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1、聊完以上那些淺顯的基本常識，接下來談我認(rèn)為最麻煩的：首先，抗原抗體識別原理的物理學(xué)解釋，抗體孵育過程實(shí)際上就是一個(gè)競爭結(jié)合的動(dòng)力學(xué)過程。由于抗原和抗體特異性結(jié)合的效率是非特異性結(jié)合的數(shù)百萬數(shù)十億倍，所以當(dāng)特異性抗體與非特異性抗體（不好描述，指添加在抗體稀釋液中的封閉蛋白，我們可以把它們看成非特異性的一抗）競爭時(shí)，盡管抗體稀釋液中封閉蛋白的濃度是一抗?jié)舛?0K：1以上，在碰撞幾率相同的條件下，由于時(shí)間的積累加孵育過程中反復(fù)漂洗（孵育抗體要搖晃，對吧），特異性一抗積累了識別、結(jié)合優(yōu)勢。同樣在TBST等漂洗的情況下，由于親和力等原因，使得一抗很牢靠并進(jìn)一步增加對比優(yōu)勢，再經(jīng)過2抗特異性積累和ECL的

2、最終放大形成特異性條帶和非特異性背景之間熒光信號的巨大差異。由以上碰撞結(jié)合、親和力差異這些基本現(xiàn)象，我們可以解釋W(xué)B中出現(xiàn)的現(xiàn)象。1.在樣品制備章節(jié)中，我強(qiáng)調(diào)PBS漂洗去培養(yǎng)基中BSA的作用。當(dāng)時(shí)只描述了不漂洗的后果，是在BSA位置任何抗體都可以非特異性的結(jié)合從而顯影。用碰撞的原理去解釋：當(dāng)雜帶很濃的時(shí)候，抗體的特異性已經(jīng)毫無意義，它只符合物理定律中的碰撞幾率原理；因?yàn)槟愕碾s帶濃，碰撞幾率大，粘附一抗的機(jī)會多，因此它就會顯出來，但切記這是雜帶。當(dāng)雜蛋白含量高到一定程度，“任何”一種一抗都可以在該位置顯出條帶。因此，用條帶的深淺去判斷是否是靶蛋白，這是非常不科學(xué)的。在默認(rèn)抗體有效的情況下，如果抗

3、原靠近區(qū)域沒有雜帶，背景干凈，依據(jù)分子量大小可以初步確認(rèn)靶蛋白的位置；如果有雜帶，并不一定是特異性條帶就比雜帶亮，也許雜帶蛋白濃度大，非特異性粘附的一抗更多。目前判斷雜帶和靶蛋白的唯一標(biāo)準(zhǔn)是分子量；而當(dāng)分子量大小類似時(shí)，只有通過增加過表達(dá)或IP純化的樣品做陽性對照，或者KD該蛋白的樣品做陰性對照一起電泳轉(zhuǎn)膜，才能準(zhǔn)確區(qū)分靶蛋白和雜質(zhì)。（用IP或KD樣品也是驗(yàn)證商品化抗體是否有效的可靠方案）2.WB結(jié)果白板（無信號）和黑板（高背景）。從抗體孵育角度解釋白板和黑板問題（當(dāng)然也可能與ECL顯影有關(guān)，此點(diǎn)下一節(jié)有闡述），白板主要是可能是抗體本身效價(jià)不高，或者抗體稀釋液中封閉蛋白過多，競爭結(jié)合時(shí)封閉蛋白

4、完全擠掉了特異性的一抗，特異性條帶和非特異性背景同樣結(jié)合強(qiáng)度無信號。黑板，也主要是因?yàn)榭贵w效價(jià)不高，而抗體稀釋液中封閉蛋白的拮抗作用又沒有完全發(fā)揮，此時(shí)無法有效識別抗原的一抗會等效的粘附轉(zhuǎn)印膜的任何位置，顯影后整張膜全黑。有時(shí)候膜接近全黑，但可以若有如無的觀察到靶蛋白，出現(xiàn)問題的原因雖然仍是抗體效價(jià)不高，封閉蛋白不能完全起到作用，不過此時(shí)可以通過改變抗體稀釋液的配方，提高特異性和非特異性結(jié)合的信號差異，降低背景。“這點(diǎn)非常重要”當(dāng)你的抗體標(biāo)不到抗原時(shí)（白板），先弄出條帶（黑板），再解決黑板（高背景）問題。第一步應(yīng)該是通過倍比降低一抗的稀釋比（從1:1K降到1:500到1:250到。；注：二抗稀

