雙向電泳的技術流程

1、史須史須北京大學人類疾病基因研究中心北京大學人類疾病基因研究中心基因組學與蛋白質組學l基因組學：l蛋白質組學：可視為分子生物學的大規(guī)模篩選技術，目的在于歸類細胞中的蛋白質的整體分布，鑒定并分析感興趣的個別蛋白，最終闡明它們的關系與功能。l上述兩種學科的研究內容在互補的水平上研究了細胞的分子架構，又都在各自的水平上提供了增強對方效應的信息，因此二者存在有很強的且?guī)в邢到y(tǒng)性相互關系。l protein identification/characterization l protein-protein interaction l post-translational modifications l

2、subcellular location l elucidation of pathway l target validation and toxicology l drug discovery蛋白質組分析的首要要求l將來自于全細胞、組織或生物體中所包含的多達幾千種混合蛋白質進行分離、檢測和分析 。l2-de技術依然是大多數(shù)蛋白質組研究中分離復雜蛋白質混合物的首選技術 。生物學問題生物學問題的提出的提出實驗模型實驗模型的設計的設計實驗組和對照組實驗組和對照組樣品的制備樣品的制備蛋白樣品的蛋白樣品的ief和和page電泳分離電泳分離圖像掃描和初步分析圖像掃描和初步分析感興趣感興趣蛋白點蛋白點的切

3、取的切取胰酶對脫色后蛋白質的消化胰酶對脫色后蛋白質的消化質譜的多肽指紋圖、微測序分析質譜的多肽指紋圖、微測序分析質譜結果的生物信息學分析和比對質譜結果的生物信息學分析和比對新蛋白質的發(fā)現(xiàn)新蛋白質的發(fā)現(xiàn)其它實驗其它實驗的進一步的進一步驗證驗證蛋白信息的蛋白信息的初步獲得初步獲得蛋白質組研究的基本技術路線蛋白質組研究的基本技術路線蛋白質樣品的制備蛋白質樣品的制備雙向電泳雙向電泳圖像分析圖像分析轉印至膜上的蛋白轉印至膜上的蛋白凝膠中的蛋白凝膠中的蛋白溶液中的蛋白溶液中的蛋白混合肽混合肽蛋白質質量蛋白質質量n端測序端測序肽序列質譜數(shù)據(jù)肽序列質譜數(shù)據(jù)肽指紋圖肽指紋圖數(shù)據(jù)搜索數(shù)據(jù)搜索新的或已知蛋白新的或已

4、知蛋白蛋白轉錄后修飾的鑒定蛋白轉錄后修飾的鑒定雙向電泳分析中的樣品制備制備原則制備原則：l應使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括應使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應具有可重現(xiàn)性。多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應具有可重現(xiàn)性。l防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。l防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學修飾防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學修飾（如酶性或化學性降解等）。（如酶性或化學性降解等）。l完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。l盡量去除起干擾作用的高豐度或無關蛋

5、白，從而保證盡量去除起干擾作用的高豐度或無關蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。待研究蛋白的可檢測性?？扇苄詷悠房扇苄詷悠?固體組織樣品固體組織樣品 細胞細胞不同樣品的基本處理方法不同樣品的基本處理方法樣品的分級處理樣品的分級處理通過采用亞細胞分級、液相電泳和選擇性沉淀等方法對蛋白質樣品進行分級處理，可降低樣品的復雜性并富集低豐度蛋白質。當前最簡單有效的處理是采用分級抽提，按樣品溶解度不同進行分離。 樣品的溶解l是2-de成功分離蛋白質的最關鍵因素之一。l溶解的目標：1、樣品中非共價結合的蛋白質復合物和聚積體完全破壞，從而形成各個多肽的溶解液（否則樣品中結合牢固的蛋白復合物可能使2-de中出現(xiàn)

6、新的蛋白點，相應的表示單個多肽的點的強度會下降）；2、溶解方法必須允許可能干擾2-de分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質的去除；3、溶解方法要保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài)。變性劑：變性劑：通過改變溶液中的氫鍵結構使蛋白質充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性劑：表面活性劑：經(jīng)過變性劑處理而暴露蛋白質的疏水基團后，還常需至少一種表面活性劑來溶解疏水基團。常用的表面活性劑有離子去污劑sds、非離子去污劑triton x-100和np-40、兩性離子去污劑chaps、obg等。其中chaps和sb3-10最好。還原劑：還原劑：在變性劑和表面活性劑

