OCTET相互作用系統(tǒng)理論與實驗設(shè)計培訓(xùn)

1、Better Lives. Better Planet.SMThis presentation is the Confidential work product of Pall Corporation and no portion of this presentation may be copied, published, performed, or redistributed without the express written authority of a Pall corporate officer 2014 Pall CorporationOCTET相互作用系相互作用系統(tǒng)統(tǒng)理理論論與

2、與實驗實驗設(shè)計設(shè)計培培訓(xùn)訓(xùn)培培訓(xùn)訓(xùn)人人 :陳陳濤濤應(yīng)應(yīng)用用經(jīng)經(jīng)理理2Agenda生物膜干涉技術(shù)原理與動力學(xué)基礎(chǔ)OCTET相互作用儀的大體應(yīng)用生物分子的固化與傳感器的選擇結(jié)合解離的注意點和數(shù)據(jù)分析再生條件的摸索定量分析3Octet平臺組成4Fiber optic rodReference layerForteBio傳傳感感器的基本構(gòu)造器的基本構(gòu)造固化方式與固化（檢測）物質(zhì)的不同，創(chuàng)造出了不同傳感器。5 當(dāng)一束可當(dāng)一束可見見光從光光從光譜儀譜儀射出后，在射出后，在傳傳感器末端的光學(xué)膜感器末端的光學(xué)膜層層的兩個界面的兩個界面會形成兩束反射光會形成兩束反射光譜譜，并形成一束干涉光，并形成一束干涉光譜譜

3、。 任任何由于分子何由于分子結(jié)結(jié)合而形成的膜合而形成的膜層層厚度厚度變變化，能夠通化，能夠通過過干涉光干涉光譜譜的位移的位移值值而體而體現(xiàn)現(xiàn)。 生物膜干涉技生物膜干涉技術(shù)術(shù)（ （Bio-Layer Interferometry ， ，BLI） ）6Biolayer Interferometry (BLI)Application of white light interferometry in monitoring molecular interactionsWhite lightConstructive interferencePartially constructive interferen

4、ceDestructive interferenceInternal Reference (reflection surface 1)Interface with Liquid (reflection surface 2)Relative IntensityWavelength100%07Interferometric Pattern Changes withIncreased Molecular ThicknessRelative IntensityWavelength100%08干涉光譜位移-時間曲線圖可以提供動力學(xué)參數(shù)Distance between the two reflecting

5、 surfaces = Intensity =(, )Function of density and optical thicknessRelative IntensityWavelength (nm)100%0nm shiftTime9Octet儀儀器中內(nèi)部主要器中內(nèi)部主要結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)10BufferLigand-Biotin(ligand)Protein of Interest(analyte)Binding (nm)Time BaselineLoadingBaselineAssociationDissociation一次檢測8個通道所有數(shù)據(jù)是實時的反應(yīng)的時間，位置，轉(zhuǎn)速，溫度，步驟可以自行設(shè)

6、定Baseline, Association和Dissociation三步對于計算動力學(xué)參數(shù)KD值是必須得。Octet BiosensorsOctet平臺平臺動動力學(xué)力學(xué)檢測檢測自自動動化流程化流程11R=R0+Rte-kd*tR=R0+Req(1-e-kobs*t) A(ligand) + B(analyte) AB kakdKD = kdka 1:1 binding模型模型:ka = 結(jié)結(jié)合合常常數(shù)數(shù)，Konkd = 解解離離常數(shù)，常數(shù)，Koff動力學(xué)參數(shù)的計算Kobs=Ka*B+Kd，表觀結(jié)合常數(shù)Req為一定analyte濃度下的平衡信號，相當(dāng)于無限長結(jié)合時間的最終信號。Rt為解離起始的

7、信號。12簡明操作儀器傳感器樣品程序設(shè)定(acquisition software)測試數(shù)據(jù)分析（analysis software）Warm for 30minHydrate(prewet) for at least 10minPrepare sample plate and warm it to RT.13有獎問答下面哪些說法是對的？A 生物膜干涉技術(shù)的光源是可見光B 動力學(xué)檢測可以獲得Kon,Koff,KD;親和力檢測只能獲得KDC 生物膜干涉技術(shù)的信號只和傳感器表面的結(jié)合分子的厚度相關(guān)D 主要根據(jù)結(jié)合曲線的信號來進(jìn)行濃度定量E 如果沒有分析物濃度信息，無法獲得Kon,Koff,KDF

