western blotting

1、Western Blotting樣本的制備:一、 貼壁細胞蛋白裂解相關試劑的配制：1. 20ml 1×SDS Lysis buffer的配方： 2.PBS的配制:將購買的一袋PBS粉末溶于2L DDW中即可標注：1）配PBS的容器以及配好后所盛PBS的瓶子，先用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水過三遍，最后用DDW過一遍。將水控干，即可配制PBS及盛配好的PBS。 2）攪拌用的轉子用自來水沖干凈后，最后也用DDW沖一下，再放到溶液中攪拌。 3）4保存3.試劑來源：Tris-Hcl （100g Solarbio T8230 天津科瑞杰生物 ） SDS （100g USB 75819 北京中原領

2、先科技有限公司 ） 甘油 （500ml Solarbio G8190 天津科瑞杰生物 ） PBS (2000ml/袋 天津伯比特生物技術有限公司 )BCA法測蛋白濃度1. 做標準曲線得出計算濃度公式，現(xiàn)為y=0.0012x0.0854。（y表示OD值，x表示所得濃度ug/ml）2. 待測樣本的制備：一般稀釋5倍（即11ul原液+44ulDDW）；如濃度太高超過標準曲線所繪OD值，應將其稀釋，一般稀釋10倍（即11ul原液+44ulDDW）3. 配制工作夜：A：B=50:1（BCATM Protein Assay ReagentA:500ml Thermo 23228 天津博亞伊諾維信生物技術有

3、限公司）（BCATM Protein Assay ReagentB:25ml PIERCE 1859078）具體根據(jù)所測樣本的個數(shù)決定A、B液各取多少，每個樣本需加兩個副孔，一次實驗需設兩個對照孔。因為 加樣過程會有損耗，故一般多配出100ul即可。4. 在96孔盤中，根據(jù)計算好的孔數(shù)，每孔先加入200ul工作液，兩個孔一組各加入25ul稀釋好的待測樣本,對照組各加入25ulDDW。記好樣本所加位置，以免錯位。5. 充分混勻，在微量震蕩器震30s。6. 37孵育30min。7. 冷卻到室溫，用酶標儀檢測波長為562時各孔的OD值 。8. 根據(jù)標準曲線得出的計算濃度公式來計算每個樣本的濃度。9.

4、 用小標簽紙標好樣本名稱、濃度、日期（寫測BCA當天的日期）。對應貼好，將樣本放20保存。標注：1）37電熱恒溫培養(yǎng)箱需提前開。酶標儀在30min孵育時間開即可。2)每個孔在加樣本時注意不要有氣泡，因為氣泡會影響吸光度，得出的OD值也會不準確。 3）計算時先求出每個樣本OD值的平均值，再代入公式。此時得出的x為稀釋后樣本的濃度，故還需乘以稀釋倍數(shù)才是樣本最終的濃度。 4）待測樣本制備好以后需先將原液放4°。Western Blotting凝膠電泳試劑的配制1. Solution1:（神經(jīng)毒性，戴手套） 丙烯酰胺（acrglamide） 58.4g 加DDW溶解后定容至200ml 避光

5、4°保存BIS (亞甲基雙丙烯酰胺) 1.6g 標注：1）在配置過程中都要避光，容器用錫紙包起來。 2）因為購買的丙烯酰胺純度不是100%，會有一些雜質，所以完全溶解并定容后，還需過濾到棕色瓶內。 3）此試劑在液態(tài)時有毒，故手套接觸其后不要到處亂摸。2. Solution2: Tris 36.3g 溶于150ml DDW SDS 0.8g 調PH至8.8，加DDW定容至200ml，室溫保存。3.Solution3: Tris 6.06g 溶于150mlDDW SDS 0.4g 調PH至6.8，加DDW定容至200ml，4°保存。4. 25% APS：0.25g APS+1m

6、l DDW (APS中文名稱為過硫酸胺)5. 10%SDS：10g SDS+100ml DDW (一般配50ml)6. 5×泳動buffer的配制： Tris 5×6g (30g) Glycine 5×28g (140g) 溶解于1000ml蒸餾水中 SDS 5×1g (5g)1×泳動buffer的配制：200ml 5×泳動buffer800ml蒸餾水7. 蛋白質電泳用5×smaple buffer的配方： 1mol/L Tris-Hcl(PH6.8) 3ml 10%SDS 10ml 甘油 25ml 2-ME(2-巰基乙醇)

7、 2.5ml 0.1%溴酚藍 25ml加DDW定容至100ml 4°保存一般配10ml 5×smaple buffer的配方: 1mol/L Tris-Hcl(PH6.8) 0.3ml 10%SDS(或SDS粉末1g) 1ml 甘油 2.5ml 2-ME(2-巰基乙醇) 0.25ml 0.1%溴酚藍 2.5ml加DDW定容至10ml 4°保存標注：1) 2-巰基乙醇有揮發(fā)性毒性，所以最后再加。2) 1mol/L Tris-Hcl的配方：157.6gTris-Hcl1000mlDDW 調PH值至6.8 。(一般配100ml)3) 0.1%溴酚藍的配方: 0.1g溴酚

