雜交中稻廣兩優(yōu)476品種與純度的鑒定

1、雜交中稻廣兩優(yōu)476品種與純度的鑒定摘要：為辨別雜交中稻廣兩優(yōu)4 7 6種子真?zhèn)尾㈣b定其純度，利 用農(nóng)業(yè)部水稻品種鑒定dna指紋方法(ny/t 1 4 3 3 2 0 0 7 )中推薦的2 4對(duì)引物進(jìn)行per,使用聚丙烯酰胺凝膠電泳 對(duì)廣兩優(yōu)4 7 6及其親本，以及另外幾個(gè)育種常用親本材料進(jìn)行了 多態(tài)性篩選，并利用篩選所得引物的ssr標(biāo)記對(duì)廣兩優(yōu)4 7 6進(jìn)行 了種子純度分析。結(jié)果表明，這2 4對(duì)引物在幾個(gè)常用親本及廣兩 優(yōu)4 7 6間具有良好的多態(tài)性，可用于構(gòu)建廣兩優(yōu)4 7 6的d n a 指紋圖譜。同時(shí)，從中篩選得到標(biāo)記r m 2 0 9和fml7的兩對(duì) 引物在廣兩優(yōu)4 7 6父母本間有顯

2、著多態(tài)性，其中rm 2 0 9的引 物的per產(chǎn)物在2 %瓊脂糖凝膠電泳條件下分辨效果最好，可用于 廣兩優(yōu)4 7 6雜交種子的純度鑒定。2 0 0 9年冬在實(shí)驗(yàn)室使用r m 2 0 9鑒定廣兩優(yōu)4 7 6雜交種子純度，結(jié)果為9 8 . 6%,與 2 0 1 0年春在海南田間種植鑒定純度9 8. 3 %相符。關(guān)鍵詞：s s r標(biāo)記；雜交水稻；廣兩優(yōu)4 7 6；品種鑒定；純度 鑒定the variety and purity indentification of hybrid rice guangliangyou 476d u x u e s h u , q i hua x i ong, x i

3、a m in g y u a n(i n s t itute o f food crops, h u b e i academy o f agricul tural s c i e n ce s , wuhan 4 3 0 0 6 4, china)abstract： 2 4 ssr markers r e c o m m ended b y china national rice r e search i n s t i t u t e were s c r e e n ed； and the markers showing poly morphism among hybrid rice p

4、ar e n t s o f guangl iangyou 4 7 6 and o t h e r popular c u 1 t i v a r s were u s e d for p u r i t y test o f guangl i an g y o u 4 7 6 seeds it was s h o w e d t h a t the ssr markers were with g r eat polymorphism among the par e n t s and guangl iangyou 4 7 6, thu s were s u i table for b u i

5、 1 d i n g o f fingerprint o f guangl iangyou 4 76 .2 ssr markers, r m 2 0 9 and r m 17 , were detected with s i g n i f i c a n t polymorphism between r 4 7 6 a n d guangzhan63s； mo reove r, ban d s o f rm209 were well d e p a r ted b y 2 % agarose g e 1 electrophoresis, making itsuitable for thepu

6、r ity test o f guangl iangyou 4seedthe laboratory testedguangl iangyou 4 7n winter 2 0 0 9 u sr m 2 0 9 was8 .6 %, which was consn t with t hfiled tested r ep r i n g 2 0 1 0 (98. 3 %).key words：s s r ma r k e r ； hybridice； guangl iangyou 4 7 6； variety identification； pur ity identifica tion 獲得高純度

7、的水稻雜交種子是充分發(fā)揮雜交稻雜種優(yōu)勢(shì)潛力的基 礎(chǔ)。|+1于在制種過(guò)程中往往岀現(xiàn)生物混雜、機(jī)械混雜等，導(dǎo)致雜交 種子的純度和真實(shí)性受到影響，因此在水稻雜交種子銷(xiāo)售使用前， 需對(duì)其純度和真實(shí)性進(jìn)行鑒定1 。當(dāng)前鑒定種子純度的方法主 要是田間形態(tài)鑒定法，此外還有種子形態(tài)鑒定法、幼苗鑒定法、葉 色標(biāo)記鑒定法、同工酶電泳法、蛋白質(zhì)電泳法以及近年來(lái)逐漸開(kāi)始 應(yīng)用的水稻d n a指紋圖譜鑒定技術(shù)等2。上述鑒定方法各有 利弊。山間形態(tài)鑒定法結(jié)果較可靠，但存在鑒定周期長(zhǎng)、費(fèi)用高， 受季節(jié)限制，且鑒定結(jié)果是否可靠與鑒定人員經(jīng)驗(yàn)豐富與否相關(guān)； 種子形態(tài)鑒定法、幼苗鑒定法、葉色標(biāo)記鑒定法則受限于檢測(cè)對(duì)象 是否具備典

