有機(jī)柱-薄色譜(知識(shí)歸納)

1、第三章色譜分離技術(shù)早期，因采用此法來(lái)分離有色物質(zhì)時(shí)，常得到顏色不同的色層，故取名色（層）根據(jù)組分在固定相中的作用原理不同，色譜法可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、和排阻色譜等；根據(jù)操作條件不同，可分為柱色譜、紙色譜、薄層色譜、氣相色譜及高壓液相3.1柱色譜柱色譜因在柱狀管中裝入適當(dāng)?shù)墓腆w物質(zhì)作為固定相而得名，通常分為吸附色譜和分配色譜，實(shí)驗(yàn)中最常用的是吸附柱色譜。基本原理吸附色譜的分離原理是利用混合物中各組分在不相混溶的兩相（即流動(dòng)相和固定 相）中吸附和解吸的能力不同（即在兩相中的分配不同），當(dāng)混合物隨流動(dòng)相流 過(guò)固定相時(shí)，發(fā)生反復(fù)多次的吸附和解吸過(guò)程，從而使混合物分離成兩種或多種 單一

2、的純組分。柱色譜可分為：干柱色譜和濕柱色譜。干柱色譜的操作 是用吸附劑填滿一空柱，將要分離的混合物溶液加入柱頂，使溶 液借毛細(xì)作用和地心引力向下移動(dòng)而將各組分展開(kāi)分離。 展開(kāi)完畢，將吸附劑從 柱內(nèi)移出，用適當(dāng)溶劑分別提取已分離的各組分層帶， 回收溶劑，即得分離的各 個(gè)組分。濕柱色譜是用洗脫劑把要分離的各個(gè)組分逐個(gè)洗脫分離的一種色譜分離技術(shù)。吸附劑常見(jiàn)的吸附劑有硅膠、氧化鋁、碳酸鈣、氧化鎂和活性炭等，實(shí)驗(yàn)室最常用的吸附劑是氧化鋁和硅膠，其中氧化鋁極性更大一些。氧化鋁分為三種:中性氧化鋁：PH值約為7.5,用途最廣，適用于中性物質(zhì)分離，如醛、酮、酯、醌等有機(jī)物酸性氧化鋁：PH值約為4,適用于分離酸

3、性有機(jī)物。堿性氧化鋁：PH值約為10，適用于分離堿性有機(jī)物。硅膠略帶酸性由于樣品是被吸附在吸附劑表面，所以大小均勻、比表面積的吸附劑分離效率較 好。比表面積越大，組分在流動(dòng)相和固定相之間越易達(dá)到平衡，色帶就越窄。通常使用的吸附劑大小以200目為宜，太細(xì)則分離速度過(guò)慢。吸附劑的活性取決于吸附劑的含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)。含水越高，活性越低。表3-1吸附劑的含水量質(zhì)量分?jǐn)?shù)和活性等級(jí)關(guān)系吸附劑活性等級(jí)IIIIIIIVV氧化鋁的含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)03%6%10%15%硅膠的含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)05%15%25%38%洗脫劑能將樣品中各組分完全分開(kāi)的展開(kāi)劑，即可作為柱色譜的洗脫劑。有時(shí)用一種 展開(kāi)劑達(dá)不到所要求的分離效果，可考慮

4、混合展開(kāi)劑。選擇洗脫劑注意：1、洗脫劑的極性應(yīng)小于樣品中各組分的極性，否則由于洗脫劑與樣品競(jìng)爭(zhēng)，會(huì)導(dǎo)致洗脫劑被吸附在固定相上，而樣品一直保留在流動(dòng)相中。溶劑極性一般按以下順序遞增：己烷、石油醚、環(huán)己烷、甲苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙醇、乙醇、甲醇、水和乙酸。2、所選擇的洗脫劑必須能夠?qū)悠分懈鹘M分溶解。3、所用洗脫劑必須干燥，以免影響吸附劑的活性和分離效果。4、不同的洗脫劑具有不同的洗脫能力（即給定樣品沿著固定相的相對(duì)移動(dòng)能力）操作方法1、裝柱：濕法裝柱和干法裝柱2、上樣及洗脫3、收集組分。本實(shí)驗(yàn)是以小型層析柱分離偶氮苯與鄰-硝基苯胺的少量混合溶液。所用主要儀器及藥品為：層析柱：長(zhǎng)2