5、釋比不要輕易改變，增加二抗?jié)舛葘B結(jié)果不會有太明顯的改變），摸索到一個(gè)可以標(biāo)出信號的條件。此時(shí)，由于一抗?jié)舛冗^高，背景可能非常高，但背景的問題可以再調(diào)整，有沒有特異性條帶卻沒辦法改變；實(shí)在沒有靶蛋白的信號，只能更換別的公司生產(chǎn)的抗體。那么如何通過改變抗體稀釋液的配方，尋求抗體孵育的最佳條件呢？首先要認(rèn)清，抗體稀釋液沒有一個(gè)絕對通用的配方；一種抗體一個(gè)脾氣。其次，抗體稀釋液的配方要兼顧與特異性抗體競爭抗原的強(qiáng)度，以及對其他區(qū)域的封閉強(qiáng)度兩方面的平衡。目前，抗體稀釋液中可以充當(dāng)封閉蛋白的主要有milk，BSA和gelatin，似乎很少的樣子 ?？墒?，你有沒有考慮過“復(fù)方”？這下配方無限多了吧。1

6、. 采用milk，BSA和gelatin的單方。3% milk，5% BSA，<=0.4%的gelatin，并根據(jù)實(shí)際情況改變（若出現(xiàn)白板，請降低封閉劑濃度。；黑板多加）。gelatin大家可能比較陌生，不過如果你翻翻抗體公司賣給你的原裝抗體里面液體的配方，你會發(fā)現(xiàn)很多抗體溶液里都有它。2.很多情況下單方的濃度很高了，背景問題仍不能解決。那么請嘗試兩兩或者三種不同比例混合。不過有些細(xì)節(jié)還是要自己摸索的，比如gelatinBSA時(shí)，gelatin濃度不能無限提高（會完全競爭掉抗原抗體特異性結(jié)合，導(dǎo)致白板），BSA的濃度較隨意。3.抗體稀釋液可用低鹽濃度的TBST，也可用高鹽濃度的緩沖液（N

7、aCl 0.5M）以降低背景；但是切記，有的抗體對鹽濃度敏感，包括構(gòu)象和溶解度，因此需要嘗試。如果以上策略仍然無法解決高背景，可將稀釋好的一抗先跟平時(shí)實(shí)驗(yàn)剪切下來的membrane的邊角料（新的）放在一起孵育個(gè)把小時(shí)再用。如果還不行，徹底無解，結(jié)論抗體太差；請更換別的公司或者抗別的區(qū)段的同種抗體。這三種封閉蛋白的差異：milk和gelatin封閉效果不錯(cuò)且價(jià)格便宜，但milk容易發(fā)霉變質(zhì)，且國產(chǎn)milk脫脂不充分亦增加背景、拮抗抗原抗體結(jié)合（拮抗與抗原結(jié)合尤其突出；更不知道三聚氰胺會不會影響抗原抗體結(jié)合或者ECL！？）；BSA封閉效果不佳，且價(jià)格較昂貴。個(gè)人推薦gelatin，gelatin主

8、要成分是骨膠原，蛋白很大，但可以通過加熱打斷成小蛋白，從而實(shí)現(xiàn)封閉各種分子量大小的蛋白。通常，我會將gelatin加到TBST中后直接滅菌，滅菌過程中，不溶的gelatin會逐漸溶解；由于gelatin可以滅菌（milk不可以），所以同樣條件下，gelatin的存放時(shí)間明顯長于milk。實(shí)際上，抗體可以反復(fù)用很久（通常一般的抗體常規(guī)稀釋比，可以連續(xù)用一個(gè)月以上；對于老手用過2、3次的舊抗體更prefer，因此背景降到很低而效價(jià)正是最高的時(shí)候），通常抗體最后失效的原因不是因?yàn)槭褂么螖?shù)過多，而是染菌；比較舊的抗體都會有很多的沉淀在底部，更長時(shí)間還會有異味。稀釋的一抗靠添加NaN3并于4度保存延長使

