化，淘汰衰退的；保存優(yōu)良的菌種。淘汰衰退的；保存優(yōu)良的菌種。n從高生產(chǎn)水平批號(hào)中取樣進(jìn)行單菌落分離，從中選出比從高生產(chǎn)水平批號(hào)中取樣

8、進(jìn)行單菌落分離，從中選出比較穩(wěn)定的菌株，用于生產(chǎn)。較穩(wěn)定的菌株，用于生產(chǎn)。n突變株自然分離突變株自然分離:經(jīng)誘變的突變株會(huì)繼續(xù)發(fā)生變異。經(jīng)誘變的突變株會(huì)繼續(xù)發(fā)生變異。其結(jié)果往往導(dǎo)致菌株不同類型的比例的改變，其結(jié)果往往導(dǎo)致菌株不同類型的比例的改變，而低而低單位菌株在傳代過程中往往占優(yōu)勢(shì)，單位菌株在傳代過程中往往占優(yōu)勢(shì)，必須進(jìn)行自然必須進(jìn)行自然分離。分離。14n自然選育簡(jiǎn)單易行，可以純化菌種，防止菌種衰退、穩(wěn)定生自然選育簡(jiǎn)單易行，可以純化菌種，防止菌種衰退、穩(wěn)定生產(chǎn)、提高產(chǎn)量。產(chǎn)、提高產(chǎn)量。n缺點(diǎn)是效率低、進(jìn)展慢。自然選育和誘變育種交替使用，效果好。缺點(diǎn)是效率低、進(jìn)展慢。自然選育和誘變育種交替使用

9、，效果好。n自然選育自然選育(自然分離自然分離)的一般程序的一般程序n把菌種制備成單孢子懸浮液，經(jīng)過適當(dāng)?shù)南♂屢院螅诠腆w平板上把菌種制備成單孢子懸浮液，經(jīng)過適當(dāng)?shù)南♂屢院?，在固體平板上進(jìn)行分離，挑取部分單菌落進(jìn)行生產(chǎn)能力的測(cè)定，經(jīng)反復(fù)篩選，以進(jìn)行分離，挑取部分單菌落進(jìn)行生產(chǎn)能力的測(cè)定，經(jīng)反復(fù)篩選，以確定生產(chǎn)能力更高的菌株代替原來的菌株。確定生產(chǎn)能力更高的菌株代替原來的菌株。 152.2.2 誘變育種誘變育種 n誘變育種的基本原理誘變育種的基本原理n誘變育種的一般步驟誘變育種的一般步驟 n誘變育種工作中幾個(gè)應(yīng)該注意的問題誘變育種工作中幾個(gè)應(yīng)該注意的問題n幾種物理、化學(xué)誘變劑的使用方法幾種物理、

10、化學(xué)誘變劑的使用方法161 誘變育種的基本原理誘變育種的基本原理n誘變育種的理論基礎(chǔ)是基因突變，所謂突變是指由于染誘變育種的理論基礎(chǔ)是基因突變，所謂突變是指由于染色體和基因本身的變化而產(chǎn)生的遺傳性狀的變異。色體和基因本身的變化而產(chǎn)生的遺傳性狀的變異。n染色體畸變和基因突變。染色體畸變和基因突變。n染色體畸變（染色體畸變（chromosomal aberration)：是指染色體或是指染色體或DNA片斷的插入（片斷的插入（insertion)、缺失缺失(deletion)、易位易位(translocation)、倒位倒位(inversion)、重復(fù)重復(fù)(duplication)等。等。n基因突變

11、基因突變(gene mutation)：是指是指DNA分子結(jié)構(gòu)中的一對(duì)分子結(jié)構(gòu)中的一對(duì)或幾對(duì)堿基發(fā)生變化或幾對(duì)堿基發(fā)生變化(又稱點(diǎn)突變又稱點(diǎn)突變)。17倒置易位缺失點(diǎn)突變18突變發(fā)生的原因突變發(fā)生的原因n可分為自然突變和誘發(fā)突變?？煞譃樽匀煌蛔兒驼T發(fā)突變。n自然突變自然突變是指在自然條件下出現(xiàn)的基因突變是指在自然條件下出現(xiàn)的基因突變n誘發(fā)突變誘發(fā)突變是指用各種物理、化學(xué)因素人工誘發(fā)的基因突是指用各種物理、化學(xué)因素人工誘發(fā)的基因突變。變。n誘變因素有物理的、化學(xué)的和生物的三大類，見誘變因素有物理的、化學(xué)的和生物的三大類，見表表6-1。19常用誘變劑及其類別常用誘變劑及其類別 20n從從Watso

