Persisters的研究進(jìn)展及清除策略

1、    persisters的研究進(jìn)展及清除策略    康佳寧摘 要：persisters是野生型細(xì)菌的一種表型變異，對抗生素具有高耐受性的休眠的細(xì)胞亞群，通過減少其新陳代謝并進(jìn)入休眠狀態(tài)從而在抗生素治療中存活下來，并在抗生素去除后恢復(fù)生長，是造成抗生素治療頑固性和感染性疾病復(fù)發(fā)的主要原因之一。本文將對persisters的生物學(xué)特征、產(chǎn)生機(jī)制以及清除策略等內(nèi)容作一綜述。關(guān)鍵詞：persisters;毒素抗毒素系統(tǒng);抗菌機(jī)制persisters這個概念是1944年都柏林大學(xué)醫(yī)學(xué)博士bigger首次提出的，他在研究青霉素殺死金黃色葡萄球菌的過程中發(fā)現(xiàn)，大部

2、分細(xì)菌都被殺死但總有一小部分細(xì)菌培養(yǎng)物（約占細(xì)菌種群的1%）存活下來，存活下來的這部分細(xì)菌可以重新增殖并對青霉素保持相同的敏感性，為了與傳統(tǒng)意義上的耐藥菌相區(qū)分，他將這部分細(xì)菌命名為“persisters”。與眾所周知的由基因突變或水平基因轉(zhuǎn)移引起的抗生素耐藥性不同，persisters并沒有遺傳上的改變，最小抑菌濃度（mic）不會增大，這種不發(fā)生任何抗性基因突變、僅以非增殖小亞群形式耐受抗生素的現(xiàn)象稱為“persistence” 1。persisters的特點(diǎn)可概括為低活性、多藥耐受、短暫表型性和生長異質(zhì)性。休眠的persisters不會影響藥物與相應(yīng)靶點(diǎn)的結(jié)合，但由于其低下的代謝活動，會導(dǎo)

3、致抗菌藥物無法發(fā)揮殺菌作用，因而具有多種藥物耐受的特性。1 persisters的產(chǎn)生機(jī)制persisters形成機(jī)制不遵循復(fù)雜細(xì)胞功能的單個線性調(diào)節(jié)途徑的控制，它的形成機(jī)制比較復(fù)雜，受多種機(jī)制的調(diào)控，既可以自發(fā)隨機(jī)產(chǎn)生，又可以在環(huán)境壓力下誘導(dǎo)產(chǎn)生，目前對persisters的形成機(jī)制尚無定論，但普遍認(rèn)為與營養(yǎng)限制、抗生素治療、ppgpp（鳥苷四磷酸）調(diào)控、毒素抗毒素系統(tǒng)（ta系統(tǒng)）、代謝調(diào)節(jié)等有關(guān)系。1.1  營養(yǎng)限制微生物在營養(yǎng)缺乏條件下生理機(jī)能將發(fā)生相當(dāng)大的變化，這種變化發(fā)生在微生物群體生長的穩(wěn)定階段。有文獻(xiàn)表明，細(xì)菌培養(yǎng)物在進(jìn)入穩(wěn)定期后開始積累persisters細(xì)胞。營養(yǎng)饑

4、餓會觸發(fā)persisters形成，例如，當(dāng)培養(yǎng)基中的氨基酸或氮缺乏，部分細(xì)菌會進(jìn)入persisters狀態(tài)，導(dǎo)致抗生素治療失效2。1.2ppgpp調(diào)控鳥苷四磷酸（alarmone guanosinetetraphosphate，ppgpp）作為胞內(nèi)信號分子，介導(dǎo)細(xì)菌對環(huán)境脅迫產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，是ta 系統(tǒng)的效應(yīng)物質(zhì)，主要參與細(xì)菌基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。響應(yīng)特定的壓力，spot和rela被激活以合成核苷酸警報(bào)蛋白ppgpp。增加的ppgpp水平通過抑制胞外磷酸酶（ppx）導(dǎo)致無機(jī)多磷酸鹽（polyp）的積累，降低polyp。積累的polyp與lon蛋白酶優(yōu)先結(jié)合，以裂解抗毒素hipb，導(dǎo)致過量的毒素hip