7、聯(lián)用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質展開更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的dtt或-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦（tbp）進行還原。起載體作用的兩性電解質：起載體作用的兩性電解質：即便在變性劑和表面活性劑存在的情況下，某些蛋白質也需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否則這些蛋白質在其處于pi點時會發(fā)生沉淀。carrier ampholytes的作用在于捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質的溶解性。應用時，兩性電解質的濃度應小于0.2（w/v)。濃度過高會使ief的速度降低。另外，為了保證實驗的精確性，在選擇不同ph范圍的ipg膠條時，也應使兩性電解質的ph值與之相符合。樣品液

8、的準備標準液：reagentamount8m urea47ml of 8.5 stock or 24g urea in 25ml h2o50mm dtt or2mm tbp385mg or 500ul of 200mm tbp stock4% chaps2g0.2%carrier ampholytessee next table0.0002%bromophenol blue100ul of 0.1% stockipg ph rangebio-lyte ampholyte (stock)rangebio-lyte ampholyte (stock)conc.(w/v)sample solutio

9、n volumeper 5mlsample solution volumeper 50ml3-103/1040%25l250 l4-74/640%12.5 l125 l5/740%12.5 l125 l3-63/540%25 l250 l4/640%12. l125 l5-85/840%25 l250 l7-107/940%12.5 l125 l8/1020%25 l250 l suggested bio-lyte ampholyte composition for ipg usereagentamount7m urea4.1ml of 8.5 stock or 2.1g urea in 3m

10、l h2o2m thiourea760mg2mm tbp50ul of 200mm tbp stock4% chaps200mg0.2%carrier ampholytessee table0.0002%bromophenol blue10ul of 0.1% stockddh2oto 5mlmultiple chaotropic agent solution preparationreagentamount5m urea2.9ml of 8.5 stock or 1.5g urea in 3ml h2o2m thiourea760mg2mm tbp50ul of 200mm tbp stoc

11、k2% chaps100mg2%sb3-10100mg0.2%carrier ampholytessee table40mm tris24.2mg0.0002%bromophenol blue10ul of 0.1% stockmultiple surfactant solution preparationl對電泳的影響：對電泳的影響：增加樣品粘度、與蛋白質形成復合物后會出現(xiàn)假象遷移和條紋。l解決方法：用適量純的不含蛋白酶的核酸內切酶進行降解，或是利用合成載體兩性電解質（sca）同核酸結合形成復合物的能力，再通過超速離心來去除復合物。 l用超離心技術分離出細胞器、質膜和細胞核等成分，再用適當?shù)?/p>

12、蛋白質溶解液進行溶解。其優(yōu)點是不僅大大減少樣品的復雜性，而且可對分離的蛋白質進行亞細胞定位。但該法需要專業(yè)儀器，有時會出現(xiàn)假陽性。l順序抽提法：順序抽提法：根據(jù)細胞蛋白溶解性的差異，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液進行抽提的方法。第一步：用tris堿溶液裂解細胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的pellet用標準ief樣品液溶解提取高疏水性蛋白；第三步：用含復合表面活性劑的蛋白溶解液，最后抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白約占整個樣品的11%（w/w）。 低豐度蛋白的分離：低豐度蛋白的分離：盡管增加上樣量和提高總蛋白的溶解度能增加分離時的低豐度蛋白的量，但同時增加了高豐度蛋白的負荷，且造成蛋白的

13、疊加效應而影響分離?，F(xiàn)常用預分級窄ph膠的微制備技術進行分離：即將總蛋白組分成蛋白質組亞群，再用ph梯度小于2個ph單位的ipg膠進行窄ph范圍的分離。 l強堿性蛋白質（如核糖體 ）的處理：先將蛋白預處理以富集，再用特殊ph梯度的ipg膠條（如ph312、4-12或10-12）進行等電聚焦。其中窄范圍堿性ipg膠（如ph10-12）的挑戰(zhàn)是克服反向、陰極向陽極、電滲流和水平條紋模式，而寬范圍的堿性ipg膠（如ph3-12、4-12）等消除了窄范圍膠所需要的專門水化液。l極端分子量的蛋白質：極端分子量的蛋白質：小于8kd和大于200kd的蛋白在常規(guī)ipg-2d上不易看到，這可能是在tris/gl

14、ycine緩沖液中，樣品和游離的dodelcyl sulfate ions持續(xù)積累濃縮，與小分子量的蛋白質發(fā)生對流混合，產(chǎn)生茸毛狀的或模糊的帶，從而降低小蛋白的分辨率；在膠底端，高濃度的十二磺酸使蛋白固定致染色困難。至于高分子量蛋白少的原因可能是在變性條件下，蛋白質復合物變成了多肽，或者可能是大分子。 lipg膠的材料是immobilines，為擁有ch2=ch-co-nh-r結構的8種丙烯酰胺衍生物系列，其中r包含羧基或叔氨基團，它們構成了分布在ph310不同值的緩沖體系。根據(jù)公布的配方計算后，將適宜的ipg試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團通過乙烯鍵共價聚合至聚丙烯酰胺骨架中