12、n和和Crick的的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型中可看出，雙螺旋結(jié)構(gòu)模型中可看出，雖然兩條單鏈之間的堿基雖然兩條單鏈之間的堿基受著互補(bǔ)規(guī)律的制約受著互補(bǔ)規(guī)律的制約(即即A必須和必須和T，C必須和必須和G配對(duì)配對(duì))，但就一條單鏈來說四種堿但就一條單鏈來說四種堿基的排列順序是不受限制基的排列順序是不受限制的。的。nDNA的多樣性即堿基排列的多樣性即堿基排列方式的多樣性是遺傳性千方式的多樣性是遺傳性千差萬異的內(nèi)在原因。差萬異的內(nèi)在原因。21222 誘變育種的一般步驟誘變育種的一般步驟 n誘變育種整個(gè)流程主要是誘變育種整個(gè)流程主要是誘變誘變和和篩選篩選兩部分。兩部分。n誘變：誘變：包括由出發(fā)菌株開始，制出新鮮

13、孢子懸浮包括由出發(fā)菌株開始，制出新鮮孢子懸浮液液 （或細(xì)菌懸液）經(jīng)過誘變處理以后以一定稀釋（或細(xì)菌懸液）經(jīng)過誘變處理以后以一定稀釋涂平板，至平板上長(zhǎng)出單菌落等各步驟。涂平板，至平板上長(zhǎng)出單菌落等各步驟。n誘發(fā)所形成的突變與菌種本身的遺傳背景、誘誘發(fā)所形成的突變與菌種本身的遺傳背景、誘變劑種類及其劑量的選擇和合理使用方法均有變劑種類及其劑量的選擇和合理使用方法均有密切關(guān)系。密切關(guān)系。23誘變育種誘變育種n篩選：篩選：包括經(jīng)單孢子分離長(zhǎng)出單菌落后隨機(jī)挑包括經(jīng)單孢子分離長(zhǎng)出單菌落后隨機(jī)挑至斜面，經(jīng)至斜面，經(jīng)初篩和復(fù)篩初篩和復(fù)篩進(jìn)行生產(chǎn)能力測(cè)定和菌進(jìn)行生產(chǎn)能力測(cè)定和菌種保存種保存(即將篩選出來的高產(chǎn)菌

14、種保藏好即將篩選出來的高產(chǎn)菌種保藏好)。n誘變育種的整個(gè)過程主要是誘變和篩選的不斷誘變育種的整個(gè)過程主要是誘變和篩選的不斷重復(fù)，直到獲得比較理想的高產(chǎn)菌株。重復(fù)，直到獲得比較理想的高產(chǎn)菌株。24誘變育種的一般步驟誘變育種的一般步驟253 誘變育種應(yīng)該注意的問題誘變育種應(yīng)該注意的問題n選擇好出發(fā)菌株：選擇好出發(fā)菌株：產(chǎn)量高、對(duì)誘變劑敏感性大、變異幅產(chǎn)量高、對(duì)誘變劑敏感性大、變異幅度廣。度廣。n復(fù)合誘變因素的使用復(fù)合誘變因素的使用：對(duì)野生型菌株，單一誘變因素有對(duì)野生型菌株，單一誘變因素有時(shí)也能取得好的效果，但對(duì)老菌種，單一誘變因素重復(fù)使用時(shí)也能取得好的效果，但對(duì)老菌種，單一誘變因素重復(fù)使用突變的效

