HPLC測(cè)定苦黃顆粒中苦參堿的含量

1、HPLC 測(cè)定苦黃顆粒中苦參堿的含量摘 要：目的 建立苦黃顆粒中苦參堿含量的HPLC 測(cè)定法。 方法采用高效液相色譜法。氨基柱（4.6 mm×250 mm，5m）；乙腈-無(wú)水乙醇-3% 磷酸溶液（32 : 5: 3），流速1.0 mLmin-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，柱溫35，進(jìn)樣量5 L。 結(jié)果 測(cè)得線性范圍0.2060-0.4120g (r=0.999 9)，平均回收率為100.6%，RSD 為1.76%（n=6）。結(jié)論 本方法簡(jiǎn)便可行，重現(xiàn)性好，結(jié)果可靠，可用于苦黃顆粒的質(zhì)量控制。關(guān)鍵詞：HPLC ；苦黃顆粒；苦參堿Determination of Matrine in Ku

2、huang Granules by HPLCWang Chun-fang1，Dong Wei2，(1. Wang Chun-fang, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210009, China; 2.Dong Wei , Lei Yunshang Pharmaceutical Limited Company, Suzhou 215009,China)Abstract :Objective To establish an HPLC method for the determination of matrine

3、 in Kuhuang Granules. Methods HPLC method was adopted. The determination was performed on a Inertsil NH2 column（4.6 mm×250 mm，5m） using acetonitrile-absolute ethylalcohol -3 phosphoric acid（32:5:3）as mobile phase. The flow rate was 1.0 mL·min-1 and the detection wavelength was 203 nm. Colu

4、mn temperature was 35 . The injection volumn was 5 L.Results There was a good linearity within the range of 0.2060-0.4120g(r=0.999 9). The average recovery was 100.6%, RSD=1.76%( n5). Conclusion This method was proved to be simple, accurate and can be used for quality control of Kuhuang Granules.Key

5、 words: HPLC; Kuhuang Granules; matrine 目錄II苦參為豆科植物苦參（Sophora flavescens Ait.）的干燥根,始載于 神農(nóng)本草經(jīng)，列為中品。性味苦寒，歸心、肝、胃、 大腸、膀胱經(jīng)。具有清熱燥濕,殺蟲(chóng),利尿作用。用于熱痢,便血，黃疸尿閉，赤白帶下,陰腫陰癢,濕疹,濕瘡,皮膚瘙癢,疥癬麻風(fēng)；外治滴蟲(chóng)性陰道炎1?？鄥⒅兄饕飰A類成分,同時(shí)還含黃酮類，醌類等成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，其主要有效成分苦參堿（matrine)具有殺蟲(chóng)抗菌、保肝、抗腫瘤、抗心律失常等多種藥理作2?？帱S顆粒是由雷允上制藥有限公司生產(chǎn)的苦黃注射液改劑型而成的新藥, 由苦參

6、、 大黃、柴胡等 5 味中藥組成, 具有清熱利濕, 疏肝退黃的功效, 主治濕熱黃疸, 適用于因濕熱內(nèi)蘊(yùn)引起的黃疸型病毒性肝炎患者的退黃3?？鄥⑹强帱S顆粒中的主藥，而苦參堿是苦參的主要有效成分，所以苦參堿是苦黃顆粒藥品質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分之一?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是采用酸堿滴定法測(cè)定苦黃顆粒中苦參堿的含量,該法操作繁瑣，專屬性差，靈敏度低，準(zhǔn)確度低，有待提高與創(chuàng)新。目前，苦參堿及其制劑的含量測(cè)定方法較多, 如兩相滴定法、 高效薄層色譜法、薄層色譜 - 熒光熄滅法、毛細(xì)管電泳法等4-7, 其中 HPLC 法最為常用。該法具有操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，且符合2010版中國(guó)藥典精神。為有效控制苦黃顆粒藥品質(zhì)