9、用時(shí)間；二抗不能加NaN3，但放在-20度反復(fù)凍融延長使用壽命（抗體并非絕對不可以凍融；只是高濃度的原始管抗體的凍融對效價(jià)會有較大影響）。抗體稀釋液（一抗、二抗稀釋液也可同也可不同）和封閉液可以相同，可以不同，因?yàn)榭贵w稀釋液可以采用復(fù)方的，所以即使混合了少許，不會對抗體的使用產(chǎn)生較大的影響。不過封閉液用milk時(shí)，gelatin稀釋的一抗混入少許milk會影響其使用壽命。由于以上諸多可變因素，實(shí)在無法總結(jié)出一種萬金油式的抗體稀釋液（只能是多數(shù)通用），因此對待具體問題時(shí)，請具體對待（多花點(diǎn)心思摸索吧）。原裝抗體的保存：1. 分裝。每次一管，但是可能太多占地方，而且還會有粘壁的損失，不是很推薦。2

10、. 1：1加甘油，凍于-20度，可長期保存，此方法實(shí)際上也被很多國內(nèi)的試劑公司廣泛采用，諸如博士得，中杉，它們小包裝的進(jìn)口抗體通常都是1：1添加甘油保存于-20（不信去查查 ）。值得注意的是：不是所有的抗體都可以1：1添加甘油，要以抗體說明書為準(zhǔn)，如果說明書中本身存在甘油，或特殊注明外，通常可以采用。顯影淬滅的禍因當(dāng)抗體孵育、TBST漂洗結(jié)束后，進(jìn)入ECL顯影步驟。當(dāng)然，目前國內(nèi)一些實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)換用儀器掃描熒光信號，而我們更是二抗直接連熒光蛋白連ECL和常規(guī)的底片顯影都省略了，因此以下所討論的某些細(xì)節(jié)問題可能不再出現(xiàn)。首先壇子上還有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室處于DAB顯色時(shí)代，奉勸一句，都走到最后一步了就不要節(jié)

11、省了；DAB顯色的靈敏性是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。目前較為流行的仍是化學(xué)發(fā)光法，下面簡述一下其原理：交聯(lián)在二抗上的HRP酶能夠特異水解過氧化物產(chǎn)生化學(xué)能；ECL中主要包含兩種成分，催化劑和中間遞質(zhì)（白色瓶子主要是過氧化物如雙氧水）。催化劑的作用不用廢話了，其中間遞質(zhì)主要是吸收化學(xué)能并將其傳遞到luminol之類的化合物上產(chǎn)生電子躍遷從而激發(fā)熒光。因此催化劑的效率和中間遞質(zhì)的傳遞效率直接影響熒光的強(qiáng)弱。本人曾自制過ECL并嘗試改良，其間發(fā)現(xiàn)很多化合物、金屬離子如Fe、Cu等能催化并高效傳遞能量，且不依賴于HRP濃度，熒光信號能瞬間曝強(qiáng)；這其實(shí)與下文提到的一些粹滅原因有聯(lián)系。當(dāng)初我自制的ECL最大的毛病在于穩(wěn)

12、定性不好，同理，商品化的ECL同樣也有保質(zhì)期的問題，往往最先失效的組分就是過氧化物，盡管他們必然添加過抗還原劑。其實(shí)，檢驗(yàn)ECL是否失效的方法很簡單，取稀釋的即用型二抗1-2ul加至ECL混和液中觀察熒光強(qiáng)度，即可知道ECL是否失效。商品化的ECL價(jià)格并不便宜，因此ECL孵育的最佳方案是：將ECL滴加在保鮮膜上或干凈的支持物上，如廢棄的舊底片、塑料盒，有機(jī)玻璃盒等等（注意，國產(chǎn)的保鮮膜很多質(zhì)量不過關(guān)，有兩種潛在的問題，下面詳述），然后倒扣膜于保鮮膜上，夾住一個(gè)角來回拖動(dòng)數(shù)次至ECL均勻（有的產(chǎn)品說明書要求孵育1min）。另外平鋪一張干凈的保鮮膜，將膜揭下控干ECL、倒扣包好，然后顯影。mini