8、動力學(xué)常數(shù)和濃度無關(guān)14Agenda生物膜干涉技術(shù)原理與動力學(xué)基礎(chǔ)OCTET相互作用儀的大體應(yīng)用生物分子的固化與傳感器的選擇結(jié)合解離的注意點和數(shù)據(jù)分析再生條件的摸索定量分析15功能功能動力學(xué)（kinetic） 濃度測定（Quantitation）Yes or NoAffinity(KD)Kinetic(Koff,Kon,KD)16Octet平臺上應(yīng)用的生物分子范圍CellsBacteriaVirusIgMIgAIgG, IgD, IgEAntibody FragmentsProteinsPeptidesNucleotides (DNA)Small MoleculesAtoms200 nm100

9、0 nm0.1 nm11,000100,0001,000,00075 nm150MWSize7 nm1 nmBacteriaVirusAntibody - AntigenReceptor - LigandDNA - DNA DNA - ProteinAntibody Fragment - AntigenAntigen Fusion ProteinAntibody - PeptideMultiple Antibody PairingsAntibody - Small MoleculeProtein - Small Molecule17OctetOctet儀器系統(tǒng)對于科研用戶的應(yīng)用儀器系統(tǒng)對于科研

10、用戶的應(yīng)用 非標(biāo)記（直接的）、實時在線、快速地對樣品進(jìn)行測定 與其他分子相互作用檢測方法（雙向電泳，F(xiàn)P，Co-IP，Western Blot，HPLC，ELISA，NMR，ITC，晶體衍射等 ）互補，BLI技術(shù)更快更直接 可以fishing蛋白，洗脫后用電鏡觀察 分子結(jié)合模式研究，信號傳導(dǎo)通路，藥物靶點，蛋白晶體篩選， DNA aptamer 篩選，蛋白/多肽/分子抑制協(xié)同實驗，蛋白突變體，膜蛋白受體研究等涉及所有分子相互作用的應(yīng)用 基于相互作用的分子活性研究 表達(dá)產(chǎn)量的預(yù)估18Agenda生物膜干涉技術(shù)原理與動力學(xué)基礎(chǔ)OCTET相互作用儀的大體應(yīng)用生物分子的固化與傳感器的選擇結(jié)合解離的注意

11、點和數(shù)據(jù)分析再生條件的摸索定量分析19固化物質(zhì)的選擇 有tag（GST，F(xiàn)c,his,FLAG，biotin）的蛋白優(yōu)先作為固化物質(zhì)，但是分析物不得含有相同的tag。 如果需要獲取KD值，分析物需要清楚分子量和濃度，否則做為固化物質(zhì)。 含有多個結(jié)合位點的物質(zhì)優(yōu)先作為固化物質(zhì) 實驗的簡易性，比如A蛋白需要和很多蛋白相互作用，則將A蛋白進(jìn)行固化 不易獲取高濃度的物質(zhì)優(yōu)化作為固化物質(zhì)，比如RNA,DNA，多糖等。 容易和傳感器發(fā)生非特異性反應(yīng)的物質(zhì)作為固化物質(zhì)20用于動力學(xué)檢測的傳感器種類固化物質(zhì)種類固化物質(zhì)是否需要純化固化方式Streptavidin (SA)生物素標(biāo)記物質(zhì)是biotin-avid

12、inSuper Streptavidin (SSA) 生物素標(biāo)記物質(zhì)是biotin-avidinAmine Reactive (AR)含有氨基物質(zhì)是化合鍵Aminopropylsilane (APS) 疏水物質(zhì)是疏水作用，靜電作用Anti-hIgG Fc Capture Surface (AHC)人免疫球蛋白（含F(xiàn)c）否Ag-AbAnti-MIgG Fc Capture surface(AMC)鼠免疫球蛋白（含F(xiàn)c）否Ag-AbAnti-GSTGST tag否Ag-AbNTAhis Tag否NTA-HisAnti-Human Fab-CH1 (FAB)CH1否Ag-Abanti-Flagfla

13、g否Ag-Ab直接固化抓取固化每種傳感器都有其說明書！21Capture Based vs Direct Immobilization抓抓取固化取固化直直接固化接固化AR or Streptavidin 傳傳感器感器 優(yōu)優(yōu)點點: 非非常常穩(wěn)穩(wěn)定的固化定的固化 所所有蛋白都可以有蛋白都可以進(jìn)進(jìn)行固化行固化 缺點缺點: 需需要要純純化的蛋白化的蛋白 無無序的固化序的固化 產(chǎn)產(chǎn)生共價生共價鍵鍵，可能，可能對對蛋白活性有影響蛋白活性有影響 再再生生時時需要考察固化蛋白的耐受性需要考察固化蛋白的耐受性AMC， ，AHC傳傳感器感器結(jié)結(jié)合抗體合抗體Fc 優(yōu)優(yōu)點點: 不不會會產(chǎn)產(chǎn)生共價生共價鍵鍵，易于保持蛋

