分光光度法測定化妝品中的氨基酸

1、中山職業(yè)技術學院畢業(yè)論文（設計）摘要采用分光光度法對化妝品中氨基酸含量的測定了研究探討。氨基酸的氨基與茚三酮水合物反應可生成藍紫色化合物，該化合物最大吸收峰在568nm 波長處，且此吸收峰值的大小與氨基酸釋放出的氨基成正比，因此可作為氨基酸定量分析方法。該方法簡便、靈敏、快速重現(xiàn)性良好，可用于化妝品的產(chǎn)品檢驗方法。13,14關鍵詞：化妝品；總氨基酸；分光光度法；含量測定目錄§1 前言 41.1 氨基酸的分類 41.2 氨基酸的應用 .51.2.1 在食品行業(yè)的應用 51.2.2 在醫(yī)藥工業(yè)的應用 51.2.3 在飼料添加劑行業(yè)的應用 51.2.4 在化妝品行業(yè)的應用 51.2.5 在

2、農(nóng)業(yè)上的應用61.2.6 在其他行業(yè)的應用61.3 氨基酸含量的測定方法 61.3.1 化學法 61.3.1.1 甲醛滴定法 61.3.1.2 凱氏定氮法 61.3.2 分光光度法 71.3.3.3 紙色譜法和薄層色譜法 713.3.4 氣相色譜法 71.3.3. 5 液相色譜法 71.3.3.6 毛細管電泳色譜法 81.3.3.7 電化學法 8§2 材料與方法 92.1 實驗原理 92.2 實驗試劑及儀器 92.2.1 主要試劑 92.2.2 主要儀器 92.3 溶液的配制 92.4 實驗方法 102.4.1 測量波長的選擇 102.4.2 顯色時間的考察 102.4.3 標準曲線

3、的繪制 102.4.4 樣品氨基酸的提取 102.4.5 樣品中氨基酸含量測定 10§3 結果與討論 103.1 測量波長的選擇 103.2 顯色時間的考察 113.3 標準曲線的繪制 113.4 樣品氨基酸含量的測定 123.5 注意事項 13總結13致謝14參考文獻 15分光光度法測定化妝品中的氨基酸§1 前言化妝品是清潔、保護、美化人體面部、皮膚及毛發(fā)等的日用化學品，具有令人愉快的香氣，能使人的容貌整潔美觀，并有益于身心健康?；瘖y品的種類繁多，性能各異，其分類方法很多。按應用部位進行分類，可分為：皮膚用化妝品、毛發(fā)用化妝品、指甲用化妝品和唇膏。隨著人們生活水平的不斷提

4、高，市場的日益繁榮，化妝品在人們的日常生活中已得到廣泛的應用?；瘖y品是由各種作用不同的原料，經(jīng)過配制加工而成的復雜混合物，必須采用合理的配料和加工工藝，把種原料有效地加以組合，形成一定的形態(tài)，才能充分發(fā)揮各種原料所具有的特性和功能。制造化品所需要的原料品種繁多，根據(jù)其用途和性能，大體上可分為基質(zhì)原料和配合原料(輔助原料)兩大類。基質(zhì)原料是組成化妝品的主體，也是在化妝品中起主要作用的物質(zhì)；配合原料是使化妝品型、穩(wěn)定或賦予色、香及其他特殊作用的原料，這些原料雖然用量不大，但極為重要1,17。目前，市場上許多食品(保健品)中富含氨基酸類成分，其中以丙氨酸含量最高。丙氨酸是一種氨基酸，化學式alani

5、ne，簡寫為ala，在氨基酸序列中可簡寫為A。對人體來說，丙氨酸為必需氨基酸。但長期以來，質(zhì)檢系統(tǒng)缺乏對該類產(chǎn)品進行系統(tǒng)性檢驗研究。本試驗模仿市場上含中藥類食品、保健品的產(chǎn)品工藝，采用分光光度法測定該類制品中的氨基酸含量18。本法所采用的強酸性陽離子交換樹脂柱將樣品中的氨基酸鹽置換為氨基酸。實驗證明，采用分光光度法檢測含氨基酸類制品的檢驗方法是可行的。該法精密度高，抗干擾性強。此項技術在目食品監(jiān)管中具有十分普遍的意義。由于方法簡單易行，幾乎可以在一般實驗室使用。1.1 氨基酸的分類氨基酸（amino acids）廣義上是指既含有一個堿性氨基又含有一個酸性羧基的有機化合物，正如它的名字所說的那樣