13、3型膠整張膜孵育，ECL總體積0.7-1ml足矣。哪些因素會影響熒光信號的強(qiáng)弱呢？（這部分實(shí)際上與導(dǎo)致熒光淬滅的因素部分重合）1.保鮮膜的質(zhì)量。a.國產(chǎn)的保鮮膜，很多廠家偷工減料打價(jià)格戰(zhàn)，造成保鮮膜很薄亦破損。ECL滴加到保鮮膜上容易從肉眼不易分辯的小孔泄露，一方面ECL反應(yīng)不充分，另一方面ECL所含液體會溶解試驗(yàn)臺上殘留未知的化學(xué)藥品顆粒（也許你或其他人曾經(jīng)不小心打翻過某種化合物）、灰塵等等，造成熒光淬滅。在簡述原理時(shí)，我曾經(jīng)提到過很多化合物、金屬離子能直接催化過氧化物水解，在極短的時(shí)間內(nèi)消耗掉所有的HRP酶，熒光轉(zhuǎn)瞬即逝。b. 保鮮膜的化工原料或拉制過程中，殘留未知的化學(xué)試劑，引起熒光淬滅

14、；廉價(jià)的保鮮膜問題尤多。目前，國產(chǎn)的就“妙潔”比較過關(guān)，保鮮膜厚度和化學(xué)物殘留都不影響ECL顯影。如果買不到合格的保鮮膜，也可以用其他物品替代；但要特別注意這些支持物表面的干凈，最好不要有任何化學(xué)試劑殘留，包括風(fēng)干的TBST鹽結(jié)晶顆粒。2.ECL孵育結(jié)束后膜需要控干。中學(xué)物理學(xué)過水會吸收光譜，因此任何液體包括ECL溶液本身都會干擾熒光強(qiáng)度，所以ECL孵育結(jié)束時(shí)需要控干。一般夾起膜，讓膜的一角或一邊接觸吸水紙；但是請注意不能讓膜完全干掉。某些信號較弱的ECL，膜徹底干掉后熒光會消失；較好的試劑盒，熒光相對穩(wěn)定，但完全吸干以后，背景熒光也會升高，而且會嚴(yán)重影響重新標(biāo)記新抗體時(shí)的背景。因此，按照我的

15、方法，讓自由流下的多余的ECL被吸走就好。3.控干的膜要仔細(xì)用保鮮膜包被，防止接觸外界異物造成熒光淬滅；同時(shí)，包裹保鮮膜時(shí)要細(xì)心，盡量不讓正面保鮮膜和膜之間出現(xiàn)皺褶。皺褶的地方會堆積多余的ECL，要么形成一條熒光的亮線；要么由于液體吸收熒光或者局部區(qū)域HRP過度消耗，呈線條狀淬滅。4.在膜放入壓片夾之前，最好肉眼觀察一下熒光信號的強(qiáng)弱，這有利于判斷實(shí)驗(yàn)可能出現(xiàn)的問題。很多人提問看見很強(qiáng)的熒光了，但怎么壓片都沒有信號，那么就是快速淬滅（閃滅，再怎么快速操作也拿不到這種情況下的熒光信號）造成的；有這個(gè)觀察至少能夠判斷ECL孵育之前實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)該問題不大，而問題主要是淬滅。如果你省略這個(gè)步驟，那問題就

16、非常復(fù)雜了，因?yàn)橹叭魏尾僮鞫伎赡軐?dǎo)致白板，根本無法判斷。除上述的問題以外，還有哪些因素會導(dǎo)致熒光淬滅呢？1. 抗原濃度太高，熒光信號過強(qiáng)，快速淬滅。在電泳的章節(jié)就曾提過，如果上樣量太大，不僅條帶會粘連、彎曲，更可能導(dǎo)致淬滅。因?yàn)榫植繀^(qū)域過多的HRP酶會快速消耗底物呈富氧態(tài)，條帶出現(xiàn)燒灼樣（取出膜會發(fā)現(xiàn)一條明顯的暗黃色的帶），熒光信號會閃滅或者條帶空心（條帶灰黑不實(shí)，則可能是顯影液接近失效）。2. 抗原濃度太低，熒光信號太弱，相對慢一點(diǎn)的淬滅。可能第一次壓片能夠獲得很弱的條帶，隨后都不可見。3. ECL試劑質(zhì)量。除過氧化物因接觸空氣被逐漸還原外，ECL的成分通常都不穩(wěn)定。如呈遞電子躍遷能的中間