7、量，根據(jù)處方中所含藥味的化學(xué)成分及劑型特點(diǎn), 參考中國(guó)藥典2010年版中一部苦參藥材測(cè)定方法及相關(guān)苦參堿含量測(cè)定的文獻(xiàn)資料, 本文決定采用高效液相色譜法對(duì)苦黃顆粒中苦參堿的含量進(jìn)行測(cè)定，為現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高和修訂提供依據(jù)。1儀器與試藥1.1 儀器日本島津LC-20AD自動(dòng)進(jìn)樣高效液相色譜儀；島津UV-2401PC型紫外分光光度計(jì)；AE200型電子天平，容量瓶、移液管經(jīng)過(guò)校驗(yàn)。1.2 試藥苦參堿對(duì)照品為中國(guó)藥品生物制品檢定所提供（批號(hào):110805-200508），苦黃顆粒( 3批)為蘇州雷允上藥業(yè)有限公司所生產(chǎn) (批號(hào):KC14003、LC14001、LC14002)，乙腈為色譜純，水為二次重

8、蒸餾水,其它試劑均為分析純。2方法與結(jié)果2.1 色譜條件色譜柱：氨基柱Alltima Amino（250mm×4.6mm，5m）；流動(dòng)相：乙腈-無(wú)水乙醇-3% 磷酸溶液（32 : 5: 3）；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm（圖1為苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品扣除空白后獲得的紫外光譜圖）；柱溫：35；流速：1.0ml·min- 1；進(jìn)樣量：5L。理論塔板數(shù)以苦參堿峰計(jì)不低于4000。注：波長(zhǎng)確定寫(xiě)清楚過(guò)程。用什么方法，標(biāo)準(zhǔn)品濃度是多少，多少波長(zhǎng)范圍掃描！圖1 流動(dòng)相的紫外分光掃描圖2.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒重的苦參堿對(duì)照品約5mg，置10 mL 容量瓶中, 加流動(dòng)相溶解

9、并稀釋至刻度, 制成對(duì)照品儲(chǔ)備液(每1 mL 中含苦參堿 0.50 mg)。再精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL, 置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度, 搖勻，即得苦參堿對(duì)照品溶液(每1 mL 中含苦參堿 50 g)。2.3 供試品溶液的制備將苦黃顆粒研磨成粉末，取粉末約1g，精密稱定，置100mL具塞錐形瓶中, 加氨試液1mL，潤(rùn)濕，加三氯甲烷50mL, 密塞, 稱定重量。加熱回流30min, 取出, 放冷, 再稱定重量, 用三氯甲烷補(bǔ)足減失的重量, 搖勻,濾過(guò)，濾液蒸干，用流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 m）濾過(guò), 續(xù)濾液作為供試品溶

10、液。2.4 陰性供試品溶液的制備按照供試品（苦黃顆粒）處方制備不含有苦參的顆粒作為陰性對(duì)照品，取此陰性對(duì)照品粉末約1 g，精密稱定，按“2.3”供試品溶液的制備項(xiàng)下方法制備，得陰性對(duì)照品溶液。2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)分別吸取上述3種溶液各5L注入高效液相色譜儀中，按上述色譜條件測(cè)定，在本系統(tǒng)條件下未見(jiàn)干擾物質(zhì)的影響，苦參堿的保留時(shí)間約為7.0 min，以苦參堿峰計(jì)算理論塔板數(shù)為7000。見(jiàn)圖24。圖2 苦參堿對(duì)照品的HPLC圖圖3 苦黃顆粒供試品的HPLC圖圖4 陰性供試品的HPLC圖3. 方法學(xué)考察3.1 線性關(guān)系試驗(yàn) 精密稱取苦參堿對(duì)照品溶液5.15mg，置50ml容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻

11、度。分別吸取4ml、5ml、6ml、7ml、8ml溶液至10ml容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度。以進(jìn)樣的苦參堿濃度（g/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程方程為：Y=2256685.4X+1608.3（r=-0.9999），結(jié)果表明苦參堿濃度在41.2-82.4g·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。（見(jiàn)表1、圖5）表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果編號(hào) 濃度(g/ml) 峰面積 1 41.2 4686652 51.5 5839353 61.8 7003304 72.1 8127905 82.4 930509 3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一苦參堿對(duì)照品溶液5 L，按上

12、述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得峰面積RSD%=0.20%，表明儀器精密度良好。結(jié)果見(jiàn)表2。表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果編號(hào) 苦參堿峰面積 平均峰面積 RSD(% )1 584750 2 5835663 581929 583325 0.20344 5823075 5840733.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的苦黃顆粒（批號(hào)：KC14003），按“2.3”的制備方法，制備成供試品溶液,置室溫下，依上述色譜條件，過(guò) 1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果供試品溶液峰面積RSD為118（n=5），表明樣品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)表3。表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果編號(hào) 放置時(shí)間( h) 苦參堿峰面積 平均峰面積 RS

