試驗(yàn)——基因組抽提實(shí)用教案

1、實(shí)驗(yàn)(shyn)原理基因組抽提 本實(shí)驗(yàn)采用小規(guī)?？焖僦苽淇侱NA，其基本原理是：在堿性條件下，用表面活性劑SDS將細(xì)菌細(xì)胞壁破裂，然后用高濃度的NaCl沉淀蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，經(jīng)過(guò)苯酚抽提進(jìn)一步去掉蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，經(jīng)乙醇沉淀，得到較純的總DNA。 用無(wú)水乙醇沉淀DNA，這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全，因此(ync)是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周?chē)乃肿?，使DNA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無(wú)水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67左右。投暴?？?/p>

2、抬用鈾炔籍鴻墩識(shí)惟輝獨(dú)嚼椽烷躇片攪氣系押叮噶揉堪祈檢皖漳實(shí)驗(yàn)(shyn)基因組抽提實(shí)驗(yàn)(shyn)基因組抽提第1頁(yè)/共11頁(yè)第一頁(yè)，共11頁(yè)。實(shí)驗(yàn)(shyn)原理瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖是從瓊脂中分離得到，由1, 3連接的吡喃型-D-半乳糖和1, 4連接的3, 6脫水吡喃型-L-半乳糖組成，形成相對(duì)分子量為104-105的長(zhǎng)鏈。瓊脂糖加熱溶解后分子呈隨機(jī)線(xiàn)團(tuán)狀分布，當(dāng)溫度降低( jingd)時(shí)鏈間糖分子上的羥基通過(guò)氫鍵作用相連接，形成孔徑結(jié)構(gòu)，而隨著瓊脂糖濃度不同形成不同大小的孔徑。 對(duì)于同種DNA分子，膠濃度越高，電泳速率越慢。 DNA為堿性物質(zhì)，在電泳（緩沖液pH = 8）時(shí)帶負(fù)電荷，在一定

3、的電場(chǎng)力作用下向正極泳動(dòng)。而DNA鏈上的負(fù)電荷伴隨著DNA分子量的增加而增加，荷質(zhì)比是一常數(shù)，故電泳中DNA的分離類(lèi)似分子篩效應(yīng)。橢龜甜趁片漓版琳梗慨諜趟陶富設(shè)啃辣范支憑診舷關(guān)額跨沏嶺圭異帛身晚實(shí)驗(yàn)(shyn)基因組抽提實(shí)驗(yàn)(shyn)基因組抽提第2頁(yè)/共11頁(yè)第二頁(yè)，共11頁(yè)。實(shí)驗(yàn)(shyn)原理瓊脂糖凝膠電泳 在相同的電泳條件下，影響DNA分子泳動(dòng)的因素主要是DNA分子特性： DNA分子大小。DNA分子越大，在膠中的摩擦阻力就越大，泳動(dòng)也越慢，遷移速率與線(xiàn)狀DNA分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比。 DNA分子構(gòu)型。對(duì)于(duy)質(zhì)粒DNA分子即使具有相同分子質(zhì)量，因構(gòu)型不同也會(huì)造成電泳時(shí)受到的阻力不

4、同，最終造成泳動(dòng)速率的不同。常規(guī)電泳中質(zhì)粒DNA分子的3種構(gòu)型泳動(dòng)速率：超螺旋最快、線(xiàn)狀分子次之，開(kāi)環(huán)分子最慢。 溴化乙錠（Ethidium Bromide），簡(jiǎn)稱(chēng)EB，是電泳中的常用的染色劑，具有扁平結(jié)構(gòu)，能嵌入到DNA堿基對(duì)之間而與DNA結(jié)合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝膠電泳中的DNA條帶呈現(xiàn)出紅色熒光，易于檢測(cè)。枉款拼遣婁附傅斧顆賊糕糙丈堪啄爽雛慰噶罕賭古迄跑軀畏擇趣誼蠅腥閥實(shí)驗(yàn)(shyn)基因組抽提實(shí)驗(yàn)(shyn)基因組抽提第3頁(yè)/共11頁(yè)第三頁(yè)，共11頁(yè)。實(shí)驗(yàn)(shyn)原理瓊脂糖凝膠電泳 電泳中，DNA點(diǎn)樣前必須加入一定量的上樣緩沖液，其主要作用如下： 一般上樣緩沖液

5、中含10 mmol/L的EDTA以螯合Mg2+，防止電泳過(guò)程(guchng)中DNA被DNase降解。 一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖，和樣品混合后用于增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔內(nèi)。 一般上樣緩沖液中加入溴酚藍(lán)，使樣品呈色，使加樣操作更方便，同時(shí)溴酚藍(lán)的泳動(dòng)速率較快（約與300 bp的線(xiàn)狀雙鏈DNA相同），可用于監(jiān)測(cè)電泳的行進(jìn)過(guò)程(guchng)。開(kāi)阜餾馭村填邏炳漁疲墑父炬氯爐炬釩巴徒蜂層幢店淺汪龔尋六愈魚(yú)牢屈實(shí)驗(yàn)(shyn)基因組抽提實(shí)驗(yàn)(shyn)基因組抽提第4頁(yè)/共11頁(yè)第四頁(yè)，共11頁(yè)。實(shí)驗(yàn)(shyn)原理瓊脂糖凝膠電泳 目前各廠商(chngshng)開(kāi)發(fā)了各種類(lèi)型的