15、果不高，這時(shí)可利用復(fù)合因素來擴(kuò)大誘變幅度，提突變的效果不高，這時(shí)可利用復(fù)合因素來擴(kuò)大誘變幅度，提高誘變效果。高誘變效果。n劑量選擇：劑量選擇：凡既能增加變異幅度又能促使變異向正變范圍凡既能增加變異幅度又能促使變異向正變范圍移動(dòng)的劑量就是合適的劑量。移動(dòng)的劑量就是合適的劑量。n變異菌株的篩選：變異菌株的篩選：營養(yǎng)缺陷型、抗反饋抑制營養(yǎng)缺陷型、抗反饋抑制/阻遏、組成阻遏、組成型型n高產(chǎn)菌株的篩選需要篩選條件的配合高產(chǎn)菌株的篩選需要篩選條件的配合264 誘變劑的使用方法誘變劑的使用方法 l紫外線l快中子l氮芥l亞硝酸lN甲基-N硝基N亞硝，基胍(NTG)27A 紫外線紫外線n紫外線的輻射光源便宜，危

16、險(xiǎn)性小，誘變效果好，應(yīng)用紫外線的輻射光源便宜，危險(xiǎn)性小，誘變效果好，應(yīng)用最廣泛。最廣泛。n對(duì)誘變最有效的波長(zhǎng)僅僅是對(duì)誘變最有效的波長(zhǎng)僅僅是260nm左右左右(253265 nm) 一一般誘變時(shí)用菌般誘變時(shí)用菌(孢子孢子)懸浮液進(jìn)行處理，紫外燈的功率為懸浮液進(jìn)行處理，紫外燈的功率為15W，距離固定在距離固定在30cm左右。左右。n紫外線的作用機(jī)制：紫外線的作用機(jī)制：主要是形成主要是形成胸腺嘧啶二聚體胸腺嘧啶二聚體以改變以改變DNA生物活性，造成菌體死亡和變異。生物活性，造成菌體死亡和變異。28紫外線對(duì)紫外線對(duì)DNA的損傷的損傷n對(duì)紫外線來說，嘧啶要比嘌呤敏感得多。嘧啶的光化產(chǎn)物主對(duì)紫外線來說，嘧

17、啶要比嘌呤敏感得多。嘧啶的光化產(chǎn)物主要是二聚體和水合物。要是二聚體和水合物。紫外線的主要作用是使同鏈紫外線的主要作用是使同鏈DNADNA的相的相鄰嘧啶間形成共價(jià)結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體鄰嘧啶間形成共價(jià)結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體。n二聚體的出現(xiàn)會(huì)減弱雙鏈間氫鍵的作用，并引起雙鏈結(jié)構(gòu)發(fā)二聚體的出現(xiàn)會(huì)減弱雙鏈間氫鍵的作用，并引起雙鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲變形，阻礙堿基間的正常配對(duì)，從而有可能引起突變生扭曲變形，阻礙堿基間的正常配對(duì)，從而有可能引起突變或死亡。或死亡。n在互補(bǔ)雙鏈間形成嘧啶二聚體的機(jī)會(huì)較少。但一旦形成，就在互補(bǔ)雙鏈間形成嘧啶二聚體的機(jī)會(huì)較少。但一旦形成，就會(huì)妨礙雙鏈的解開，因而影響了會(huì)妨礙雙鏈的解開，因而

18、影響了DNADNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，并使細(xì)的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，并使細(xì)胞死亡。胞死亡。2930紫外- NaNO2復(fù)合誘變育種復(fù)合誘變育種優(yōu)勢(shì)菌群紫外線輻射NaNO2處理馴化培養(yǎng)正突變菌株 性狀菌株氧化活性/LO2L-1min-1比生長(zhǎng)速率/h-1傳代時(shí)間/h在礦物表面吸附平衡時(shí)間/h原始菌0.10.130.058- 0.1166122428改良菌0.91.10.1783.917改良菌的性狀遠(yuǎn)優(yōu)于原始菌改良菌的性狀遠(yuǎn)優(yōu)于原始菌31紫外線對(duì)紫外線對(duì)枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌BF7658的誘變效應(yīng)的誘變效應(yīng)n菌懸液的制備菌懸液的制備（a）取培養(yǎng)取培養(yǎng)48小時(shí)的枯草芽孢桿菌小時(shí)的枯草芽孢桿菌BF7658（產(chǎn)產(chǎn)淀粉酶