13、D(% )1 0 6230482 1 6212933 2 618762 621670 1.18074 4 6327035 8 612544 3.4 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批供試品（批號(hào)：KC14003）5份，按“2.3”供試品溶液制備項(xiàng)下制備成供試品溶液。按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果如下：編號(hào) 苦參堿峰面積 苦參堿含量 平均含量 RSD(g·mL- 1 ) (g·mL- 1 ) (% )1 627463 55.4667 2 621254 54.9164 3 618960 54.7131 55.0435 0.51794 621752 54.96065 624011 55.1608RSD

14、為0.5179%，表明此法重復(fù)性良好。3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的供試品6份，每份加入500ug/ml的對(duì)照品溶液1ml，按“2.3”項(xiàng)下方法制備溶液，在上述色譜條件下測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，得平均回收率為100.6（n=6），RSD%為1.76，結(jié)果見(jiàn)表5。表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）編號(hào) 取樣量 樣品含量 對(duì)照品加入量 測(cè)得量 回收率 平均回收率 RSD(g) (mg) (mg) (mg) (%) (%) (%)1 0.5004 0.6855 0.6695 1.3712 102.4 2 0.5000 0.6850 0.6695 1.3690 102.23 0.4999 0

15、.6848 0.6695 1.3521 99.7 100.6 1.764 0.5004 0.6855 0.6695 1.3605 100.85 0.5007 0.6859 0.6695 1.3396 97.66 0.4998 0.6847 0.6695 1.3613 101.13.6 樣品含量測(cè)定取3個(gè)批號(hào)苦黃顆粒，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算苦參堿的含量，結(jié)果見(jiàn)表6。表6 樣品測(cè)定結(jié)果（mg·mL-1）批號(hào) 各批苦參堿平均含量 （） 三批平均含量 RSD (% )KC14003 54.8832 LC14001 55.5627 54.9

16、413 1.08LC14002 54.37814. 討 論4.1 色譜條件的選擇色譜條件的選擇包括色譜柱類型、流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)等，其中，色譜柱、流動(dòng)相的選擇尤為重要。筆者參考中國(guó)藥典（2010版）一部苦參項(xiàng)下苦參堿含量測(cè)定方法及相關(guān)文獻(xiàn)8-9，考察了C18柱、氨基柱兩種色譜柱及甲醇-水-3% 磷酸溶液、乙腈-水-3% 磷酸溶液乙腈-無(wú)水乙醇-3% 磷酸溶液三種流動(dòng)相系統(tǒng)，經(jīng)梯度洗脫，分析比較得出氨基柱、流動(dòng)相為乙腈-無(wú)水乙醇-3% 磷酸溶液（32 : 5: 3）時(shí)測(cè)定苦參堿，分離效果較好，分析時(shí)間短，線性范圍大。見(jiàn)表7。表7 色譜條件考察結(jié)果色譜柱 流動(dòng)相系統(tǒng) 苦參堿測(cè)定結(jié)果 C18柱 甲醇-

17、水-3% 磷酸溶液 失敗C18柱 乙腈-水-3% 磷酸溶液 失敗氨基柱 乙腈-無(wú)水乙醇-3% 磷酸溶液 成功 此外，用紫外分光掃描流動(dòng)相的波長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)在203 nm處有最大吸收，所以確定檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。而35柱溫、1.0ml·min- 1流速是參考文獻(xiàn)資料而設(shè)定的。在上述色譜條件下，筆者曾比較過(guò)10L和5L的進(jìn)樣量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)進(jìn)樣量為5L時(shí)，苦參堿出峰較好。4.2 供試品溶液制備方法的考察苦黃顆粒供試品的處理是關(guān)鍵，筆者參考2010版藥典及相關(guān)文獻(xiàn)中針對(duì)苦參堿測(cè)定的供試品制備方法10-11，考察了超聲提取、加熱回流提取、乙醚萃取三種提取制備方法，具體如下：超聲提取。將