8、藍100 mlDDW （此時顏色為紅褐色，稀釋后才為藍色）8. 試劑來源：Tris （500g 北京普博欣生物科技有限責任司）Glycine （500g 天津潤泰公司）SDS （100g USB 75819 北京中原領先科技有限公司）丙烯酰胺 （500g 嘉冠生物）Tris-Hcl （100g Solarbio T8230 天津科瑞杰生物）APS （500g 天津市化學試劑批發(fā)公司生化試劑）2-巰基乙醇（100ml 北京普博欣生物科技有限責任司）轉膜用試劑的配制1. 1L傳遞buffer配方： 甲醇 200ml(最后加) Tris 3.03g 800ml蒸餾水 甘氨酸 14.41 g一般配2L

9、傳遞buffer，具體如下： 甲醇 400ml(最后加) Tris 6.06g 1600ml蒸餾水 甘氨酸 28.82 g2. 試劑來源：Tris （500g 北京普博欣生物科技有限責任司）Glycine （500g 天津潤泰公司） 甲醇 （500ml 天津市明川偉業(yè)生物制品銷售中心）Western Blotting相關的其他試劑配制1. 10×bufferT： Nacl 45g Tris 60.55g 用HCl調PH值到7.5，最后定容至500ml Tween-20 2.5ml1×bufferT: 100ml 10×bufferT900ml DDW2. 500m

10、l APbuffer的配方：Mgcl2 0.5g （5mmol/L）Tris 6.05g（100mmol/L） 用HCl調PH值到9.5，最后定容至500ml Nacl 2.9g （100mmol/L）5%milk：5g milk100ml 1×bufferT 1%milk: 用5%milk稀釋，量根據(jù)所需配制Tween是一種離子表面活性劑，它可加速抗體非特異性結合的分離。3.顯影液的配制： 定影液的配制： 50ml A 40mlA 2.5mlB 145ml蒸餾水 5mlB 155ml蒸餾水 2.88mlC 4.試劑來源：Tris （500g 北京普博欣生物科技有限責任司） Nacl

11、 （500g 北京普博欣生物科技有限責任司） Mgcl2 Milk （伊利）Western Blotting流程一、 Western Blotting電泳用凝膠配制的步驟1.清洗玻璃板，薄厚各兩塊。（用洗潔精清洗，切勿用洗衣粉；新的玻璃板必須用洗潔精洗過后再用。）用自來水沖洗干凈后再用蒸餾水沖洗一次。晾干后再用 2.將兩塊洗干凈的玻璃板（薄厚各一）置于固定架上，薄玻璃在前，厚玻璃在后。在平整的桌面將底部對齊后固定。 3.將膠條放在制膠架的凹巢中，再將裝好玻璃板的固定架固定在制膠架上。 4.按照下面配方配制上下膠溶液 下膠的配方：4%6%8%10%12%14%2塊膠DDW5.3ml4.3ml3.

12、3ml2.3ml1.3ml0.3mlSol.12.0ml3.0ml4.0ml5.0ml6.0ml7.0mlSol.27.5ml10%SDS150ulTEMED12ul25%APS50ul4塊膠4%6%8%10%12%14%DDW10.6ml8.6ml6.6ml4.62.60.6Sol.14.0ml6.0ml8.0ml10.0ml12.0ml14.0mlSol.215.0ml10%SDS300ulTEMED24ul25%APS100ul上膠的配方：2塊膠4塊膠DDW2.65ml5.8mlSol.11ml2mlSol.23.75ml7.5ml10%SDS75ul150ulTEMED6ul12ul2

13、5%APS25ul50ul 標注：上、下膠在加完10%SDS時，將上膠擱置一旁，先不加TEMED、25%APS。5.下膠配制好后，充分混勻即可灌膠，注入膠的位置由所加樣本的體積來決定。加完下膠后要立即加水來封閉，使下膠凝固。（一般上膠的長度為1cm） 標注：1) 加水時，用力要快而勻速，將氣泡排出。切不可將水朝一個地方加，這樣會導致膠的上邊緣不在同一水平線上。 2) 下膠和水出現(xiàn)分界線，大約需十幾分鐘的時間。這也需看膠的濃度，濃度越小的膠，出現(xiàn)分界線的時間會延長。6.等下膠和水出現(xiàn)一條很清晰的分界線時，即可將水沿一側傾斜倒掉，用吸水紙從一旁全部吸出。此時將TEMED、25%APS加入上膠，充分