8、型的特異性狀，適用范圍有限；同工酶電泳法、蛋白質(zhì) 電泳法主要的問(wèn)題是鑒定結(jié)果可靠程度不高；而d n a指紋圖譜技術(shù)，主要是指利用包括r f 1 p > r a p d > a f 1 p和ssr等 分子標(biāo)記技術(shù)，鑒定生物個(gè)體間是否存在內(nèi)在的差異3,因而 鑒定結(jié)果可靠，其中s s r為共顯性標(biāo)記，具有多態(tài)性豐富、簡(jiǎn)便 快捷、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，且鑒定時(shí)間短，費(fèi)用適中，不受環(huán)境影響 等，相比較而言更適用于種子真?zhèn)魏图兌辱b定4。廣兩優(yōu)4 7 6是湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所以廣占6 3 s 為母本，以自主選育的抗白葉枯病和褐飛虱雙抗恢復(fù)系r 4 7 6為 父本選育的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗兩系雜交

9、中稻品種，于2 0 1 0年通 過(guò)湖北省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定，審定編號(hào)2 0 1 0 0 0 4 c 本研究擬通過(guò)篩選農(nóng)業(yè)部頒布的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)水稻品種鑒定dna指紋 方法(ny/t 1 4 3 3 2 0 0 7 )中推薦的2 4個(gè)s s r標(biāo) 記，得到廣兩優(yōu)4 7 6的指紋圖譜及適合用于雜交種純度鑒定的標(biāo) 記。1材料與方法1. 1材料武育粳3號(hào)、黃華占、r 8 38、ii 3 2 b >揚(yáng)稻6號(hào)、廣占6葉枯病基因x飛虱基因b p6、廣兩優(yōu)4 7a 2 1品系i r6以及ibb21、b 5 o含抗白b b 2 1來(lái)自國(guó)際水稻研究所，抗褐1 5品系b 5由武漢大學(xué)何光存教授提供，其他材料來(lái)

10、自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所分子育種 課題組。1. 2. 1水稻d n a的提取 將種子置于發(fā)芽盒內(nèi)發(fā)芽，芽長(zhǎng)3 cm左右時(shí)剪取葉片，參照李進(jìn)波等5改良的c t a b法 提取d n a o12. 2 per反應(yīng)體系per反應(yīng)體系為15 u 1 ,有 1 0 m m o 1 / 11 ( p h 8 3 ), 5 0m o 1 / 1 k c 1 ,1 . 5 mmol/ 1 m g c 1 2 , d nps 各 0. 2 mm og左右的d n a模板，引物各 0 . 2 ii m o 1 /u o反應(yīng)程序?yàn)椋? 4 °c預(yù)變性5 min； 94 °c、3 055

11、°c、3 07 2 °c、1 m i n , 35個(gè)循環(huán)；7 2 °c延伸5 min, 4 t保存。反應(yīng) 在a b i公司9 7 0 0熱循環(huán)儀中進(jìn)行。所有試劑均購(gòu)自寶生物工 程（大連）有限公司。12 . 3 per產(chǎn)物的檢測(cè)per產(chǎn)物使用6 %非變性聚丙烯酰 胺凝膠電泳檢測(cè)，具體方法為取混合有染料指示劑的擴(kuò)增產(chǎn)物2u 1加樣于6 %的非變性聚丙烯酰胺凝膠中，以1 x t b e作電泳 緩沖液，3 0 0 v恒壓電泳，電泳在雙板夾芯式電泳槽（北京六 一儀器廠）上進(jìn)行，根據(jù)染料指示劑的位置終止電泳。電泳后快速 銀染，結(jié)果拍照保存。銀染顯色參照s a n g u i