6、標(biāo)準(zhǔn)分子量。電泳時(shí)樣品和Marker在平行的加樣孔內(nèi)加入，同時(shí)進(jìn)行電泳，可以根據(jù)電泳結(jié)果看出樣品中DNA的大小?？际助Q篷左激醋豆酥院英艇頃牢恢串挾禱虐絨毗沸瑞呀暖希搏馳曝滋錠實(shí)驗(yàn)(shyn)基因組抽提實(shí)驗(yàn)(shyn)基因組抽提第5頁(yè)/共11頁(yè)第五頁(yè)，共11頁(yè)。操作步驟細(xì)菌(xjn)總DNA的提取 菌體培養(yǎng)：接種大腸桿菌K12s于LB液體培養(yǎng)基，于37振蕩培養(yǎng)1618 h，獲得足夠的菌體。 菌體收集：取1.5 mL培養(yǎng)液于1.5 mL離心管中，12000 rpm離心30 s，棄上清，收集菌體（注意吸干多余的水分）。 裂解菌體：向每管加入( jir)200 L裂解緩沖液，用微量移液器吸頭強(qiáng)烈抽吸

7、以懸浮和裂解細(xì)菌細(xì)胞。 向每管加入( jir)66 L 5mol/L NaCl，充分混勻后，12000 rpm離心10 min，除去蛋白質(zhì)復(fù)合物及細(xì)胞壁等殘?jiān)?將上清轉(zhuǎn)移到新離心管中，加入( jir)等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（25/24/1 v/v/v），充分混勻后，12000 rpm離心3 min。 小心取出上清，用0的兩倍體積的無(wú)水乙醇沉淀，12000 rpm離心5 min，棄上清液。 沉淀用400 L 70的乙醇洗滌兩次。每次12000 rpm離心2 min。 用電吹風(fēng)小心吹干，用50 L無(wú)菌雙蒸水溶解DNA。魄斜過(guò)餾脫止王訊駱宅債惟斥毖往樊錳靈聳銳亦粱搽敬俠搗扭等懾吃猙峨實(shí)驗(yàn)(sh

8、yn)基因組抽提實(shí)驗(yàn)(shyn)基因組抽提第6頁(yè)/共11頁(yè)第六頁(yè)，共11頁(yè)。操作步驟瓊脂糖電泳(din yn) 制膠（演示）：稱(chēng)取適量瓊脂糖粉末，加入TAE緩沖液配成1.4%的濃度，加熱使瓊脂糖全部融化于緩沖液中，加入少許EB染液混合，待溶液溫度降至65時(shí)，立即倒入制膠槽中，插入(ch r)樣品梳。在室溫放置一段時(shí)間，待凝膠全部凝結(jié)后，輕輕拔出樣品梳，在凝膠板上即形成相互隔開(kāi)的加樣孔。把凝膠板從制膠槽中取出放入電泳槽，再往電泳槽中加入1 TAE直到液面沒(méi)過(guò)凝膠并超過(guò)凝膠12 mm為止。 加樣：用微量移液器取5L DNA Marker，小心地加到最靠邊上的加樣孔內(nèi)。另取10L樣品，和少量的上樣緩

9、沖液混勻后小心地加到同一凝膠板上相鄰的加樣孔中。每加完一個(gè)樣品，換一個(gè)吸頭。 電泳：接通電源，DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)，應(yīng)使靠近加樣孔的一端為負(fù)。維持恒壓80 V，電泳0.51 h，直到溴酚蘭指示劑移動(dòng)到凝膠底部，停止電泳。 觀察：將凝膠板置于254 nm波長(zhǎng)紫外燈下進(jìn)行觀察。DNA存在的位置呈現(xiàn)橙黃色熒光。巾魏婁濘旦汗?jié)见|膛喧撬艦碟晶曾妮止藹灣犀此象攤剃釜歌琢婦帳肇騷實(shí)驗(yàn)(shyn)基因組抽提實(shí)驗(yàn)(shyn)基因組抽提第7頁(yè)/共11頁(yè)第七頁(yè)，共11頁(yè)。注意事項(xiàng) 半無(wú)菌操作。 微量移液器的正確使用。 離心機(jī)的正確使用。 基因組的提取過(guò)程中，DNA會(huì)發(fā)生機(jī)械斷裂產(chǎn)生大小不同的片段，應(yīng)注意(zh y)溫和操作，以保證得到較長(zhǎng)的DNA。 用電吹風(fēng)吹干DNA時(shí)要小心，注意(zh y)不要把DNA吹出離心管。 EB有毒，勿將溶液滴灑在臺(tái)面或地面上，切勿用裸露皮膚接觸EB及含有EB的溶液和試劑。肪通盆旱除青爺仕鍵棺鴦惕守便都寫(xiě)盲和帝生摹岸督摩飾碟澗姑驅(qū)礫陶察實(shí)驗(yàn)(shyn)基因組抽提實(shí)驗(yàn)(shyn)基因組抽提第8頁(yè)/共11頁(yè)第八頁(yè)，共11頁(yè)。思考題 為什么用冷的70乙醇清洗DNA？ DNA的分子大小與遷移速率的關(guān)系如何？ 瓊脂糖凝膠濃度(nngd)對(duì)DNA電泳有什么影響？放奉映結(jié)交(jijio)詫舷橇昌側(cè)惡儀絮耶羔國(guó)沾遍粹匪端圈芭篇咖憶哪煽烹褒疾棉