6、。但一般的氨基酸，則是指構成蛋白質(zhì)的結構單位。在生物界中，構成天然蛋白質(zhì)的氨基酸具有其特定的結構特點，即其氨基直接連接在-碳原子上，這種氨基酸被稱為-氨基酸。-氨基酸是肽和蛋白質(zhì)的構件分子，在自然界中共有20種。除-氨基酸外，細胞還含有其他氨基酸。氨基酸是構成生命大廈的基本磚石之一。 1.2 氨基酸的應用13,14氨基酸是構成蛋白質(zhì)的基本單位，是動物體合成蛋白質(zhì)的原料來源，屬食品、飼料的營養(yǎng)成分，在醫(yī)學上具有防病治病的作用，也可作為營養(yǎng)型化妝品的有效成分及合成藥物、表面活性劑、其他工業(yè)產(chǎn)品的化工原料。因此，氨基酸分析是工業(yè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及生命科學研究中最重要的技術之一。廣泛用于食品、醫(yī)藥、添加劑及

7、化妝品行業(yè)。隨著生物工程技術業(yè)的發(fā)展逐漸成為21世紀全球的主要產(chǎn)業(yè)之一，氨基酸的需求量越來越大，品種變更越來越快，工藝改革越來越新。目前全世界氨基酸每年的產(chǎn)量為100萬噸，而需求總量是800萬噸。我國自20世紀60年代起，氨基酸的應用在食品工業(yè)占61 ，在飲料工業(yè)占30 ，醫(yī)藥、日用化工、農(nóng)業(yè)、冶金、環(huán)保、輕工、生物工程技術等方面占用的比例逐年增加。1.2.1 在食品行業(yè)的應用 谷氨酸鈉是人類應用的第一個氨基酸，也是世界上應用范圍最廣、產(chǎn)銷量最的種氨基酸。后來人們已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)甘氨酸、丙氨酸、脯酸、天冬氨酸也具有調(diào)味作用，并將之應用于食品行業(yè)。1.2.2 在醫(yī)藥工業(yè)的應用 氨基酸是合成人體蛋白質(zhì)、

8、激素、酶及抗體的原料，在人體內(nèi)參與正常的代謝和生理活動。用氨基酸及其衍生物可治療各種疾病，可作為營養(yǎng)劑、代謝改良劑，具有抗?jié)?、防輻射、抗菌、治癌、催眠、?zhèn)痛及為特殊病人配制特殊膳食的功效。如氨基酸的混合液可供病人注射用，氨基酸的混合粉可作宇航員、飛行員的補品。1.2.3 在飼料添加劑行業(yè)的應用 在飼料添加劑行業(yè)用的氨基酸主要有蛋氨酸和賴氨酸。其功效主要是：促進動物生長發(fā)育；改善肉質(zhì)，提高畜禽生產(chǎn)能力，增加產(chǎn)量；提高飼料利用率，節(jié)省蛋白質(zhì)飼料；降低成本。如蛋氨酸主要用于雞飼料，亦可用于豬、牛的混合飼料。又如，賴氨酸具有增強畜禽食欲、提高抗病能力、促進外傷治愈的作用。1.2.4 在化妝品行業(yè)的應

9、用 氨基酸及其衍生物易被皮膚吸收，使老化和硬化的表皮恢復彈性，延緩皮膚衰老，具有保水、抗菌、緩沖、表面活性劑保護作用,以及某些有利機體的生理作用。如氨基酸和高級脂肪酸制成的表面活性劑、抗菌劑，已成為最高效的添加劑而被廣泛應用；氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸的碳酸鹽、聚天門冬氨酸等制成的護發(fā)劑、染發(fā)劑，發(fā)展成為時興商品供應市場由于氨基酸具有促進美膚功能, 目前化妝品界應用為保濕劑的氨基酸，有小分子量氨基酸（Aminoacid）以及大分子量的氨基酸聚合體（Polypetide）。 屬于氨基酸類的保濕劑有蛋白類，例如植物蛋白、大豆蛋白、動物蛋白、水解蛋白等。這一類保濕劑的來源成本較高，所以被視為較珍