12、n e t t i等6的方法略作改進(jìn)，方法如下：凝膠經(jīng)去離子水漂洗2次后在 1 g/1 a g n o 3中染色51 0 min,去離子水漂洗2次 后，在15 g/1 n a o h +5 ml/1甲醛中顯色，最后用去離子水漂 洗1次。對(duì)于篩選得到的在雙親之間差異較大的per產(chǎn)物，改用2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。2結(jié)果與分析2. 1 dna指紋圖譜的構(gòu)建對(duì)當(dāng)前育種工作中常用的7個(gè)親本材料使用2 4對(duì)引物進(jìn)行p cr擴(kuò)增，均可以擴(kuò)增出穩(wěn)定的條帶（表1）。其中標(biāo)記r m 2 0 8、r m 2 7 3 . r m 3 3 6和rm72的引物在不同親本間擴(kuò)增岀的 帶型最少，為2種；標(biāo)記r m 2 2

13、4的引物擴(kuò)增出的帶型最多，為 6種?？梢钥闯鲞@2 4對(duì)引物較好地表現(xiàn)出了親本材料的遺傳多樣 性。2.2 s s r標(biāo)記的篩選結(jié)果使用農(nóng)業(yè)部n y/t 1 4 3 3 2 0 0 7推薦的2 4對(duì)引物對(duì)r 4 7 6、廣占6 3 s、廣兩優(yōu)4 7 6和其他育種常用親本進(jìn)行了p c r擴(kuò)增。per產(chǎn)物使用6 %非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)標(biāo)記r m 2 0 9和r m1 7的引物在廣兩優(yōu)4 7 6中擴(kuò)增出 的條帶都涵蓋了父本r476和母本廣占63s擴(kuò)增的條帶（圖1、圖 2） o23引物的per產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中的電泳結(jié)果為降低試驗(yàn)成本、縮短試驗(yàn)時(shí)間，對(duì)篩選所得引物的per產(chǎn)物使用 2

14、%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。其中rm 2 0 9的引物擴(kuò)增出的雜種片 段較為清晰，親木兩條帶型較為明顯，可適用于實(shí)際雜交種純度的 檢測(cè)和鑒定（圖3）。圖3中第7泳道帶型表示雜交種中混雜了父 本種子。2. 4 廣兩優(yōu)4 7 6及含有和同抗病基因株系抗病基因的p c r 結(jié)果從圖4與圖5可以看出，含有抗白葉枯病基因x a 2 1的兩個(gè)親本1 r b b 2 1和r 4 7 6帶型相同，含有抗褐飛虱基因b p h 1 4 的兩個(gè)親本b 5和r 4 7 6帶型相同。2. 5 s s r標(biāo)記在廣兩優(yōu)4 7 6雜種純度鑒定的實(shí)際應(yīng)用2 0 0 9年冬，對(duì)武漢華泰種業(yè)有限公司生產(chǎn)的廣兩優(yōu)4 7 6雜交 種子，抽取

15、5份樣品，每份取2 0 0粒種子，使用s s標(biāo)記rm2 0 9進(jìn)行純度鑒定，鑒定結(jié)果是其純度為9 8.6%。余下種子 同時(shí)在海南冬播進(jìn)行田間純度鑒定，2 0 1 0年春鑒定結(jié)果為983%,結(jié)果基本相符，證明該標(biāo)記的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果準(zhǔn)確 可靠。3 小結(jié)與討論當(dāng)前分子標(biāo)記技術(shù)在雜交種子純度鑒定上的應(yīng)用越來(lái)越多。對(duì)于含 有抗性或其他優(yōu)良基因的品種，通常使用檢測(cè)該基因的共顯性標(biāo)記 來(lái)檢測(cè)其雜交種子的純度。若電泳圖譜顯示出雜合帶型則說(shuō)明雜交 種子是真實(shí)的。該方法的好處在于不需要大批量篩選引物，減少了 工作量。但隨著各種抗性或其他優(yōu)良基因在育種實(shí)踐中的廣泛應(yīng) 用，越來(lái)越多的不同親本含有相同的優(yōu)良基因。同