19、）的斜面淀粉酶）的斜面4- -5支，用支，用無菌生理鹽水將菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角燒瓶中，振蕩無菌生理鹽水將菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角燒瓶中，振蕩30分鐘，以打碎菌塊。分鐘，以打碎菌塊。（b）將上述菌液離心（將上述菌液離心（3000r/min，離心離心15分鐘），棄去上清液，將菌體用分鐘），棄去上清液，將菌體用無菌生理鹽水洗滌無菌生理鹽水洗滌2- -3次，最后制成菌懸液。次，最后制成菌懸液。（c）用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升108個(gè)。個(gè)。n平板制作平板制作n將淀粉瓊脂培養(yǎng)基溶化后，冷至將淀粉瓊脂培養(yǎng)基溶化后，冷至45

20、左右時(shí)倒平板，凝固后待用。左右時(shí)倒平板，凝固后待用。32紫外線誘變紫外線誘變n紫外線處理紫外線處理（a）將紫外線燈開關(guān)打開預(yù)熱約將紫外線燈開關(guān)打開預(yù)熱約20分鐘。分鐘。（b）取直徑取直徑6cm無菌平皿無菌平皿2套，分別加入上述菌懸液套，分別加入上述菌懸液5ml，并放入無菌攪拌并放入無菌攪拌棒于平皿中。棒于平皿中。（c）將盛有菌懸液的將盛有菌懸液的2平皿置于磁力攪拌器上，在距離為平皿置于磁力攪拌器上，在距離為30cm，功率為功率為15W的紫外線燈下分別攪拌照射的紫外線燈下分別攪拌照射1分鐘及分鐘及3分鐘。分鐘。n稀釋稀釋n在在紅燈紅燈下，將上述經(jīng)誘變處理的菌懸液以下，將上述經(jīng)誘變處理的菌懸液以1

21、0倍稀釋法稀釋成倍稀釋法稀釋成10-1- -10-6（具體可按估計(jì)的存活率進(jìn)行稀釋）。（具體可按估計(jì)的存活率進(jìn)行稀釋）。n涂平板涂平板n取取10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度涂平板，每個(gè)稀釋度涂平板三個(gè)稀釋度涂平板，每個(gè)稀釋度涂平板3只，每只只，每只平板加稀釋菌液平板加稀釋菌液0. .1ml，用無菌玻璃刮棒涂勻。以同樣操作，取未經(jīng)用無菌玻璃刮棒涂勻。以同樣操作，取未經(jīng)紫外線處理的菌稀釋液涂平板作對(duì)照。紫外線處理的菌稀釋液涂平板作對(duì)照。33n培養(yǎng)：培養(yǎng)：將上述涂勻的平板，用黑布（或黑紙）包好，置將上述涂勻的平板，用黑布（或黑紙）包好，置37培養(yǎng)培養(yǎng)48小時(shí)。小時(shí)。注意每個(gè)平皿背面要標(biāo)明處理時(shí)

22、間和稀釋度。注意每個(gè)平皿背面要標(biāo)明處理時(shí)間和稀釋度。n計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)：將培養(yǎng)：將培養(yǎng)48小時(shí)后的平板取出進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，根據(jù)對(duì)照平板上菌落數(shù)，小時(shí)后的平板取出進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，根據(jù)對(duì)照平板上菌落數(shù)，計(jì)算出每毫升菌液中的活菌數(shù)。同樣計(jì)算出紫外線處理計(jì)算出每毫升菌液中的活菌數(shù)。同樣計(jì)算出紫外線處理1分鐘、分鐘、3分鐘后的分鐘后的存活細(xì)胞數(shù)及其致死率。存活細(xì)胞數(shù)及其致死率。 n觀察誘變效應(yīng)觀察誘變效應(yīng)： 將細(xì)胞計(jì)數(shù)后的平板，分別向菌落數(shù)在將細(xì)胞計(jì)數(shù)后的平板，分別向菌落數(shù)在5- -6個(gè)左右的平板內(nèi)個(gè)左右的平板內(nèi)加碘液數(shù)滴，在菌落周圍將出現(xiàn)透明圈。分別測(cè)量透明圈直徑與菌落直徑加碘液數(shù)滴，在菌落周圍將出現(xiàn)透明圈。分別