17、遞質(zhì)其化學(xué)性質(zhì)就不太穩(wěn)定，因?yàn)樗D(zhuǎn)換能量的特性決定其必是一個(gè)有中間態(tài)的化合物，長期接觸空氣會被逐漸氧化失效；luminol也有保質(zhì)期。4. 操作時(shí)間過長，膜逐漸徹底干掉。商品化的ECL會出現(xiàn)波形漸變，開始信號逐漸增強(qiáng)，背景一起升高；隨后熒光完全衰減淬滅。5.不良的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣。壇子上曾經(jīng)有人問及淬滅問題，提到顯影夾子很臟。臟的顯影夾主要有兩種污染，鐵銹和不慎沾染的顯影液、定影液，前者造成閃滅（催化作用），后者可能直接導(dǎo)致無熒光；只要有任何失誤，諸如不小心刮破保鮮膜，保鮮膜包裹不嚴(yán)實(shí)（其實(shí)通常還真的不嚴(yán)實(shí)，因?yàn)槟悴豢赡馨脦讓樱?。于是，我問他用一個(gè)很臟的東西不覺得很別扭嘛，為什么不先抄起抹布擦干凈

18、再用呢。6.淬滅的假象。少量沾在膜表面的二抗也會激發(fā)熒光，但ECL孵育時(shí)稍微晃動(dòng)就消失了，可能產(chǎn)生淬滅的錯(cuò)覺。Stirpping：完整的WB流程結(jié)束后，可能需要重新標(biāo)記某些膜，這時(shí)候就“可能”需要對膜stripping。這里用了“可能”二字，即不一定必須，那么首先討論一下stripping的必要性。Stripping排除其他的不講，整個(gè)流程會耗費(fèi)不少的時(shí)間，從節(jié)約時(shí)間的角度來講能不做最好；并且stripping條件過于激烈或多輪洗脫時(shí)，還會剝離已轉(zhuǎn)印到膜表面的抗原使WB的最終信號削弱；此外，stripping buffer未清除干凈時(shí)，其中的某些組分一定會干擾第二種抗體的結(jié)合。那么在什么條件下

19、不需要stripping呢？1  當(dāng)A蛋白和B蛋白分子量差別5KDa以上（10KDa左右更保險(xiǎn)），可將膜分割開（分別標(biāo)記不同的抗體），這樣就不需要stripping膜重新標(biāo)記，且一次就能得到想要的結(jié)果。有人會將兩種抗體混在一起標(biāo)記整張膜，這樣操作的前提是非常熟悉這兩種抗體的雜帶位置，且各自的雜帶都不會干擾目的蛋白才可以如此操作；并且這樣的抗體下次使用有了局限性，因此不太推薦。2  兩種抗體種屬來源不同時(shí)，如鼠抗、兔抗等等，即使蛋白位置非?？拷鼰o法切膜，這時(shí)候也不一定需要stripping。輪番標(biāo)記這兩種不同的抗體時(shí)，只需要用TBST涮掉表面的ECL，時(shí)間

20、可長（一時(shí)騰不出手來就扔在那邊一直漂，中間可以換換液）可短（換液涮兩三次），然后直接用第二種抗體標(biāo)記同一張膜。不過，如果其中一種蛋白顯影太強(qiáng)，隔天顯第二種蛋白時(shí)可能會出現(xiàn)干擾（可能強(qiáng)可能弱）；但只要兩個(gè)蛋白不是同樣大小或者連在一起了，可以在最后作圖時(shí)用PS切出來。3  當(dāng)兩種抗體種屬來源相同時(shí)，有一種情況也不需stripping，諸如標(biāo)記某蛋白的磷酸化和總蛋白時(shí)。由于磷酸化抗體通常識別能力較弱（相對于總蛋白而言），信號一般都不太強(qiáng)，此時(shí)也僅需簡單的漂洗；但標(biāo)記的順序一定是先標(biāo)磷酸化后標(biāo)總蛋白。以上避免stripping主要從節(jié)約時(shí)間的因素考慮，實(shí)際上當(dāng)上述2、3點(diǎn)存在時(shí)，個(gè)