16、時(shí)商業(yè)制種基地 大多集中分布，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中可能會(huì)有含相同優(yōu)良基因的不同 親本串粉，這樣通過(guò)檢測(cè)單一優(yōu)良基因的基因型就無(wú)法辨別串粉所 造成的偽雜交種。而水稻d n a指紋圖譜技術(shù)在種子鑒定上的優(yōu)點(diǎn) 是標(biāo)記數(shù)量多，涵蓋整個(gè)基因組，反映的是品種間的內(nèi)在差異，避 免了鑒別單一抗性或其他優(yōu)良基因的基因型無(wú)法鑒別上述雜交種 子真?zhèn)蔚目赡苄?。因此，鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。本研究通過(guò)構(gòu)建廣 兩優(yōu)4 7 6的dna指紋圖譜，并篩選出了適合進(jìn)行純度分析的標(biāo)記, 既為今后廣兩優(yōu)4 7 6雜交種了純度的鑒定奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為 其他雜交稻品種的鑒定提供了借鑒。s s r標(biāo)記鑒定雜交種子純度要求簡(jiǎn)便、快捷、成本低。本研

17、究篩 選所得s s r標(biāo)記rm 2 0 9的引物的per擴(kuò)增產(chǎn)物可用瓊脂糖凝 膠電泳檢測(cè)，電泳2 0-3 0 m i n叩可得到結(jié)果，且瓊脂糖可 以重復(fù)使用，不會(huì)造成樣品間干擾，降低了試驗(yàn)成本。此外，張鳳 娟等7 ,王偉威等8 和陳罡等9 對(duì)植物d n a的快速 提取方法進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化，相對(duì)傳統(tǒng)c t a b法而言，雖然提取 的d n a質(zhì)量有所下降，但提取時(shí)間大大縮短，由數(shù)十小時(shí)縮短為 僅2. 5 min,且不影響與多態(tài)性引物的結(jié)合及擴(kuò)增10。 上述快速d n a提取法結(jié)合本研究中采用的分子標(biāo)記檢測(cè)方法可 以大大降低試驗(yàn)成本，提高試驗(yàn)效率。根據(jù)g b / t 3 5 4 35 1 9 9

18、5農(nóng)作物種子檢測(cè)規(guī)程對(duì)聚 丙烯酰胺電泳法測(cè)定大麥、小麥種子純度的規(guī)定，一般每個(gè)樣品測(cè) 定1 0 0粒種子，但在兩系雜交稻種子純度的分子檢測(cè)方面還沒(méi)有 相關(guān)規(guī)定。彭鎖堂等1 1 用s s r標(biāo)記對(duì)雜交稻組合釉優(yōu)6 3 和兩優(yōu)培九分別用1 0 0粒種子進(jìn)行純度鑒定，檢測(cè)結(jié)果與田間鑒 定結(jié)果非常接近。蘇順宗等12利用s s r標(biāo)記對(duì)1 2個(gè)雜交 稻組合進(jìn)行分子標(biāo)記純度檢測(cè)，設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)檢測(cè)2 0 0 粒種子，鑒定結(jié)果經(jīng)過(guò)數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析后認(rèn)為重復(fù)性較好，沒(méi)有顯著 差異。說(shuō)明對(duì)雜交種子進(jìn)行純度鑒定，每份樣品抽樣2 0 0粒已具 有一定的代表性，每份樣品檢測(cè)2 0 0粒種子，結(jié)果已比較可靠。 參考文

19、獻(xiàn)：1 1汪愛(ài)順，李進(jìn)波，劉漢珍.d n a指紋用于雜交水稻種子 純度和真?zhèn)舞b定的研究進(jìn)展j 分子植物育種，2 0 0 5, 3(3 )： 3 9 3 - 4 00 2 鄭成超，溫孚江.d n a分子標(biāo)記技術(shù)與作物品種純度鑒 定j 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1 9 9 7, 2 8 ( 4 )： 4 9 9 - 5 0 5 .3彭鎖堂.中國(guó)主要雜交水稻品種指紋圖譜標(biāo)記和鑒定技術(shù) 的研究d .杭州：浙江大學(xué)，2 0 0 2 .4 方宣鈞，劉思恒，江樹(shù)業(yè).品種純度和真?zhèn)蔚膁 n a分子 標(biāo)記鑒定及其應(yīng)用j 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2 0 0 0, 9 ( 2 )：10 6-1 1 0 5李進(jìn)波，夏明元，戚華雄，等.水稻抗褐飛虱基因b p h1 4和b p h 1 5的分子標(biāo)記輔助選擇j .中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，20 0 6, 3 9 ( 1 0 )： 2 1