15、而形成ph梯度。通過這種方式生成的ipg不會發(fā)生電滲透作用，因而可以進行特別穩(wěn)定的ief分離達到真正的平衡狀態(tài)。 l泡脹的實質：是讓樣品能完全以可溶性的形式進入ipg內，從而能進行接下來的ief。 l不同的加樣方法和加樣量會導致最終結果的差異：lprotean ief cell、ipgphor等集成設備的使用：l 20mmol/l dtt 墊片的使用：l溫度的選擇：影響影響ipg膠條對蛋白載樣量的因素包括：膠條對蛋白載樣量的因素包括：l待分析的蛋白點的量應滿足隨后的質譜分析。l電泳的目的：如果只是得到一張好的圖片，則無需考慮太多其它因素。l待研究蛋白的豐度：l樣品的復雜度：復雜度較高的樣品，為

16、了盡可能的了解所包含的每種蛋白，需要反復實驗才能完成。如果將待檢樣品被富集以后則更易分析。lipg膠條的ph范圍：ipg膠條的蛋白質大約載樣量膠條的蛋白質大約載樣量ipg strip lengthanalytical load(silver staining)preparative load(coom staining)7cm10100 g /125 l200500ug/125 l11cm50200 g /185 l2501000ug/185 l17cm100300 g/300 l13mg/300 ll常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長，預試驗確定。預分步預分步收集收集細胞漿細胞漿細

17、胞核細胞核 細胞膜細胞膜核糖體及其他核糖體及其他特定細胞成份特定細胞成份細胞分細胞分泌成份泌成份ph4-12ph3-10ph4-7ph5-8ph7-10ph6-11ph3-6ph3-4ph4-5ph5-6ph6-7ph7-8ph8-9ph9-10ph10-11ph11-12第一步第一步第二步第二步第第三三步步用窄用窄ph范圍陣列分離范圍陣列分離低豐度或交叉覆蓋蛋白低豐度或交叉覆蓋蛋白陣列那些亞細胞定位位陣列那些亞細胞定位位置的功能蛋白質置的功能蛋白質亞蛋白質組陣列策略的框架圖亞蛋白質組陣列策略的框架圖亞蛋白質組陣列策略的框架圖亞蛋白質組陣列策略的框架圖亞蛋白質組陣列策略的框架圖亞蛋白質組陣列策

18、略的框架圖3倍3倍 l理論上講，要獲得最好的圖譜質量和重復性所需最佳時間是ief分離達到穩(wěn)定態(tài)所需的時間。l聚焦時間太短，會導致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。l過度聚焦雖然不會導致蛋白質向陰極漂移，但會因為活性水轉運而導致過多水在ipg膠表面滲出（電滲）而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。l最佳時間的確定需要根據(jù)不同蛋白樣品、上樣量、ph范圍和膠條長度通過經(jīng)驗來確定。 ief的基本條件的基本條件stemp 1stemp 2stemp 3totalvoltagetimevolt-hoursramp25020minlinear400040002hr10,000v-hrlinearra

19、pid5 hr14,000v-hr7 cmstemp 1stemp 2stemp 3totaltotalstemp 1stemp 2stemp 311 cm17 cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr20,000v-hr40,000v-hr30,000v-hr50,000v-hr5.3 hr7 hrlinearlinearlinearlinearrapidrapid l一維結束后可馬上進行二維電泳，也可保存在兩片塑料膜間于80保存數(shù)月。l但在二維電泳前一定要進行膠條的平衡，以便于被分離的蛋白質與sds完整結合，從而在sds-page是電泳能

20、順利進行。l建議方案是：用含2%(m/v)sds、1%(m/v)dtt、6mm尿素和30%甘油的50mm tris（ph8.8）緩沖液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代dtt后的上述緩沖液平衡15min。如果用tbp代替dtt則只需一步平衡。 l同普通sds-page類似。l但一般在垂直電泳系統(tǒng)中無需濃縮膠，因為在ipg膠條中蛋白質區(qū)域已得到濃縮，可以認為非限制性ief膠（低濃度丙烯酰胺膠）充當了濃縮膠。 理想顯色劑的理想顯色劑的7sl安全（safety）：l靈敏（sensitivity）：l簡單（simplicity）：l特異性（specificity）：l快速（speed）：