21、人還是會用stripping buffer簡單漂一下，然后用TBST換液漂洗3次再上第二種抗體；但如果時(shí)間較緊，就會真的省略。Stripping膜至少有三種方法：A用TBST一直洗膜，洗8hrs以上就可以清除多數(shù)蛋白的信號，信號過強(qiáng)的蛋白如內(nèi)參除外。所以，當(dāng)你的抗體非常弱的時(shí)候，孵育過夜實(shí)際上相當(dāng)于stripping，新的信號不會出現(xiàn)，原來的信號也會被漂洗干凈，出現(xiàn)白板。B請參考millipore PVDF膜附送的說明書配方（沒有，請Google），上面提到如果信號很強(qiáng)，可以在50度反應(yīng)。需要提醒的是，由于巰基乙醇亦揮發(fā)，可以考慮臨時(shí)添加。C如果做過IP，你就知道可以用低pH的Glycine-

22、HCl洗脫beads上特異性吸附的蛋白。同理，0.1M Glycine（pH2.5,30min）也可以用于stripping膜，這是已知最廉價(jià)的高效洗膜方案。而且經(jīng)過TBST （10min*3）漂洗后，膜上的pH早就恢復(fù)到正常值，此時(shí)不存在上述stripping buffer殘留成分干擾第二種抗體標(biāo)記的情況。如果第一種蛋白信號過強(qiáng)，同樣可以在50度stripping提高洗膜強(qiáng)度。此外，膜風(fēng)干后，表面結(jié)合的二抗也會脫落，不過不是很推薦?？赐阺tripping這個(gè)部分，再多想一層，你一定會找到同一張膜多次標(biāo)記不同抗體的竅門。如果有A、B、C三種蛋白，因分子量過于接近無法切膜：a.如果A、B的抗體同

23、是兔抗，C的抗體為鼠抗，則最合理的標(biāo)記順序?yàn)锳-C-B或者B-C-A。b.A、B、C的抗體同種來源，A、B幾乎在一起，條帶粘連；C靠下。如果A、B重要性差不多、B信號稍弱，則B-C-A；如果A的結(jié)果是最關(guān)鍵的，盡管B信號弱，一般還是A-C-B。因?yàn)?，?jīng)過兩次stripping buffer洗脫，且兩輪WB流程的時(shí)長都超過8hrs（一抗習(xí)慣4度過夜孵育），實(shí)際上在標(biāo)記第三種抗體時(shí)，相對于經(jīng)歷了3次不同強(qiáng)度的stripping；不要擔(dān)心第一種抗體還會有很強(qiáng)的干擾。如何正確使用Quantiy One定量：（以下文字系摘錄+改寫整合）WB做完，有時(shí)候我們需要對結(jié)果進(jìn)行定量。目前最備受推崇的應(yīng)該非Bio

24、rad公司的Quantiy One軟件莫屬，然而其$6K左右的售價(jià)令很多人望而卻步；不過，這款軟件之所以敢如此漫天要價(jià)，其最大的優(yōu)點(diǎn)莫過于自動(dòng)識別條帶代替人工分析以降低主觀誤差，同時(shí)它的很多功能滲透了艱深的數(shù)理理論以及概率統(tǒng)計(jì)的原理，這在其它各類免費(fèi)的隨機(jī)附送的蛋白定量軟件上是乏善可陳的。不過，令人扼腕的是，又有多少人真的只是把它當(dāng)做一款普通的“免費(fèi)”軟件在使用著暴殄天物。目前多數(shù)免費(fèi)軟件主要采用的是等高線定量法（Volumn Contour），Quantiy One也包含這部分內(nèi)容且在網(wǎng)絡(luò)教程里面流傳最廣，以至于很多人只會這種并不準(zhǔn)確的蛋白定量方法。等高線定量法通過半自動(dòng)描繪電泳條帶的等高線

25、邊緣來得到等高線區(qū)域內(nèi)部面積，再將該面積乘以區(qū)域內(nèi)平均光密度值得到條帶內(nèi)部總的信號量。這種分析方法有明顯的弊?。喝藶槿Χū尘爸登壹俣ú煌镜赖谋尘傲炼纫恢?；等高線的繪制處于“半自動(dòng)”狀態(tài)，即需要人為判斷作為等高線標(biāo)準(zhǔn)的電泳條帶的邊緣；最致命的是在幾個(gè)電泳條帶距離十分接近的時(shí)候幾乎無法繪制單一條帶的輪廓（常出現(xiàn)連續(xù)的幾個(gè)條帶等高線相連而無法分離出單獨(dú)條帶的輪廓）。 實(shí)際上，最科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牡鞍锥糠椒☉?yīng)該是泳道/條帶軌跡定量法（Trace Tracking）。這種方法使用起來步驟較為繁瑣，必須通過泳道識別-電泳條帶識別這兩個(gè)連續(xù)的步驟才能進(jìn)行定量。但它最大優(yōu)點(diǎn)在于可以完全拋棄人為主觀因素

