瓊脂糖凝膠電泳注意事項實用教案

1、 什么(shn me)是電泳？ 帶電顆粒在電場作用(zuyng)下，向著與其電性相反的電極移動，稱為電泳。 生物大分子如蛋白質,核酸,多糖等大多都有陽離子和陰離子基團,稱為兩性離子在電場中,帶電顆粒向正極或負極遷移,遷移的方向取決于它們帶電的符號。第1頁/共27頁第一頁，共27頁。按分離原理的不同(b tn)，電泳分為4類: 移動界面電泳 區(qū)帶電泳 等電聚焦電泳 等速電泳電泳電泳(din (din yn)yn)有幾類？有幾類？第2頁/共27頁第二頁，共27頁。瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，以瓊脂凝膠作為(zuwi)支持物，利用DNA分子在泳動時的電荷效應和

2、分子篩效應，達到分離混合物的目的。瓊脂糖凝膠電泳原理瓊脂糖凝膠電泳原理(yunl)(yunl)第3頁/共27頁第三頁，共27頁。 瓊脂糖凝膠電泳的操作(cozu)操作步驟 配膠 點樣 電泳(din yn) 成像拍照 EB染色 膠圖分析第4頁/共27頁第四頁，共27頁。1、配膠 按所要分離的DNA分子的大小，稱取適量的瓊脂糖粉末，放入錐形瓶，加適量1TAE電泳緩沖液; 然后置微波爐內加熱搖勻至完全溶化呈透明(tumng)狀，適當冷卻后倒入膠托; 膠完全冷凝后放入電泳槽，電泳槽里的緩沖液必須沒過膠面。第5頁/共27頁第五頁，共27頁。第6頁/共27頁第六頁，共27頁。2、點樣！根據樣品不同可分兩種

3、點樣體系：A、樣品+6Xloading bufferB、樣品可直接點樣（如ssp）最后(zuhu)記得點marker，并擺正膠的位置第7頁/共27頁第七頁，共27頁。點樣第8頁/共27頁第八頁，共27頁。3、電泳！ 點完樣后連接電源，設置(shzh)好電源的參數，開始電泳。當溴酚蘭的帶（藍色）的移動至一定長度即可停止電泳。 電壓要求：20V/CM膠，在樣品出孔用低壓（3V/CM，15min），然后調回標準電壓，跑出的條帶較好。第9頁/共27頁第九頁，共27頁。電泳槽第10頁/共27頁第十頁，共27頁。4、EB染色 溴化乙錠是一種扁平分子，可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間。在紫外線照射EB-DNA

4、復合物時，出現(xiàn)不同的效應。注意：嚴格區(qū)分污染區(qū)和非污染區(qū)，不把污染區(qū)的物品拿到非污染區(qū)，碰過EB的手套(shuto)要及時丟棄！第11頁/共27頁第十一頁，共27頁。EB染膠區(qū)第12頁/共27頁第十二頁，共27頁。5、成像拍照 Tanon-2500數碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(xtng)把圖像攝錄、處理、打印一體化。采用高分辨率CCD，高質量、高清晰度，保證攝錄凝膠圖像在低照度下的靈敏 度、不掉失條帶。第13頁/共27頁第十三頁，共27頁。 Tanon-2500數碼凝膠圖像分析(fnx)系統(tǒng)第14頁/共27頁第十四頁，共27頁。6、膠圖分析 以SBT-PCR為例，主要(zhyo)做A、B、DR三個位點

5、，每個位點條帶大小不同.第15頁/共27頁第十五頁，共27頁。第16頁/共27頁第十六頁，共27頁。一、配膠 1.電子稱的使用，要時刻注意保持電子稱的精確性，保持清潔，根據不同的濃度的膠稱瓊脂糖。 2.加TAE的量要適當，以免配出來的膠太薄導致膠孔太淺或濃度太低。 3.倒膠前膠托一定要洗干凈，并擦干；倒膠時要待膠冷到一定溫度搖勻盡量( jnling)不要產生氣泡。若膠液的溫度太高要頂在膠托防止膠托變形。第17頁/共27頁第十七頁，共27頁。二、點樣電泳(din yn) 1.96孔塑料板要干凈(gnjng)，loading要點均勻，控制在12ul的量，并做好對應標記。 2.加樣時，槍頭要上緊，吸

6、樣均一準確，排液時吸頭不要有殘留。 3.點完樣后及時蓋上膠墊，注意不要蓋反。 4.點電泳前最好檢查待用膠是否合格；點電泳時要對準膠孔，盡量點完所有的樣。 5.點完樣勿忘點marker并擺正膠位，電泳儀正負極不要插反，電泳槽的蓋子要蓋緊。第18頁/共27頁第十八頁，共27頁。三、EB染色(rns) 1.切膠要準，取膠要穩(wěn)，泡膠要慎，避免EB濺起。 2.碰到EB的手套要及時丟棄。 3.EB液要適時跟換，盤子要清洗。 4.抹布要嚴格區(qū)分，不可交叉( jioch)使用。第19頁/共27頁第十九頁，共27頁。四、Tanon Tanon-2500 數碼凝膠圖像(t xin)分析儀的使用 1.使用前要注意清潔，以免影響膠圖的清晰度。 2.照膠時盡量減少開紫外燈的時間。 3.拍照時先關攝像頭再關紫外燈，不可顛倒，嚴格按照(nzho)照膠的流程進行。 4.照好的膠及時丟棄。第20頁/共27頁第二十頁，共27頁。第21頁/共27頁第二十一頁，共27頁。第22頁/共27頁第二十二頁，共27頁。第23頁/共27頁第二十三頁，