23、測(cè)量透明圈直徑與菌落直徑并計(jì)算其比值（并計(jì)算其比值（HC值）。與對(duì)照平板進(jìn)行比較，根據(jù)結(jié)果，說明誘變效應(yīng)。值）。與對(duì)照平板進(jìn)行比較，根據(jù)結(jié)果，說明誘變效應(yīng)。并選取并選取HC比值大的菌落移接到試管斜面上培養(yǎng)。此斜面可作復(fù)篩用。比值大的菌落移接到試管斜面上培養(yǎng)。此斜面可作復(fù)篩用。34 B 快中子快中子 n中子產(chǎn)生中子產(chǎn)生：中子可由回旋加速器、靜電加速器或原子反應(yīng)堆產(chǎn)生。中子可由回旋加速器、靜電加速器或原子反應(yīng)堆產(chǎn)生。中子不直接產(chǎn)生電離，但能使吸收中子的物質(zhì)的原子核射出質(zhì)子來，中子不直接產(chǎn)生電離，但能使吸收中子的物質(zhì)的原子核射出質(zhì)子來，因而快中子的生物學(xué)效應(yīng)，幾乎完全是由質(zhì)子造成的。因而快中子的生物

24、學(xué)效應(yīng)，幾乎完全是由質(zhì)子造成的。 n快中子快中子：中子分為快中子和慢中子。慢中子的效應(yīng)同中子分為快中子和慢中子。慢中子的效應(yīng)同射線、射線、射射線和電子等照射時(shí)引起的基本相同，快中子較線和電子等照射時(shí)引起的基本相同，快中子較X射線、射線、 射線具有較射線具有較大的電離密度，因而能更多地引起點(diǎn)突變和染色體畸變。大的電離密度，因而能更多地引起點(diǎn)突變和染色體畸變。n劑量劑量：用快中子進(jìn)行誘變育種時(shí)，用菌懸浮液或長(zhǎng)在平皿上的菌落用快中子進(jìn)行誘變育種時(shí)，用菌懸浮液或長(zhǎng)在平皿上的菌落進(jìn)行處理，所用劑量范圍約為進(jìn)行處理，所用劑量范圍約為1001500戈。戈。35C 氮芥氮芥 n氮芥是一種極易揮發(fā)的油狀物，氮芥

25、是一種極易揮發(fā)的油狀物，一般使用它的鹽酸鹽一般使用它的鹽酸鹽。應(yīng)用時(shí)先使氮芥鹽酸鹽與碳酸氫鈉起作用，釋放出氮芥應(yīng)用時(shí)先使氮芥鹽酸鹽與碳酸氫鈉起作用，釋放出氮芥子氣，再與細(xì)胞起作用而造成變異。子氣，再與細(xì)胞起作用而造成變異。 ClCH2CH2ClCH2CH2NHHCll其鹽酸鹽結(jié)構(gòu)式為：其鹽酸鹽結(jié)構(gòu)式為：36氮芥的誘變機(jī)制、解毒n誘變機(jī)制誘變機(jī)制：氮芥能引起染色體畸變，是被利用得最氮芥能引起染色體畸變，是被利用得最早的一種誘變劑。青霉素產(chǎn)生菌的選育，獲得了良好早的一種誘變劑。青霉素產(chǎn)生菌的選育，獲得了良好的效果。的效果。n 解毒：解毒：氮芥鹽酸鹽在碳酸氫鈉溶液中呈游離狀態(tài)，氮芥鹽酸鹽在碳酸氫鈉溶

26、液中呈游離狀態(tài)，甘氨酸能與氮芥甘氨酸能與氮芥(在碳酸氫鈉參與下在碳酸氫鈉參與下)結(jié)合，形成無毒化結(jié)合，形成無毒化合物，因此它有解毒作用。其反應(yīng)式為合物，因此它有解毒作用。其反應(yīng)式為：37氮芥使用方法氮芥使用方法n配制活化劑和解毒劑配制活化劑和解毒劑n稱取碳酸氫鈉稱取碳酸氫鈉68mg加入蒸餾水加入蒸餾水10mL，即為即為活化劑活化劑；n稱取碳酸氫鈉稱取碳酸氫鈉136mg,甘氨酸甘氨酸120mg,溶解在溶解在200mL蒸餾蒸餾水中，即為水中，即為解毒劑解毒劑。n將這兩種溶液高壓滅菌備用。將這兩種溶液高壓滅菌備用。n將一只小瓶和橡皮塞滅菌、烘干、稱取約將一只小瓶和橡皮塞滅菌、烘干、稱取約10mg的氮