26、進(jìn)行全自動(dòng)定量。他的定量方式為：首先根據(jù)不同電泳條帶的光密度值繪制光密度曲線，然后計(jì)算光密度曲線下面積作為電泳條帶的定量根據(jù)。其次，它能夠最大程度的排除不同泳道之間的背景差異，讓各個(gè)泳道上的不同電泳條帶在一條幾乎相同的起跑線上進(jìn)行對比；這個(gè)背景排除功能是等高線法無法做到的。最終，采用泳道/條帶軌跡定量法分析條帶光密度后，再結(jié)合Gauss Model Bands對電泳條帶進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)。執(zhí)行步驟：由于Quantiy One只能識別黑白的TIF文件，而實(shí)際上發(fā)表論文時(shí)，很多雜志也要求提供TIF等格式的圖片而非JEPG格式的；因此，考慮到這兩層因素，我建議大家從一開始掃描就統(tǒng)一存貯為TIF格式的圖片。

27、1.創(chuàng)建泳道：a.打開我們要分析的電泳圖片（以蛋白質(zhì)電泳為例）。b.選擇“Lane-Auto Frame lanes”。這時(shí)如果您的電泳圖片比較標(biāo)準(zhǔn)的話，Quantity One就會自動(dòng)識別出每條電泳泳道的位置，而且將各個(gè)泳道的路徑用一條紅線標(biāo)畫出來； 如果您對軟件自動(dòng)標(biāo)記的泳道不甚滿意，您可以通過“Lane-Edit Frame”下級各個(gè)子菜單提供的功能對泳道框架位置、大小等進(jìn)行調(diào)節(jié)；調(diào)節(jié)方法就是通過鼠標(biāo)的拖放來實(shí)現(xiàn)。如果您只需要分析其中幾個(gè)泳道的數(shù)據(jù)而不想其他泳道的標(biāo)記干擾您的視線，您可以通過“Lane-Single Lane-Remove Lane”刪除您不需要的泳道的標(biāo)記。&

28、#160;注意：不是所有的電泳圖片的泳道都能夠被Quantity One自動(dòng)識別。在不能自動(dòng)識別的情況下，Quantity One就會彈出對話框告訴您它不能識別泳道。這時(shí)大家就需要手工繪制電泳泳道。方法和上面一樣，同過“Lane-Single Lane-Creat Lane”來實(shí)現(xiàn)。只要用鼠標(biāo)在您的電泳圖片上順著待標(biāo)記的泳道的中軸線拖放就可以繪制出該泳道的標(biāo)記紅線。2.不同泳道的背景排除：我們要將我們的電泳圖片進(jìn)行前面談到的泳道識別，不管是自動(dòng)方式還是手工識別。然后選擇“Lane-Lane Backgroud.”命令。選擇該命令后，鼠標(biāo)即變成一個(gè)綠色的“+”，將鼠標(biāo)移到您打算進(jìn)行背景排除的泳道

29、，點(diǎn)擊左鍵一下，立刻就會彈出如下圖所示的對話框。 其中“Optical Density”顯示得是該泳道光密度值的分布情況。大家會注意到這個(gè)分布曲線并不是緊貼著縱軸，而是位于縱軸上方分布。造成這個(gè)“懸空現(xiàn)象”的原因就是該泳道自身存在著一定的光密度“背景”。這個(gè)背景的存在導(dǎo)致該泳道上各個(gè)電泳條帶之間不能處于同一水平進(jìn)行對比；如果考慮到相鄰的其他泳道更是因?yàn)椴煌尘暗拇嬖诙鵁o法對比不同泳道上的不同電泳條帶。如何去除這個(gè)背景呢？我們繼續(xù)看右邊的“Lane Backgroud Substruction”對話框。這個(gè)對話框的上方“All Lanes”表示可以對所有泳道進(jìn)行一次性處理；下方的“Se