10、貴的保濕劑。 1.2.5 在農(nóng)業(yè)上的應用 一些氨基酸在體外并無殺菌功能，但它們能干擾植物與病原菌之間的生化關系，使植物的代謝及抗病能力發(fā)生變化，從而達到殺菌的目的。例如苯丙氨酸和丙氨酸可用于治療蘋果瘡痂病。又如，美國一家公司用甘氨酸制成了除草劑，這類農(nóng)藥易被微生物分解，不易造成環(huán)境污染。1.2.6 在其他行業(yè)的應用 在生物工程方面，半胱氨酸等正被開發(fā)成新的保護劑；亮氨酸、胱氨酸等正作為發(fā)酵工業(yè)中多種氨基酸生產(chǎn)菌的添加劑而被應用。在輕工業(yè)方面，聚谷氨酸和聚丙氨酸用于具有良好保溫性和透氣性的人造皮革和高級人造纖維的生產(chǎn)。在重金屬提取和電鍍工業(yè)方面，天門冬氨酸、組氨酸、絲氨酸有重要的應用；谷氨酸等可

11、用于電鍍工業(yè)的電解溶液，半胱氨酸可用于銅礦探測，氨基酸烷基酯可用于海流油回收等。1.3 氨基酸含量的測定方法71.3.1 化學法1.3.1.1 甲醛滴定法原理：是在中性或弱堿性水溶液中，- 氨基酸與甲醛反應生成亞甲基亞氨基衍生物,亞基亞氨基衍生物用堿滴定，從而得到樣品中總氨基酸的含量1。特點：此法簡單易行、快速方便，但準確度差，終點較難掌握。1.3.1.2 凱氏定氮法原理：通過測定樣品中總氮的含量，然后根據(jù)蛋白質(zhì)和氨基酸中的氮含量，得知含氮的氨基酸、蛋白質(zhì)的總量。常見的方法有常量法、微量法、自動定氮法、半微量法及改良凱氏法等多種2。特點：該方法準確度高，但操作步驟復雜、試劑耗量多、測定周期長。

12、1.3.2 分光光度法原理：分光光度法是基于物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法。大部分氨基酸在紫外區(qū)無吸收，只有小部分在紫外區(qū)有吸收，而且吸收光譜嚴重重疊，所以，對大部分氨基酸不經(jīng)分離而用紫外分光光度法同時測定，需要采用一定的數(shù)學方法3。目前常用的數(shù)學分光光度法有偏最小二乘法分光光度法、多元線性回歸分析分光光度法等方法。1.3.3 色譜法1.3.3.3 紙色譜法和薄層色譜法紙色譜法原理：以紙為載體，紙所吸附的水為固定相，展開劑為流動相，由于樣品成分在兩相溶劑中的分配系數(shù)不同而實現(xiàn)分離，按操作方法分為垂直型和水平型兩類4。運用紙色譜法采用不同的層析液和檢測用顯色劑，可以對三十多種氨基酸及其

13、衍生物行分析。紙色譜點是操作簡單、分離效能較高、所需儀器設備廉價，因而應用廣泛。紙色譜電泳相結合可以對氨基酸進行進一步的分離薄層色譜法原理：根據(jù)各種氨基酸在吸附劑表面的吸附能力不進行分離或提純的一種方法，常用的薄層板有硅膠、聚酰胺纖維素，采用相應的展開對氨進行分離，然后分別采用紫外光熒光或可光進行檢測5。特點：具有展開快、分離效能高、靈度高、耐腐蝕等特點，比紙色譜的應用更廣泛。13.3.4 氣相色譜法原理：將氨基酸衍生化成為易于氣化的物質(zhì)，將其衍生物在一定溫度下轉(zhuǎn)化為氣體，利用試樣中各組分在氣相和固定液液相間的分配系數(shù)不同進行檢測分析6。應用較廣的反應有兩種，即生成三氟乙酰(N-TFA)氨基酸