5、5cm，內(nèi)徑1 cm吸附劑：市售中性氧化鋁（100 目, U川級(jí)）10g。淋洗劑：1,2-二氯乙烷與環(huán)己烷等體積混合液 80100mL ,95%乙醇（備 用）。待分離混合樣：1 %偶氮苯的1,2-二氯乙烷溶液與1 %鄰-硝基苯胺的1,2-二氯乙 烷溶液的等體積混合液約1 mL 0（1）濕法裝柱：將洗凈晾干的層析柱中注入約為柱容積 1/4的淋洗劑。將淋濕 的一小團(tuán)脫脂棉推入柱底狹窄部位（勿擠壓太緊），上面加蓋一張直徑略小于柱 內(nèi)徑的濾紙片。將10g中性氧化鋁在小燒杯中用淋洗劑調(diào)成懸濁狀。打開(kāi)柱下 活塞調(diào)節(jié)流速約1滴/秒，將制成的懸濁液在自柱頂注入，可敲擊柱身以使吸附 劑沉積均勻。在此過(guò)程中應(yīng)始終

6、保持吸附劑沉積層上面有一段液柱。吸附劑加完 后關(guān)閉活塞，將一塊濾紙片蓋在吸附劑沉積面上。（2）加樣：打開(kāi)柱下活塞放出柱中液體，待液面降至濾紙片時(shí)關(guān)閉活塞，將1 mL 待分離的混合樣液沿柱內(nèi)壁加入。打開(kāi)活塞，待樣液液面至濾紙片時(shí)關(guān)閉活塞。 用干凈滴管吸取淋洗劑約0.3 mL沿加樣處沖洗柱內(nèi)壁。再打開(kāi)活塞將液面降至 濾紙?zhí)?。依上法重?fù)操作直至柱壁和頂部的淋洗劑均無(wú)顏色。（3）淋洗和接收：加入大量淋洗劑，打開(kāi)柱下活塞，控制流出速度為1滴/秒。觀察柱中色帶下行情況。隨著色帶向下行進(jìn)逐漸分為兩個(gè)色帶， 下方的為橙紅或 橙黃色，上方為亮黃或微帶草綠色，中間為空白帶。當(dāng)前一色帶到達(dá)柱底時(shí)更換 接收瓶接收（在

7、此之前接收的無(wú)色淋洗劑可重復(fù)使用）。當(dāng)?shù)谝簧珟Ы邮胀旰蟾?換接收瓶接收空白帶，當(dāng)空白帶按完后再換接收瓶接收第二色帶。吞一席制圖1柱色譜裝置3.2 紙色譜（PPC）基本原理紙色譜是以濾紙作為載體，讓樣品溶液在紙上展開(kāi)達(dá)到分離的目的。紙色譜法的原理比較復(fù)雜，主要是分配過(guò)程，紙色譜的溶劑是由有機(jī)溶劑和水組成的， 在濾紙的一定部位點(diǎn)上樣品，當(dāng)有機(jī)相沿濾紙流動(dòng)經(jīng)過(guò)原點(diǎn)時(shí)，即在濾紙上的水 與流動(dòng)相間連續(xù)發(fā)生多次分配，結(jié)果在流動(dòng)相中具有較大溶解度的物質(zhì)隨溶劑移 動(dòng)的速度較快，而在水中溶解度較大的物質(zhì)隨溶劑移動(dòng)的速度較慢，這樣便能把混合物分開(kāi)。實(shí)驗(yàn)裝置圖2紙色譜圖3紙色譜濾紙條點(diǎn)樣1.層析缸2.濾紙3.展開(kāi)劑