14、混勻后加膠，使其漫過薄玻璃板的上邊緣，吸走氣泡，把梳子的正面朝向自己，將梳子的左右兩邊同時插入膠內，直到梳子不能再向下插。（也即梳子的上邊緣是和后玻璃板的上邊緣是相平的） 標注：1）梳子的厚度和使用的玻璃板是相對應的。我們一般使用1.5mm的梳子。 2）插梳子時一定要注意梳子和膠之間不可以有氣泡，尤其是梳子的底部。 3）上膠凝固的時間一般會2個小時。一般用手輕輕敲擊插有梳子的玻璃板，不出現(xiàn)有膠流動即可以使用。7.膠凝固后，取下玻璃板，將下面多余的膠用面巾紙擦去。將玻璃板裝在泳動裝置上（插有梳子的面相對，厚玻璃板向外），夾上夾子，放至泳動盒內。加入1×泳動buffer，先加到泳動盒的一

15、半，將泳動盒傾斜，將底部的氣泡趕出，再將1×泳動buffer緩緩加入，加到與厚玻璃板相平。電泳液不可以沒過電極8.雙手輕輕拔起梳子，要垂直向上拔，不可以前后左右晃動。9.加樣。（提前計算好） 標注：1）樣本由三部分組成，即樣本的蛋白、DDW、5×smaple buffer。配上樣的樣本遵循的原則：5×smaple buffer為總體積的1/5，最后用水補齊。配好后沸水煮沸5min。 2）加不同的樣本之前要先洗槍頭。 3）在上樣時邊加邊向上提槍頭，直到最后一滴液體打出，盡量不要吹起氣泡，以免已加入的樣本的被吹出所在泳道孔。 4) 上樣順序一定要提前合理設計好，然后按

16、照順序來加。10.電泳：恒流，兩塊膠時上膠用40mA，等Marker剛剛分離時，開始將下膠調為70 mA。（電壓不可以超過110V）11.電泳結束前十幾分鐘，準備傳遞時所需的東西，具體如下： 1）將傳遞buffer倒入不銹鋼托盤中，初學者應盡量多倒一些，以便后面的操作。 2）將傳遞架（黑白兩片組成）打開，白片在下，上面依次為一塊海綿、三張濾紙、硝酸纖維素膜。同時在旁邊再放三張濾紙和一塊海綿。如要轉兩塊膠，需同樣再放置相同的一套物品。12. 電泳結束，將玻璃板取出，左手拿玻璃板（厚玻璃板在下，薄玻璃板在上，并且上膠在上下膠在下），右手拿綠色鏟子，輕輕從兩塊玻璃板的一側撬開，將薄玻璃板取下，電泳膠

17、留在厚玻璃板上。用綠色鏟子的一頭沿分離線將上膠完全切下，扔至垃圾桶內。盡 量不要有殘余的上膠。用綠色鏟子將膠的兩邊稍稍撬起一些，以便膠容易從玻璃板脫離下來。13. 將玻璃板反過來，輕輕靠近傳遞buffer中已擺放好的濾紙，將玻璃板稍稍上下移動，膠很容易就會脫落到濾紙上，然后用手在傳遞buffer中調整膜的位置到濾紙的中間，左手輕輕壓著膠，用右手向兩側輕撫膠，將膠與濾紙之間的氣泡趕出，右手整體移動濾紙到海綿中央。左手輕輕按住下層，右手拿泡好的另外三張濾紙與下層對齊后平放到膠的上方，同樣的操作再將另外一塊海綿放到濾紙上面。此時左手仍按住所有下層的東西，右手拿綠色鏟子的側面向外輕刮海綿，以便氣泡可以

18、排出。排完氣泡后，將黑色的一面輕輕蓋下來，同時左手慢慢移出。將白色夾子完全推回去，夾緊。 標注：1）在整個傳遞過程中，左手始終不能離開跟膠接觸的東西，一層一層必須按壓住，以免膠的位置改變。 2）整個傳遞夾的順序為白色底面一塊海綿三層濾紙膠三層濾紙一塊海綿黑色底面，如果順序弄反，蛋白將轉不到膜上。 3）Marker一般在膠的右邊，分子量大的蛋白靠近白色夾子處，分子量小的蛋白也即膠的下緣靠近傳遞夾的折疊處。 4）按壓膠時，切不可用太大的力。且受最好不要按壓住實驗所需蛋白在膠上所在的部位。14.將傳遞夾放置到傳遞芯（黑紅兩面）中，正確放置方法為：首先要黑對黑，白對紅放置，然后傳遞夾的折疊處向下，白色