27、芥鹽的氮芥鹽酸鹽放入瓶中，再加入滅菌蒸餾水酸鹽放入瓶中，再加入滅菌蒸餾水2mL，則成為每毫升含則成為每毫升含有有5mg的氮芥鹽酸鹽溶液。的氮芥鹽酸鹽溶液。 38氮芥使用方法氮芥使用方法n吸取吸取1mL孢子懸浮液孢子懸浮液(濃度為濃度為200萬孢子萬孢子mL)于另一滅于另一滅過菌的小瓶中，加入過菌的小瓶中，加入0.6mL緩沖液，再加入緩沖液，再加入0.4 mL上述上述氮芥溶液，將橡皮塞蓋緊，搖勻，此時(shí)瓶中的氮芥作用氮芥溶液，將橡皮塞蓋緊，搖勻，此時(shí)瓶中的氮芥作用濃度為每毫升濃度為每毫升1mg。n加入氮芥溶液加入氮芥溶液30秒鐘后開始計(jì)算時(shí)間，達(dá)到所需要的時(shí)秒鐘后開始計(jì)算時(shí)間，達(dá)到所需要的時(shí)間后，

28、用間后，用1mL注射器吸取注射器吸取0.1mL處理液加到處理液加到9.9 mL的解的解毒劑中，使氮芥作用停止。毒劑中，使氮芥作用停止。39D 亞硝酸亞硝酸n誘變機(jī)理：誘變機(jī)理：亞硝酸是一種常用的有效誘變劑，其誘變作亞硝酸是一種常用的有效誘變劑，其誘變作用主要是脫去堿基中的氨基。用主要是脫去堿基中的氨基。n例如例如A、C、G分別被脫去氨基而成為次黃嘌呤分別被脫去氨基而成為次黃嘌呤(H)、尿嘧啶尿嘧啶(U)、黃嘌呤黃嘌呤(X)等。復(fù)制時(shí)，它們分別與等。復(fù)制時(shí)，它們分別與C、A、C配對(duì)。前兩種情況配對(duì)。前兩種情況可以引起堿基對(duì)的轉(zhuǎn)換而造成突變。由可以引起堿基對(duì)的轉(zhuǎn)換而造成突變。由A：T G：C，G：

29、C A：T的轉(zhuǎn)換已經(jīng)得到證實(shí)。由于的轉(zhuǎn)換已經(jīng)得到證實(shí)。由于X(黃嘌呤黃嘌呤)的分子結(jié)構(gòu)只能與的分子結(jié)構(gòu)只能與C配對(duì)，不能與配對(duì)，不能與T配對(duì)；所以它不能引起配對(duì)；所以它不能引起G：C A：T的轉(zhuǎn)換因而的轉(zhuǎn)換因而不會(huì)造成突變。不會(huì)造成突變。n亞硝酸還會(huì)引起亞硝酸還會(huì)引起DNA兩條鏈之間的交聯(lián)而造成兩條鏈之間的交聯(lián)而造成DNA結(jié)構(gòu)上的缺結(jié)構(gòu)上的缺失，機(jī)制不清楚。失，機(jī)制不清楚。40A41亞硝酸誘變機(jī)理亞硝酸誘變機(jī)理42n亞硝酸很不穩(wěn)定，容易分解成水和硝酸酐亞硝酸很不穩(wěn)定，容易分解成水和硝酸酐(2HNO2 N2O3+H2O)：硝酸酐繼續(xù)分解放出硝酸酐繼續(xù)分解放出NO和和NO2(N2O3 NO+NO2

30、)。n可在臨用前將亞硝酸鈉放在可在臨用前將亞硝酸鈉放在pH4.5的醋酸緩沖液中，生成亞的醋酸緩沖液中，生成亞硝酸硝酸(NaNO2+H+ HNO2+Na+）亞硝酸使用方法亞硝酸使用方法43E N甲基甲基-N硝基硝基N亞硝基胍亞硝基胍(NTG) n 亞硝基胍亞硝基胍是亞硝基烷基類化合物的一種，可誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型突變，不是亞硝基烷基類化合物的一種，可誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型突變，不經(jīng)淘汰便可直接得到經(jīng)淘汰便可直接得到12%-80%的營養(yǎng)缺陷型菌株，有超誘變劑之稱。的營養(yǎng)缺陷型菌株，有超誘變劑之稱。n應(yīng)用原理：應(yīng)用原理：n酸性條件：在酸性條件：在pH低于低于5-5.5的條件下，形成的條件下，形成HNO2而引起菌種