5、a。作為回報(bào)，游離的活性毒素hipa通過其atp結(jié)合位點(diǎn)ser239的磷酸化使gltx失活，結(jié)果是不帶電荷的trna帶有谷氨酸（trnaglu）在細(xì)胞中積累。不帶電荷的trnaglu負(fù)載在空的核糖體位點(diǎn)，并觸發(fā)rela激活更多ppgpp合成，從而促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入休眠狀態(tài)形成persisters細(xì)胞3。1.3ta系統(tǒng)毒素 - 抗毒素系統(tǒng)位于質(zhì)粒上，其編碼能夠抑制細(xì)胞生長的毒素蛋白和抵抗毒素的抗毒素。在正常生長條件下，抗毒素有效地抑制毒素的活性;而在應(yīng)激條件下，抗毒素被選擇性降解，釋放毒素以抑制必需的細(xì)胞過程，如dna復(fù)制和蛋白質(zhì)翻譯，從而導(dǎo)致生長停滯。ta系統(tǒng)在細(xì)菌耐藥性和persister形成中發(fā)

6、揮重要作用。目前根據(jù)它們對應(yīng)的抗毒素的蛋白質(zhì)組性質(zhì)及其不同的調(diào)節(jié)機(jī)制將ta系統(tǒng)分為六類，被稱為i-vi型ta系統(tǒng)。在i型和iii型ta系統(tǒng)中，抗毒素是非編碼rna;在ii型，iv型，v型和vi型ta系統(tǒng)中，抗毒素是一種蛋白質(zhì)。ii型ta系統(tǒng)是目前研究最多的，i型，ii型和v型，涉及persister的形成4。i型ta系統(tǒng)具有非編碼rna抗毒素和蛋白質(zhì)毒素。在這個系統(tǒng)中，小分子反義rna（srna）與毒素的mrna堿基配對以抑制其翻譯。在正常生長條件下，這種雙鏈體抑制核糖體結(jié)合，并且迅速被rnase iii降解。然而，在應(yīng)激條件下，抗毒素srna庫減少，導(dǎo)致現(xiàn)在非雙鏈體毒素mrna的翻譯。ii型

7、ta系統(tǒng)是最大和研究最多的ta系統(tǒng)類，在大多數(shù)自由生活細(xì)菌中鑒定出數(shù)千個ii型ta基因座。ii型ta系統(tǒng)抗毒素和毒素都是蛋白質(zhì)，抗毒素通常具有兩個結(jié)構(gòu)域，一個結(jié)合dna，另一個結(jié)合并抑制同源蛋白毒素的活性。毒素和抗毒素兩個基因的表達(dá)是由ta復(fù)合物在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控的，該復(fù)合物涉及到啟動子區(qū)域與回文序列的結(jié)合（抗毒素和大多數(shù)情況下ta復(fù)合物都結(jié)合ta啟動子以抑制轉(zhuǎn)錄。）。在生長條件下，毒素與抗毒素結(jié)合，后者抑制其活性。在應(yīng)激條件下，活化細(xì)胞蛋白酶如lon和clpxp，其優(yōu)先裂解抗毒素，釋放毒素以通過抑制翻譯或復(fù)制來抑制生長。v型系統(tǒng)中，抗毒素（ghos）是一種rnase（核糖核酸內(nèi)切酶），在生長條

8、件下裂解毒素（ghot）mrna。在應(yīng)激條件下，ghos的mrna被ii型毒素mqsr降解。第一個ta基因座tisab-istr-1參與了sos對dna損傷的應(yīng)答， 該基因座編碼一個有毒的基因tisab和兩個小rna，即istr-1和istr-2。tisab受lexa控制，并因此受到sos反應(yīng)的激活，但只有tisb對毒性負(fù)責(zé)。 istr-2的轉(zhuǎn)錄也受sos調(diào)節(jié)，不參與tisb的控制，而抗毒素istr-1與lexa依賴的啟動子結(jié)合，并通過誘導(dǎo)tisb mrna的rnase iii依賴性切割來抑制tisb的表達(dá)。在沒有sos應(yīng)答的情況下，通過誘導(dǎo)tisb mrna的rnase iii依賴性切割，將