14、正丁酯和生成七氟丁?；?N-HFA)氨基酸丁基酯。氣相色譜具有高效能、選擇性好、靈敏度高、操作簡單的特點，還便于與質(zhì)譜聯(lián)用，確定氨基酸的結構，從而有可能發(fā)現(xiàn)新的氨基酸或測定非蛋白氨基酸。近年來，已在生化、醫(yī)藥、食品等方面得到了廣泛的應用。缺點：氣譜法必須衍生，而衍生中又要恪守嚴格的條件，不能用一根色譜柱實現(xiàn)全氨基酸測定，樣品要經(jīng)過脫鹽處理，操作繁瑣且易帶來污染。1.3.3. 5 液相色譜法原理：由于樣品溶液中的各組分在流動相和固定相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中做相對運動時，經(jīng)過反復多次的吸附解吸的分配過程進行分離檢測。由于大多數(shù)氨基酸無紫外吸收和熒光發(fā)射特征，為提高分析檢測靈敏度和分離選擇特

15、性，通常將氨基酸進行衍生化。目前，氨基酸的液相色譜分析方法主要有柱后衍生法和柱前衍生法7,8。1.3.3.6 毛細管電泳色譜法原理：以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細管為分離通道，依據(jù)樣品中各組成之間淌度和分配行上的差異而實現(xiàn)分離的技術。芳香族氨基酸可采用紫外檢測直接測定，其他氨基酸在可見光和近紫外區(qū)域都沒有光吸收，也不發(fā)射熒光，因此往往通過柱前或柱后衍生的方法進行紫外可見吸收或熒光檢測10,11。衍生方式液相色譜一樣，有柱前、柱后之分。商品儀器通常用柱前衍生，但對一些不夠穩(wěn)定的衍生試劑如OPA，應采用柱后衍生方式。氨基酸的對映體分離有兩種方法：直接法和間接法。直接法是由兩個對映體與手性選擇劑形成不對

16、稱的絡合物分子或其他結構，產(chǎn)生不同的物理化學性質(zhì)從而達到分離的目的。間接法是先將對映體與手性選擇劑反應生成非對映體化合物，使之產(chǎn)生物理和化學性質(zhì)的差異，再通過電泳系統(tǒng)進行分離毛細管電泳具有進樣少、絕對靈敏度高、分辨率高、溶劑消耗量少等優(yōu)點，得到了迅速的發(fā)展。但是CE仍要繼續(xù)提高分辨率、速度和檢測器的選擇性。同時，增加自動進樣裝置和使之微機化、商品化。1.3.3.7 電化學法原理：是建立在物質(zhì)在溶液中的電化學性質(zhì)基礎上的一類儀器分析方法，采用適用于不同氨基酸的選擇電極，對各種氨基酸進行測定12，氨基酸的電化學分析可分為直接電化學分析和間接電化學分析。對于胱氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等電活性的氨基酸一

17、般采用直接電分法。多數(shù)氨基酸于金屬電極上是非電活性的，無法直接測定，一般是采用衍生化反應將其轉(zhuǎn)化成電活性的物質(zhì)進行間接測定。氨基酸的電化學分析特點：此法以其簡單、靈敏、無放射、無污染與各種現(xiàn)代化的分離方法相結合可以大大簡化操作過程，節(jié)約分析時間。氨基酸的電分析法也存在不足，如具有直接電化學活性的氨基酸不多、可逆性較差、背景干擾較大、非電化學活性的氨基酸仍需進行衍生化反應等，因此，實際應用時選擇合適的體系及反應方法。綜上所述，實驗測定氨基酸的方法有很多，通過比較，聯(lián)系實際，我們選擇了分光光度法進行測定。§2 材料與方法2.1 實驗原理本實驗主要利用蛋白質(zhì)物質(zhì)經(jīng)水解成氨基酸，而氨基酸在一