31、突變；而引起菌種突變；n堿性條件：以重氮甲烷的形式對(duì)堿性條件：以重氮甲烷的形式對(duì)DNA起烷化作用；起烷化作用；npH6時(shí)：兩者均不產(chǎn)生，此時(shí)的誘變效應(yīng)可能是由于時(shí)：兩者均不產(chǎn)生，此時(shí)的誘變效應(yīng)可能是由于NTG本身對(duì)本身對(duì)核蛋白體引起的變化所致。核蛋白體引起的變化所致。n處理?xiàng)l件：處理?xiàng)l件：NTG在甲酰胺中溶解度較大，用甲酰胺溶解在甲酰胺中溶解度較大，用甲酰胺溶解NTG可以提高可以提高處理濃度。通常在濃度為處理濃度。通常在濃度為300g/mL，溫度為溫度為28和時(shí)間和時(shí)間60分鐘的條件分鐘的條件下處理，容易獲得高產(chǎn)菌株。下處理，容易獲得高產(chǎn)菌株。44451 噬菌體的分布噬菌體的分布n噬菌體廣泛分

32、布在自然界，存在于土壤、肥料、糞便和噬菌體廣泛分布在自然界，存在于土壤、肥料、糞便和污水中。污水中。n在工廠生產(chǎn)中，對(duì)排出的菌體如不及時(shí)處理，便有可能在工廠生產(chǎn)中，對(duì)排出的菌體如不及時(shí)處理，便有可能在下水道的污水和四周土壤中滋生噬菌體，在情況嚴(yán)重在下水道的污水和四周土壤中滋生噬菌體，在情況嚴(yán)重時(shí)，甚至從空氣中亦能分離到噬菌體。時(shí)，甚至從空氣中亦能分離到噬菌體。T4 Bacteriophage (TEM x390,000) 46一種噬菌體感染大腸桿菌一種噬菌體感染大腸桿菌47n噬菌體的意義噬菌體的意義n細(xì)菌基因轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)菌基因轉(zhuǎn)導(dǎo)n醫(yī)藥用途醫(yī)藥用途（1）鑒別細(xì)菌；（鑒別細(xì)菌；（2）治療的佐劑：如痢疾

33、的預(yù)防）治療的佐劑：如痢疾的預(yù)防與治療，配合抗生素。與治療，配合抗生素。n噬菌體的危害噬菌體的危害：微生物發(fā)酵工業(yè)深受噬菌體危害。例如抗生微生物發(fā)酵工業(yè)深受噬菌體危害。例如抗生素工業(yè)、微生物農(nóng)藥和有機(jī)溶劑發(fā)酵等工業(yè)中，普遍存在著噬菌素工業(yè)、微生物農(nóng)藥和有機(jī)溶劑發(fā)酵等工業(yè)中，普遍存在著噬菌體的危害。當(dāng)發(fā)酵過程污染了噬菌體后，輕者使發(fā)酵周期延長(zhǎng)，體的危害。當(dāng)發(fā)酵過程污染了噬菌體后，輕者使發(fā)酵周期延長(zhǎng)，發(fā)酵單位發(fā)酵單位(產(chǎn)量產(chǎn)量)降低，重則造成倒罐，釀成經(jīng)濟(jì)損失，已成為發(fā)降低，重則造成倒罐，釀成經(jīng)濟(jì)損失，已成為發(fā)酵工業(yè)的大敵。酵工業(yè)的大敵。 482 抗噬菌體菌株的選育抗噬菌體菌株的選育n 在工業(yè)微生