9、istr-1組成性轉(zhuǎn)錄為滅活tisab的毒性。當(dāng)環(huán)丙沙星引起dna損傷時(shí)，它會激活reca蛋白，從而導(dǎo)致lexa阻遏物裂解，然后引發(fā)sos反應(yīng)。控制lex啟動子的抗毒素istr-1幾乎被完全裂解，而毒素tisb逐漸積累并迅速結(jié)合到細(xì)胞質(zhì)膜上，導(dǎo)致膜損傷，質(zhì)子動力（pmf）和atp水平降低。這導(dǎo)致dna，rna和蛋白質(zhì)合成的速率降低，并且阻止了細(xì)胞吸收藥物。結(jié)果，生長減慢并形成了耐多藥的persisters。1.4代謝調(diào)節(jié)任何參與細(xì)菌物質(zhì)合成和能量代謝的過程都可能與persisters形成相關(guān)，其涉及機(jī)制和系統(tǒng)冗繁。lon 蛋白酶參與大腸埃希菌多種抗毒素蛋白的降解，lon 基因敲除株對氨芐西林和

10、環(huán)丙沙星的persisters水平都降低，過表達(dá)lon 蛋白的野生型細(xì)菌persisters水平明顯升高，然而對于缺失10 個編碼mrna 內(nèi)切酶的ta 基因座的突變株，persisters水平并沒有明顯變化5。營養(yǎng)缺乏激活lon 或clp 蛋白酶，降解抗毒素蛋白，釋放hipa、rele 等毒素蛋白。rele裂解mrna 或者通過ppgpp 依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞生長停滯;hipa 能夠磷酸化谷氨酰- trna 合成酶（ glutamyl - trna synthetase，glt x）的293 位絲氨酸并抑制其活性，導(dǎo)致空載glu - trna 增加，激活rela 引起嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)，合成pp

11、gpp，導(dǎo)致細(xì)菌停止生長。2  清除策略研究發(fā)現(xiàn)6抗perpersister化合物根據(jù)其作用機(jī)理，使用不同的策略殺死persisters細(xì)胞。可以通過干擾群體感應(yīng)（m64），sos響應(yīng)（lexa3 inh。），persisters特定基因，固定相呼吸（no）和嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)（relacin）來抑制persisters形成。其他策略包括通過刺激ros的產(chǎn)生（ag +，l-絲氨酸）或刺激細(xì)菌的新陳代謝，從而使persisters細(xì)胞對抗生素敏感，從而刺激抗生素靶標(biāo)（c10，順式-2-癸烯酸）?；蛘?，可以通過改變ph梯度（l-精氨酸）和直接刺激氨基糖苷的攝?。╨-絲氨酸，次離子休克，代謝產(chǎn)物）來

12、增加抗生素的攝取?？梢酝ㄟ^刺激非特異性蛋白酶活性（adep4，拉霉素），dna交聯(lián)（絲裂霉素c，順鉑）或膜去極化（硼霉素，ht61，nck-10）來直接殺死persisters細(xì)胞。直接殺死persisters細(xì)胞的最常見策略是通過廣泛破壞細(xì)菌膜。3 展望由于目前針對persisters形成機(jī)制研究的目標(biāo)菌主要集中在大腸埃希菌，對于其他的細(xì)菌持留狀態(tài)研究較少，因此，需要加強(qiáng)對其他細(xì)菌持留狀態(tài)的研究，以進(jìn)一步明晰不同細(xì)菌的持留機(jī)制是否具有保守性或差異性。尋找轉(zhuǎn)化persisters的藥物是控制慢性感染的關(guān)鍵，未來我們可以在中藥或者天然化合物中尋找能夠促進(jìn)persisters向藥物敏感狀態(tài)轉(zhuǎn)化的物

13、質(zhì)，根據(jù)persisters產(chǎn)生的機(jī)制尋找藥物有效的作用靶點(diǎn)，也可以嘗試研究聯(lián)合用藥先將persisters轉(zhuǎn)化為抗生素敏感狀態(tài)，再利用抗生素徹底消滅的方法。參考文獻(xiàn)：1bigger jw. treatment of staphylococcal infections with penicillin. j.lancet 1944;244：497-500.2brown dr.nitrogen starvation induces persister cell formation in escheridhia coii.j.bacteriol，2019，201（3）：e00622-18.3rock

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