18、同批號(hào)的苦黃顆粒研磨成粉末，取粉末約1g, 精密稱定，置100mL具塞錐形瓶中, 加氨試液1mL，潤(rùn)濕，加三氯甲烷50mL, 密塞, 稱定重量。超聲30min, 取出, 放冷, 再稱定重量, 用三氯甲烷補(bǔ)足減失的重量, 搖勻,濾過(guò)，濾液蒸干，用流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 m）濾過(guò), 續(xù)濾液作為供試品溶液?；亓魈崛?。將同批號(hào)的苦黃顆粒研磨成粉末，取粉末約1g, 精密稱定，置100mL具塞錐形瓶中, 加氨試液1mL，潤(rùn)濕，加三氯甲烷50mL, 密塞, 稱定重量。加熱回流30min, 取出, 放冷, 再稱定重量,搖勻,濾過(guò)，容器及濾紙用三氯

19、甲烷洗滌，濾液蒸干，用流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 m）濾過(guò), 續(xù)濾液作為供試品溶液。乙醚萃取。將同批號(hào)的苦黃顆粒研磨成粉末，取粉末約1g, 精密稱定，置100mL圓底燒瓶中，精密加入0.2%鹽酸40 mL，稱定重量，加熱回流30min，取出，放冷，再稱定重量，用0.2%鹽酸補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液10 mL，用濃氨試液調(diào)pH至7.8，用乙醚提取4次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，用流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，轉(zhuǎn)移至5 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 m）濾過(guò), 續(xù)濾液作為供試品溶液。將上述三種方法

20、制備的供試品溶液，分別注入高效液相色譜儀，測(cè)定苦參堿含量，分析比較圖譜，結(jié)果表明：超聲提取時(shí)，苦參堿得率較低、雜質(zhì)偏多；乙醚萃取時(shí)，雜質(zhì)雖然較少，但苦參堿回收率極端低；加熱回流提取時(shí)，苦參堿得率較高，雜質(zhì)干擾較少。所以，本文實(shí)驗(yàn)選擇加熱回流提取的制備方法。4.3 苦參堿與氧化苦參堿有資料報(bào)道證明 12 , 苦參堿與氧化苦參堿兩者之間存在著一種動(dòng)態(tài)平衡的轉(zhuǎn)化, 陸蘊(yùn)如 陸蘊(yùn)如，楊鐘柯，董育妹.苦參在復(fù)方中化學(xué)成分變化的研究.中國(guó)中藥雜志，1996，21（7）：412等研究了苦參在復(fù)方中化學(xué)成分的變化，結(jié)果表明，苦參與丹參、茵陳等配伍煎煮時(shí)，藥液中檢不到氧化苦參堿.本品復(fù)方含有苦參、茵陳。氧化苦參

21、堿可能已被轉(zhuǎn)化。4.4 樣品含量測(cè)定本次檢測(cè)的3個(gè)批號(hào)苦黃顆粒樣品中苦參堿含量稍高低不均，考慮可能與苦參藥材的不同批次有關(guān)。由此可以看出，統(tǒng)一藥材的來(lái)源、產(chǎn)地等相關(guān)因素，對(duì)控制制劑質(zhì)量及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證其臨床療效，具有重要的意義。 目前，HPLC法廣泛運(yùn)用于中藥復(fù)方中主要成分的測(cè)定14-15，具有選擇性好、提取完全、精密度良好及回收率符合要求等優(yōu)點(diǎn)，且整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程可操作性強(qiáng)，能客觀地控制本品的質(zhì)量。故對(duì)其含量的測(cè)定多采用此法。苦黃顆粒為雷允上制藥有限公司生產(chǎn)的中藥復(fù)方制劑, 苦參為其主藥，而苦參堿又為苦參的主要成分，具有清熱利濕的功效，故常以苦參堿作為本品質(zhì)量控制的定量指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，H

22、PLC法適用于苦黃顆粒中苦參堿的含量測(cè)定，并且優(yōu)于現(xiàn)有方法，可以有效地提高藥品質(zhì)量及控制質(zhì)量。9參考文獻(xiàn)1 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典:一部S.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010: 188.2苗抗立,張建中,董穎,等.苦參的化學(xué)成分及藥理的研究進(jìn)展J.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2000,13 ( 2) : 69.3 季芳 ,闕瑞 艷 ,周小軍 .高效液相色譜法測(cè)定苦黃顆粒中大黃素和大黃酚的含量J.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) , 2005,28 ( 6 ) : 491.4王以明, 張勇, 汪模輝, 等. 兩相滴定法測(cè)定苦參堿片中苦參堿的含量 J.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā), 2003, 15( 3) : 249- 250, 263.5伍慶. 高效薄層色譜測(cè)定中成