34、物發(fā)酵過程中，有不少品種遭受噬菌體的在工業(yè)微生物發(fā)酵過程中，有不少品種遭受噬菌體的感染，使生產(chǎn)不能進(jìn)行。這種瓦解細(xì)胞的噬菌體稱為感染，使生產(chǎn)不能進(jìn)行。這種瓦解細(xì)胞的噬菌體稱為烈性噬菌體烈性噬菌體。n在出現(xiàn)噬菌體以后必須選育抗噬菌體菌株和配合其他在出現(xiàn)噬菌體以后必須選育抗噬菌體菌株和配合其他措施使生產(chǎn)繼續(xù)進(jìn)行。措施使生產(chǎn)繼續(xù)進(jìn)行。n由于噬菌體很易發(fā)生變異，因此又會(huì)出現(xiàn)新的噬菌體，由于噬菌體很易發(fā)生變異，因此又會(huì)出現(xiàn)新的噬菌體，對(duì)噬菌體原具有抗性的菌株又會(huì)出現(xiàn)不抗。所以既要對(duì)噬菌體原具有抗性的菌株又會(huì)出現(xiàn)不抗。所以既要不斷收集噬菌體，又要不斷選育新的抗性菌株，以確不斷收集噬菌體，又要不斷選育新的抗

35、性菌株，以確保生產(chǎn)正常進(jìn)行。保生產(chǎn)正常進(jìn)行。 49A 抗噬菌體菌株選育的幾種方法抗噬菌體菌株選育的幾種方法n自然突變自然突變 以噬菌體為篩子，敏感菌株的孢子不經(jīng)任何誘以噬菌體為篩子，敏感菌株的孢子不經(jīng)任何誘變由其自然突變?yōu)榭剐跃?，變由其自然突變?yōu)榭剐跃?，抗性突變頻率很低抗性突變頻率很低。n誘發(fā)突變誘發(fā)突變 n敏感菌株先經(jīng)誘變因素處理，然后將處理過的孢子液敏感菌株先經(jīng)誘變因素處理，然后將處理過的孢子液分離在含有高濃度的噬菌體的平板培養(yǎng)基上，經(jīng)誘變分離在含有高濃度的噬菌體的平板培養(yǎng)基上，經(jīng)誘變后的存活孢子中，如存在抗性變異菌株就能在此平板后的存活孢子中，如存在抗性變異菌株就能在此平板上生長(zhǎng)。上

36、生長(zhǎng)。誘變可以提高抗性菌株的頻率誘變可以提高抗性菌株的頻率。n或?qū)⒚舾芯咦咏?jīng)誘變后接入種子培養(yǎng)基，待菌絲長(zhǎng)或?qū)⒚舾芯咦咏?jīng)誘變后接入種子培養(yǎng)基，待菌絲長(zhǎng)濃后加入高濃度的噬菌體再繼續(xù)培養(yǎng)幾天，再加入噬濃后加入高濃度的噬菌體再繼續(xù)培養(yǎng)幾天，再加入噬菌體反復(fù)感染，使敏感菌被噬菌體所裂解，最后取再菌體反復(fù)感染，使敏感菌被噬菌體所裂解，最后取再生菌絲進(jìn)行平板分離，從中篩選抗性菌株。生菌絲進(jìn)行平板分離，從中篩選抗性菌株。 50B 抗噬菌體菌株的特性試驗(yàn)抗噬菌體菌株的特性試驗(yàn) 無論從自然突變或誘發(fā)突變所得到的抗噬菌體菌株，在用于無論從自然突變或誘發(fā)突變所得到的抗噬菌體菌株，在用于生產(chǎn)之前，均需經(jīng)過反復(fù)驗(yàn)證，才能使用。生產(chǎn)之前，均需經(jīng)過反復(fù)驗(yàn)證，才能使用。n抗噬菌體性狀的穩(wěn)定性試驗(yàn)抗噬菌體性狀的穩(wěn)定性試驗(yàn)n抗性菌株分別在孢子培養(yǎng)、種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)過程中抗性菌株分別在孢子培養(yǎng)、種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)過程中用用點(diǎn)滴法點(diǎn)滴法或或雙層瓊脂法雙層瓊脂法測(cè)定噬菌斑。測(cè)定噬菌斑。n不出現(xiàn)噬菌斑，說明該菌株對(duì)此噬菌體具有抗性。不出現(xiàn)噬菌斑，說明該菌株對(duì)此噬菌體具有抗性。n觀察抗性菌株多次傳代后對(duì)噬菌體的抗性是否穩(wěn)定。觀察抗