8、本實(shí)驗(yàn)是以紙色譜分離幾種氨基酸為例本實(shí)驗(yàn)以飽和水的正丁醇溶液作展開(kāi)劑， 通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)出丙氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸的Rf值，并分析測(cè)定未知試樣的成分或組成。1. 濾紙的選擇濾紙的質(zhì)量應(yīng)厚薄均勻，能吸附一定量的水，可用新華 1號(hào)，切成紙條，大小可 自由選擇，一般為3X20cm，5X30cm，8>50cm等。濾紙用前應(yīng)經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，觀察 分離效果，色點(diǎn)邊界清晰為好。2. 配置展開(kāi)劑正丁醇：水：乙酸=4 : 5 : 1 （體積比）按他們用量比例，先將正丁醇與水在分液 漏斗中一起振搖1015分鐘，然后加乙酸再振蕩。靜置分層，下層棄去，上層 作為展開(kāi)劑，將展開(kāi)劑倒入層析缸內(nèi)蓋上蓋，放置 0.5小時(shí)，使缸內(nèi)形

9、成飽和蒸 氣。3. 顯色劑95份正丁醇及5份（體積比）2 mol?_-1的CH3COOH混合作為溶劑，加入茚三 酮配成0.1%的溶液。4 .取5X30cm的濾紙一張，在距離一端2 cm處用鉛筆輕劃一直線，在直線上用 鉛筆輕輕地劃4個(gè)“X號(hào)，并注上號(hào)碼1, 2, 3，在各點(diǎn)上用毛細(xì)管（管口 要齊）分別點(diǎn)上谷氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸已知樣，在第四點(diǎn)上，點(diǎn)上未知樣， 每加一點(diǎn)樣品就用吹風(fēng)機(jī)以溫?zé)岬娘L(fēng)吹干，每個(gè)樣品點(diǎn)三次。將層析液倒在一培養(yǎng)皿中（約 11.5 cm深），先將點(diǎn)好樣的濾紙上端夾在支架 上，下端放在皿的外邊（不要與溶劑接觸），蓋上層析缸蓋。10分鐘后，濾紙吸 附蒸汽達(dá)到平衡，用夾子將濾紙下端

10、迅速放入皿中，溶液因毛細(xì)現(xiàn)象逐漸向上滲 透擴(kuò)散，當(dāng)前沿距樣15cm左右處停止展析，取出濾紙，用鉛筆劃出溶劑前沿線。晾干，噴上顯色劑到剛好潤(rùn)濕濾紙，用吹風(fēng)機(jī)吹干，并在8590 C烘干，則顯出紫紅色斑點(diǎn)。（1）計(jì)算已知樣和未知樣各點(diǎn)的 Rf值。（2）根據(jù)已知樣和未知樣各點(diǎn)的 Rf值。做定性分析。比移值（Rf）表示物質(zhì)移動(dòng)的相對(duì)距離只彳=溶質(zhì)移動(dòng)的距離f =溶液移動(dòng)的距離例如:12cmRf （化合物 A） = 30空=0.253.3 薄層色譜（PPC）薄層色譜（Thin Layer Chromatography）常用TLC表示，又稱薄層層析，屬于 固-液吸附色譜。薄層色譜是在被洗滌干凈的玻板（10X