18、定的pH條件下，與茚三酮反應生成藍紫色化合物，對其進行比色定量測定，從而計算出相應的氨基酸含量。該化合物最大吸收峰在568nm波長處，且此吸收峰值的大小與氨基酸釋放出的氨基成正比，因此可作為氨基酸定量分析方法。52.2 實驗試劑及儀器2.2.1 主要試劑 顏寇爽膚水廣州品智化妝品有限公司詩萊雅爽膚水奧雪國際有限公司硝酸GR廣州化學試劑廠活性炭CP廣州增城連勝活性炭廠磷酸二氫鉀AR廣州化學試劑廠磷酸氫二鈉AR廣州化學試劑廠丙氨酸AR惠興生化試劑有限公司茚三酮AR上海伯奧生物科技有限公司雙氧水AR廣州化學試劑廠2.2.2 主要儀器 T6新銳分光光度計，北京普析通用儀器公司；50、100ml容量瓶；

19、1、2、5、10ml移液管；SYC-15超級恒溫水浴，上海豫康科教儀器有限公司；25ml比色管；AL204-IC分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；EL20K標準型pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；燒杯，量筒等。2.3 溶液的配制2.3.1 磷酸二氫鉀溶液：稱取磷酸二氫鉀0.4535g，溶于水中后定容至50ml。2.3.2 磷酸氫二鈉溶液：稱取磷酸氫二鈉1.2938g，溶于水中后定容至50ml。取5.0ml磷酸二氫鉀溶液于100mL容量瓶中，用磷酸氫二鈉溶液稀釋至刻度，搖勻。2.3.3 氨基酸標準溶液(200ug/ml)：準確稱取丙氨酸(含量不小于98%)0. 2000g，用水溶解并定容至

20、100mL, 搖勻后再吸取l0ml于l00ml容量瓶中加水稀釋至刻度。2.3.4 2%茚三酮溶液：稱取茚三酮1.0g，溶于一定量熱水中，待冷卻后定容至50ml。該溶液每隔(2-3)天需重新配制。2.4 實驗方法2.4.1 測量波長的選擇 取丙氨酸對照品溶液l ml于3個25ml比色管瓶中，加茚三酮溶液l ml和磷酸鹽緩沖液1 ml，搖勻，水浴加熱30min，取出，冷卻，用蒸餾水定容至25ml。用可見分光光度計進行全波長測定。42.4.2 顯色時間的考察 取2ml丙氨酸對照液于25ml比色管中，按“2.4.1”項顯色方法進行顯色后，以每5min間隔測一次吸光度A，繪制吸光值與時間的關系曲線4。2

21、.4.3 標準曲線的繪制準確移取氨基酸標準溶液0.0，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4mL(相當于氨基酸0,120，160,200,240,280ug)分別里于25mL比色管中，加水補充至4mL，然后各加人2%茚三酮溶液和磷酸鹽緩沖溶液各1mL，搖勻。置沸水浴中加熱，取出冷卻至室溫，加水至刻度，搖勻。靜置15min，測吸光值，繪制標準曲線。42.4.4 樣品氨基酸的提取2.4.4.1 稱取樣品1.0g置于燒杯中，加入10mL蒸餾水和g左右的活性炭，加熱煮沸，10min后過濾，用68mL熱水洗滌后過濾，收集濾液于25ml比色管中，定容至刻度，搖勻備用2。2.4.4.2 稱取約1.0g樣品于

22、25mL比色管中，加硝酸5.0ml，雙氧水1.0mL，放置30min后，于沸水浴中加熱24h。加氫氧化鈉調(diào)節(jié)p值為7左右，冷卻至室溫用蒸餾水定容至刻度。2.4.5 樣品中氨基酸含量測定準確吸取澄清的樣品溶液4mL，重復3次，按照2.4.3中測定步驟，在相同條件下測得吸光度值。§3 結果與討論3.1 測量波長的選擇 可見分光光度計全波長掃描如圖3-1，得最大吸收波長為568nm。圖3-1 最大吸收波長曲線圖3.2 顯色時間的考察 吸光值與時間的關系曲線如圖3-2，得最佳顯色時間為30min。 圖3-2 顯色時間曲線圖3.3 標準曲線的繪制用分光光度計在568nm波長下以0號作參比，用l