30、lected Lane”表示僅針對此次選中的這個(gè)泳道進(jìn)行處理。我們用鼠標(biāo)選擇“Selected Lane”的“Lane On”選項(xiàng)。然后在下面的“Rolling Disk Size”里填上“5”，再按“回車”鍵。大家再來看看現(xiàn)在“Optical Density”中出現(xiàn)了一條緊緊沿著光密度曲線分布的醬色曲線。這條曲線將泳道的背景與電泳條帶的光密度分布十分精確的劃分開來。注意：“Rolling Disk Size”是什么意思呢？實(shí)際上就是數(shù)理里面的微分等差逼近。我們可以將Quantity One提供的去除背景功能想象成是一個(gè)滾動(dòng)的小球。如果這個(gè)小球的半徑越小，那么它沿著光密度曲線滾動(dòng)時(shí)滾過的路徑就

31、越發(fā)精細(xì)，具體反映在醬色曲線的軌跡越發(fā)靠近黑色光密度分布曲線的基線。因此從理論上來說“Rolling Disk Size”的取值越小，它的去除背景效果越好。大家可以試著選擇一個(gè)較大的值比如80，再來看看此時(shí)醬色曲線的軌跡。當(dāng)然也不能取太小的值。因?yàn)槿绻≈堤?，大家可以想象這個(gè)十分微小的球就會滾入光密度曲線內(nèi)部，造成有效陽性信號的損失。個(gè)人感覺520是一個(gè)比較好的取值范圍。我們可以對每條泳道依葫蘆畫瓢進(jìn)行以上類似的背景排除工作。不過有時(shí)候如果大家覺得可以使用同樣的標(biāo)準(zhǔn)，即相同的“Rolling Disk Size”進(jìn)行排除，那么我們可以在“Lane Backgroud Substruction

32、”對話框中選擇上方的“All Lanes On(same level)”選項(xiàng)。然后在“Rolling Disk Size”中填上一個(gè)合適的值，點(diǎn)擊“Done”按鈕確認(rèn)就可以了。此時(shí)該電泳圖片上所有的泳道都以相同的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了背景去除。3.創(chuàng)建條帶：前面我們已經(jīng)識別和分析了電泳圖片的泳道，下面我們開始研究電泳條帶的問題。首先在這里明確兩個(gè)名詞翻譯：“Lane”指電泳泳道；“Band”指電泳條帶（在下文中一律使用這兩個(gè)英文名詞來表示這兩個(gè)意思）。 a.電泳條帶的識別：和前面研究Lane一樣，首先我們要對Lane上的Band進(jìn)行識別。識別方式同樣分為自動(dòng)識別和人工識別。自動(dòng)識別的時(shí)候選擇“B

33、and-Detect Bands.”命令。這時(shí)Quantity One會自動(dòng)彈出一個(gè)“Detect Bands”的對話框。注意：第一次用Quantity One時(shí)，您的Bands識別以后僅僅是畫出了一條紅色的粗線，而在上面的演示圖片中卻是上下括號的形式。其實(shí)大家可以在“Band-Band Attributes”選項(xiàng)中設(shè)置Bands的顯示形式。在下方的“Style”選項(xiàng)卡中選擇“Brackets”就會將原來的粗線改為括號形式了。 b.如果要自動(dòng)識別所有Lanes上的Bands就鉤選Lands后面的“All”選項(xiàng)；如果僅僅想自動(dòng)識別某一條Lane上的Bands就鉤選“One”，然后在后面的輸入框中填上您想識別的泳道號碼； 如果僅僅想識別泳道上部分光密度值最強(qiáng)的Bands，可以在“Bands”后面的選項(xiàng)中選擇“Limit”，然后填上相應(yīng)的數(shù)目（比如10）。Quantity One就會僅識別該泳道上光密度最大的10條Bands； 如果您發(fā)現(xiàn)自動(dòng)識別的Bands寬度太窄，圈定Band的紅色括號內(nèi)范圍小于黑色的光密度影。此時(shí)可以使用“Lane Width”命令來調(diào)整Bands識別的寬度。用鼠標(biāo)點(diǎn)擊“Lane Width”后面的向上箭頭就會發(fā)現(xiàn)紅色括號逐漸變寬，最后要求其范圍略為寬過其包繞的Band影跡；&