11、3cm左右）上均勻的涂 一層吸附劑或支持劑，帶干燥、活化后將樣品溶液用管口平整的毛細(xì)管滴加于離 薄層板一端約1cm處的起點(diǎn)線上，涼干或吹干后置薄層板于盛有展開(kāi)劑的展開(kāi) 槽內(nèi)，浸入深度為0.5cm。待展開(kāi)劑前沿離頂端約1cm附近時(shí)，將色譜板取出， 干燥后噴以顯色劑，或在紫外燈下顯色。記下原點(diǎn)至主斑點(diǎn)中心及展開(kāi)劑前沿的 距離，計(jì)算比移值（Rf）：溶質(zhì)移動(dòng)的距離Rf =溶液移動(dòng)的距離3.3.1實(shí)驗(yàn)裝置色譜展開(kāi)毛細(xì)管點(diǎn)樣以薄層色譜分離偶氮苯和鄰-硝基苯胺為例操作步驟（1）配制CMC溶液：按照每克羧甲基纖維素鈉（CMC）100 mL蒸餾水的比 例在圓底燒瓶中配料，加入幾粒沸石，裝上回流冷凝管，在石棉網(wǎng)上

12、加熱回流至 完全溶解，用布氏漏斗抽濾。也可在配料后用力搖勻，放置數(shù)日后直接使用。（2）調(diào)漿：稱取適量的硅膠H于干凈研缽中，按照每克硅膠H2.53mL溶劑 的比例加入CMC溶液，立即研磨，在半分鐘內(nèi)研成均勻的糊狀。（3）制板：將已經(jīng)洗凈烘干的載破片水平放置在臺(tái)面上，用干凈牛角匙舀取糊狀物倒在載玻片上，迅速攤布均勻。如不均勻，可輕敲載玻片側(cè)沿使之流動(dòng)均 勻。一般不可再加入糊狀物，否則會(huì)形成局部過(guò)厚。每塊板 1滿匙，鋪制6塊板 約需硅膠H3.5g，鋪制過(guò)程應(yīng)在35分鐘內(nèi)完成。(4) 活化：待硅膠固化定型并晾干后，移入搪瓷盤內(nèi)，放進(jìn)烘箱烘焙。升溫 至110120 C保持半小時(shí)，切斷電源。待冷卻至不燙手

13、時(shí)取出使用。如不很快 使用，應(yīng)放進(jìn)干燥器中備用，或裝進(jìn)塑料袋中扎緊袋口備用。(5) 點(diǎn)樣：在距薄層板一端約1 cm處用鉛筆畫一水平橫線作為起始線。用平口毛細(xì)管在起始線上點(diǎn)樣，每塊板上點(diǎn)兩個(gè)樣點(diǎn)，樣點(diǎn)直徑應(yīng)小于2 mm，間距至少1 cm。如果溶液太稀，樣點(diǎn)模糊，可待溶劑揮發(fā)后在原處重復(fù)點(diǎn)樣。可留下一塊薄層板作機(jī)動(dòng)，其余五塊板每塊上各先點(diǎn)一個(gè)混合樣點(diǎn)，另一樣點(diǎn)依次為：(a)混合樣，(b)偶氮苯；(c)鄰硝基苯胺；(d)色帶I； (e)色帶U。(6) 展開(kāi)：在展開(kāi)槽中加入適量展開(kāi)劑，展開(kāi)劑的深度在立式展開(kāi)槽中約0.5 cm，在臥式展開(kāi)槽中約0.3 cm。蓋上蓋子放置片刻。將點(diǎn)好樣的薄層板放入， 使點(diǎn)樣一端向下，展開(kāi)劑不得浸及樣點(diǎn)。蓋上蓋子觀察展開(kāi)劑情況，當(dāng)展開(kāi)劑前 沿爬升到距離薄板上端約1 cm時(shí)取出，立即用鉛筆標(biāo)出前沿位置，依次展開(kāi)其余各板。(7) 測(cè)量和計(jì)算：用直尺測(cè)量展開(kāi)劑前沿及各樣點(diǎn)中心到起始線的距離，計(jì) 算各樣點(diǎn)的Rf值。(8) 比較分析：將(a), (b)，(c)三塊板并排平放在一起，比較分析由混合樣點(diǎn)所分得的樣點(diǎn)中哪一個(gè)是偶氮苯，哪一個(gè)是鄰-硝基苯胺，并從分子結(jié)構(gòu)解釋其Rf值