23、cm比色皿測定試液的吸光度，繪制吸光度對氨基酸含量(ug/mL)的標準曲線（如圖3-3），回歸方程為，Y = 0.0014X0.1021，r = 0.9988。表明丙氨酸在120300ugmL范圍內(nèi)成良好的線性19。圖3-3 氨基酸標準曲線3.4 樣品氨基酸含量的測定樣品氨基酸含量吸光值見表3-1，3-2。表3-1 顏寇爽膚水中的氨基酸含量顏寇爽膚水2.4.4.1提取方法2.4.4.2提取方法123123吸光值0.0650.0680.0620.0370.0360.034含量（ug/ml）528.86537.43520.29448.86446.00440.26平均含量（ug/ml）528.864

24、45.04百分含量0.0530.043表3-2 詩萊雅爽膚水中的氨基酸含量詩萊雅爽膚水2.4.4.1提取方法2.4.4.2提取方法123123吸光值0.0840.0870.0850.0740.0780.076含量（ug/ml）58314591.7158600554.57566.00560.29平均含量（ug/ml）586.95560.29百分含量0.0580.055從表格可以得出，用不同的處理方法處理樣品，氨基酸的含量會有所不同，用2.4.4.1提取氨基酸的含量相對的多。不同的化妝品中氨基酸的含量也有所不同，茚三酮比色法測定化妝品中游離氨基酸的含量，只是定量測定樣品中所含的游離氨基酸，并不能說

25、明所含此化妝品的質(zhì)量好壞，若需要判定是否保濕，還需要進行大一致范圍，化妝品中具有保濕作用的還有其方面。對皮膚來說，氨基酸具有緩和外界物質(zhì)傷害的基本功效，適當?shù)陌被?，對受損角質(zhì)有協(xié)助修復的效果，所以廣泛被化妝品界所使用。3.5 注意事項3.5.1 茚三酮每隔23天需重新配置，盡量在使用時當天配制，茚三酮與氨基酸顯色反應需在PH78之間，在實驗中需檢測磷酸鹽緩沖溶液PH值。53.5.2 消化劑種類及其用量對消化結果的有影響，在化妝品前處理需考慮消化時間及溫度對消化的影響。3.5.3 注意雙氧水與化妝品強氧化性，會發(fā)生爆炸的危險性?？偨Y隨著國家不斷加大對化妝品生產(chǎn)企業(yè)的監(jiān)控力度認證推行，含氨基酸類

26、食品生產(chǎn)廠家,必須加強對產(chǎn)品質(zhì)量的檢測，尤其在對生產(chǎn)過程的質(zhì)量監(jiān)控尤為重要，因此對檢測方法更需要簡便、靈敏、快速、重現(xiàn)性良好、抗干擾性強。14我們研究探討了采用分光光度法對富含氨基酸類成分的制品中氨基酸的含量測定方法。實驗證明，采用分光光度法檢測含氨基酸類制品的檢驗方法是可行的。該法精密度高，抗擾性強。此項技術在目前食品、化妝品監(jiān)管中具有十分普遍的意義。由于方法簡單易行，幾乎可以在一般的實驗室使用。 致 謝 本論文是在侯勇老師的精心指導下完成的。做論文的這個月時間是我大學生活最充實和最快樂的一段時間，做實驗一步步的摸索，從失敗中找到原因并改進，讓我充分感受到科學研究的魅力。論文結束之際，要衷心感謝侯勇老師在學業(yè)上的指導和生活上的關懷。感謝本實驗侯勇老師、何素軍、徐秋萍、吳影珊同學以及陳佩珊同學對本實驗的幫助和指導。感謝中山職業(yè)技術各位領導和老師。最后，感謝我的家人、朋友一直以來在我的背后默默支持與鼓勵，使得我能更加順利地完成學業(yè)。盧金霞 2010年12月1日 參考文獻1王朝暉, 蔡繼文。我國化妝品質(zhì)量檢驗面臨的現(xiàn)狀與對策。北京：科學出版社，2009, 6（33）：38-39。2 張馳，劉信平，周大寨。豆腐柴蛋白質(zhì)及氨基酸含量測定。湖北民族學院學報(自然科學版)，2003，1（21）：68-70。3 黃紅兵，朱品業(yè)。青天葵的薄層色譜鑒別與總氨基酸