大腸桿菌抗藥性菌株的篩選

1、大腸桿菌抗藥性菌株的篩選【實(shí)驗(yàn)?zāi)康?】掌握微生物變異的原理， 學(xué)習(xí)用梯度平板法分離抗藥性突變株?！緦?shí)驗(yàn)原理 】基因突變可分為自發(fā)突變和誘發(fā)突變。許多物理、化學(xué)、生物因素對微生物都有誘變作用?；蛑袎A基順序的改變可導(dǎo)致微生物細(xì)胞的遺傳變異。這種變異有時(shí)能使細(xì)胞在有害的環(huán)境中存活下來，抗藥性突變就是一個例子?？顾幮酝蛔冎晔侵敢吧途昊蛲蛔儺a(chǎn)生的對某些化學(xué)藥物的抗性變異類型， 可在加有相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基平板上選出?？顾幮酝蛔兪?dna 分子的某一特定位置的結(jié)構(gòu)改變所致，有藥物的存在無關(guān)， 藥物的存在只是作為分離某種抗藥性菌株的鑒別手段。在含有一定濃度抑制生長的藥物平板上涂布大量的細(xì)胞群體，極個別抗

2、性突變的細(xì)胞在平板上長成菌落。純化后進(jìn)一步進(jìn)行抗性試驗(yàn)，就可以得到所需的抗藥性菌株。為了便于選擇適當(dāng)?shù)乃幬餄舛龋蛛x抗藥性突變株常用梯度平板法。本實(shí)驗(yàn)用梯度平板法分離大腸桿菌抗鏈霉素、青霉素和紅霉素突變株?！緦?shí)驗(yàn)器材 】大腸桿菌; lb 液體培養(yǎng)基；lb 瓊脂培養(yǎng)基；鏈霉素、青霉素和紅霉素； 70%乙醇；無菌吸管，燒杯，試管，玻璃涂棒，水浴鍋等?！静僮鞑襟E 】1.接種大腸桿菌與盛有5ml l b 培養(yǎng)液的試管中， 37震蕩培養(yǎng)24h。2.在水浴鍋中融化lb 培養(yǎng)基。3.倒 10ml 已融化不含藥物的lb 瓊脂培養(yǎng)基于無菌培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿一端墊起使培養(yǎng)皿表面在墊起的一端剛到培養(yǎng)皿的底與邊的交界

3、處凝固。4.在凝固的平板底部高瓊脂一邊標(biāo)上低，放平后在底層培養(yǎng)基上分別加入每毫升含有100ug 鏈霉素、青霉素和紅霉素的lb 瓊脂培養(yǎng)基 10ml，凝固后制得鏈霉素濃度從0 到另一端的100ug ml的梯度平板。5.用 1ml 無菌吸管吸取0.2ml 大腸桿菌培養(yǎng)液加到梯度平板上。用無菌玻璃涂棒將菌液均勻涂布到整個平板表面。如用蘸有乙醇并經(jīng)火焰滅菌的玻璃涂棒， 可在火焰旁或伸進(jìn)培養(yǎng)皿在板蓋上充分冷卻以免燙死細(xì)胞。6.將平板于 37培養(yǎng) 48 h. 7.選擇 12 個生長在梯度平板中部的單個菌落，用無菌接種環(huán)接觸該菌落朝高藥物濃度的方向劃線。8.將平板倒置于37培養(yǎng) 48 h?！咀⒁馐马?xiàng) 】1.玻璃涂布棒在火焰上灼燒后要待其冷卻后再進(jìn)行涂布，以免燙死細(xì)胞；可以蘸上乙醇后在火焰上灼燒，以縮短冷卻的時(shí)間。2.制備含藥平板時(shí)，務(wù)必使藥物與培養(yǎng)基充分混勻。3.嚴(yán)格無菌操作，勿將雜菌誤為抗藥性大腸桿菌。注：lb(luria-bertani) 培