21、l穩(wěn)定（stability）：l兼容性（synergy）：l考染靈敏度為30100ng，線性范圍是20倍；銀染的線性范圍是40倍，靈敏度是考染的100倍。l膠體考馬斯亮藍染色技術可實現(xiàn)page的無背景染色，其極限靈敏度為810ng，但這種染液會對蛋白質進行修飾而影響質譜分析的結果。l胺基黑常用于轉印至聚偏二氟乙烯（pvdf）和/或硝酸纖維素膜上的蛋白質的染色。l銀染的缺點是：對某些種類的蛋白質染色效果差，對其后的蛋白質測序和質譜分析造成影響。l這兩種染色技術都可減少膠內蛋白質產(chǎn)量。 l能專門提高page膠上蛋白質的回收率，但不能用于膜上染色。l結果表現(xiàn)為膠面著色而蛋白質點透明。l速度快（515

22、min），蛋白質的生物活性能保持：一旦用絡合劑如edta或tris/甘氨酸轉移緩沖液來絡合金屬離子就可進行提取來轉移蛋白質。l它主要適用于蛋白質顯色、完整蛋白質的膠上被動提取以及質譜分析。l該技術主要包括金屬鹽染料、鋅咪唑染料等的使用。l主要用于高靈敏度檢出電轉印至硝酸纖維素和pvdf膜上的蛋白質，不用于膠內染色。l最好的膠體金染色的靈敏度與page膠內的銀染類似。l這種技術主要包括印度墨水染料、膠體金屬染料等。 l包括共價結合和非共價結合的熒光團染料兩類。后者最為常用，其典型代表是已經(jīng)商品化的sypro red、 orange、 ruby等熒光染料。l這三種染料可對sds-page膠內蛋白質

23、進行一步染色，約3060min完成，靈敏度為210ng。染色后的凝膠用標準的實驗室300nm紫外透射儀進行照像保存，其線性范圍為3個數(shù)量級。l這三種染料的電泳染色結果與在酵母中通過sage所獲得的基因表達水平的動態(tài)范圍相匹配。l在tris/甘氨酸轉印緩沖液中染色后，蛋白質可被轉印至膜上并進行免疫染色或edman測序來鑒定蛋白質。l這是一類與現(xiàn)代蛋白質組學研究相兼容的、相對較新的蛋白質顯色試劑，其設計專門與常用微量化學表征過程兼容。它們不包含戊二醛、甲醛或tween-20等，很容易和集成化蛋白質組學平臺（包括自動化凝膠染色儀、圖像分析工作站、機器人剪切儀器、蛋白質酶解工作站和質譜儀等）相結合。l

24、其中sypro ruby也是一種基于釕的金屬發(fā)光染料。典型流程典型流程l凝膠圖像的掃描：l圖像加工：l斑點檢測和定量：l凝膠配比：l數(shù)據(jù)分析：l數(shù)據(jù)呈遞和解釋：l2-de數(shù)據(jù)庫的建立：蛋白質的膠內酶切 包括感興趣蛋白點的挖取、含蛋白質凝膠的脫色、膠內蛋白質的酶切等過程質譜技術進行蛋白質鑒定的基本流程質譜技術進行蛋白質鑒定的基本流程 樣品制備樣品制備 與與ipg膠條水化膠條水化 ipg電泳電泳 與上樣緩沖液浸潤與上樣緩沖液浸潤 sds-page 轉轉pvdf膜膜 膠內直接染色膠內直接染色 染色染色 取出蛋白點取出蛋白點 胰酶等消化胰酶等消化 濃縮于多孔吸附柱上濃縮于多孔吸附柱上 maldi-ms

25、肽指紋圖肽指紋圖 數(shù)據(jù)庫查詢數(shù)據(jù)庫查詢 蛋白質鑒定蛋白質鑒定 已知已知 反向反向hplc分離分離 maldi-ms，psd片段分析片段分析示知示知 esi-ms-ms、微測序、微測序 實驗方法實驗方法完整蛋白質（如凝膠分離或完整蛋白質（如凝膠分離或色譜純化蛋白質）色譜純化蛋白質）肽混合物肽混合物質譜測定肽質量質譜測定肽質量（maldi-ms,esi-ms)選擇肽段裂解選擇肽段裂解psd-maldi-ms,esi-ms/ms)計算方法計算方法蛋白質序列數(shù)據(jù)庫（核酸序列翻譯數(shù)據(jù)庫）蛋白質序列數(shù)據(jù)庫（核酸序列翻譯數(shù)據(jù)庫）肽質量檢索：肽質量檢索：片片1.ppt 未解析碎片離子檢索：未解析碎片離子檢索：片片2.ppt酶切酶切體外體外 pmol32p蛋白質標記蛋白質標記蛋白質分離蛋白質分離蛋白酶切蛋白酶切2d磷酸化做圖磷酸化做圖 lc