19、夾子在上，將傳遞夾裝到傳遞芯中。15.將傳遞芯放到傳遞盒中，兩端電極要架到盒子上方的中央，再將裝好冰的白色冰盒放到傳遞盒內傳遞芯的旁邊，將整個傳遞盒放到一個大盆中，然后把剛剛跑過膜的傳遞buffer倒入傳遞盒內，倒入的量取決于將白色冰盒按下去，正好液面與傳遞夾頂端相平，且不淹沒電極為止。16.蓋上蓋子（黑對黑，紅對紅）。用冰將整個傳遞盒覆蓋。17.開啟電泳儀，插好電源，打開開關，等顯示屏亮了以后，將電流調為恒流250mA。按下“run”鍵，即開始傳遞。一般傳遞2個小時，分子量超過120kDa一般傳遞3小時以上。標注：1）關閉電泳儀時先按“stop”鍵，再關閉電源。 2）傳遞時間比較長，電流比較

20、大，在傳遞過程中儀器會變熱，故要一起上方加冰袋。18.傳遞結束，將膜取出（沿著膠的輪廓剪下來，在膜的左上角剪一斜角）。放到有1×bufferT的盒中，搖床上晃動5min。19.將1×bufferT全部倒出，加入5%milk封閉1小時。根據(jù)所作目的蛋白和經(jīng)驗，封閉時間可以適當延長。20.加一抗，根據(jù)實驗設計將膜按照分子量指示剪成若干條，然后再根據(jù)一抗稀釋倍數(shù)和所剪膜的大小需加多少量來配制抗體稀釋液（即用1×bufferT 將5%milk稀釋成1%milk）。剪兩片比膜大的薄塑料膜，先將兩邊用封口壓膜機壓好，用鑷子夾住膜沒有目的條帶的地方（最好是Marker那個地方）

21、，將膜平整的放進去，然后再將長的一邊用封口壓膜機封起來，留一個小口，把抗體稀釋液加進去，再加入相應抗體?；靹颍瑢馀萋懦?，再用封口壓膜機把最后一個邊壓住。4過夜。21.第二天早上，將膜用鑷子拿出放到一個盒中，加入1×bufferT，洗三次，一次10min且在搖床上晃動。22.加二抗，一般在配套的盒中加5ml 1%milk，再根據(jù)二抗比例加入二抗。室溫孵育2h23.將二抗稀釋液全部倒出，加入1×bufferT，洗三次，一次10min且在搖床上晃動。24.顯色有兩種辦法，根據(jù)二抗相偶聯(lián)的酶來決定。 1）二抗是HRP（辣根過氧化物酶）偶聯(lián)，則最后進行曝光系統(tǒng)： ECL由A、B

22、液組成，根據(jù)膜的大小按照1：1的比例來配。配好的管需用錫紙包起來，進入暗室來加。具體如下：首先鋪一塊保鮮膜，把膜放上面，再將ECL加到上面，以全部覆蓋膜為止，約一分鐘用保鮮膜把膜包起來。根據(jù)不同時間開始曝光，壓片時切記不可以來回移動，正確做法為膠片的底邊與膜的底邊對準，直接從上面同時壓下去，蓋上蓋開始計時曝光。 標注： ECL 來源：A、B液各50ml, MILIPORE。2）二抗是AP（堿性磷酸酶）偶聯(lián),則直接在膜上顯色： 發(fā)色液的配制：5ml AP buffer 中各加16.5ul BCIP、NBT。（現(xiàn)用現(xiàn)配） 將洗液全部倒掉，殘余液體用槍頭吸干盡。加入發(fā)色液開始發(fā)色。等膜上出現(xiàn)需要的且

23、滿意的條帶時，即刻用自來水反復沖洗來終止發(fā)色。 標注：1）NBT 用70%DMF來溶，配成濃度為100mg/ml（DMF用DDW來稀釋） BCIP 直接用DMF來溶，配成濃度為50mg/ml 2）NBT 100mg 天津伯比特生物技術有限公司 BCIP 100mg 天津伯比特生物技術有限公司 DMF 100ml BIO BASCI INC1 PVDF膜PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白質印跡法中常用的一種固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔徑有大有小，隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量的蛋白結合就越牢固。大于20000的蛋白選用0.45um的膜，小于20000的蛋白選用0.2um的膜。PVDF膜在使用時需預處理，用甲醇處理的目的是活化膜上的正電基團，使其更容易與帶負電的蛋白結合。PVDF膜具有較高的機械強度，是印跡法中的理想固相支持物材料2 分類1、水處理用PVDF膜，分為超濾膜和微濾膜兩種，主要用于污水、海水淡化等的前處理，清除大分子、細菌、泥沙等雜質2、戶外建筑用PVDF膜，主要用戶戶外建筑的玻璃、外墻、戶外廣告牌等的保護，主要是耐老化和耐磨功能3、電池用PVDF膜，包括在燃料電池和鋰離子聚合物電池中的隔膜應用3 PVDF的主要性能優(yōu)