14、白活性，易于保持蛋白活性 可可以固化在粗以固化在粗樣樣品的蛋白品的蛋白 固固化的有序性化的有序性 將固化蛋白與分析蛋白一并再生，回到將固化蛋白與分析蛋白一并再生，回到傳傳感器感器原始狀原始狀態(tài)態(tài) 缺點缺點: 固化的密度少于前者固化的密度少于前者 固固化化穩(wěn)穩(wěn)定性弱于前者定性弱于前者ONHONH22Biosensor selectionCapture chemicalcouplingabsorbance AHCAMCAnti-GSTAnti-FLAGNTAproAproGAnti-CH1Streptavidin AR2G APSSSA biosensor is best for small mo

15、lecule measurement.23固化的注意要點 蛋白濃度10-30ug/ml 蛋白固化穩(wěn)定：在固化后的baseline必須穩(wěn)定（0.05nm/min） 蛋白固化信號1nm 固化到最大信號的80%（結(jié)合曲線開始彎曲時） 如果測試小分子（分析物），最好使用SSA傳感器，蛋白固化信號越大越好 固化緩沖液氨基偶聯(lián)：pH比PI小0.5-1pH，且不得有其他含有氨基的物質(zhì)APS疏水偶聯(lián)：不得含有去污劑固化固化后的basline，需要穩(wěn)定！24特殊物質(zhì)的固化 DNA/RNA的固化：合成時帶上生物素，然后用SA傳感器固化。 多糖：可以利用氨基或者羧基，偶聯(lián)在AR2G或者APS傳感器上，也可以通過生物

16、素化進(jìn)行固化 多肽：合成時帶上生物素，然后用SA傳感器固化 半抗原：APS傳感器疏水固化 酸性蛋白：APS傳感器疏水固化 化合物：固化非常困難，一般合成時帶上生物素 納米材料：APS傳感器疏水固化 病毒：APS傳感器疏水固化，或者生物素化用SA傳感器固化 脂質(zhì)體： APS傳感器疏水固化 其他多聚物：利用氨基，羧基或者醛基固化在AR2G或者APS傳感器上25有獎問答固化的好壞需要考察哪些因素A 固化越牢越好B 固化物質(zhì)在固相上的方向一致性要好C 易于再生D 固化密度越高越好E 使用氨基固化的時候，固化物質(zhì)不得含有其他含有氨基的物質(zhì)F 使用生物素固化的時候，生物素固化試劑與蛋白的摩爾比需要大于32

17、6Agenda生物膜干涉技術(shù)原理與動力學(xué)基礎(chǔ)OCTET相互作用儀的大體應(yīng)用生物分子的固化與傳感器的選擇結(jié)合解離的注意點和數(shù)據(jù)分析再生條件的摸索定量分析27結(jié)合解離注意要點 Baseline,association,dissociation的緩沖液（基質(zhì)）必須一致（非常重要） 必要的時候在association的緩沖液中添加BSA和去污劑，鹽等以去除非NSB。（0.02%tween20,0.1% BSA,PBS pH7.4），但是固化物質(zhì)是脂質(zhì)體時，不得加入去污劑。 一般需要對非特異性進(jìn)行考察，即觀察沒有l(wèi)igand的傳感器直接與analyte直接作用的信號是否可以忽略 結(jié)合步驟一定要加入ref

18、erence well（0濃度，即只有緩沖液）28預(yù)實驗 確立每步的大概時間。 觀察固化是否成功，是否牢固。 觀察分析物是否有結(jié)合。 觀察是否有非特異性結(jié)合。ligandanalyte寬泛的濃度檢查非特異性結(jié)合有信號，并且有濃度依賴性大大高于分析物與傳感器本身的信號則說明有特異性結(jié)合！29預(yù)實驗（單濃度實驗）Binding (nm)Time BaselineLoadingBaselineAssociationDissociation5-10min,可以手動調(diào)節(jié)有曲線出現(xiàn)一定要達(dá)到平衡，斜率0.02nm/min，5-10min最高濃度需要有曲線狀，5-10min有明顯的解離.5-30min.1-

19、2分鐘，判斷傳感器結(jié)合曲線是否有異常30如果發(fā)現(xiàn)非異性吸附？主要是由于分析物和傳感器上基質(zhì)結(jié)合導(dǎo)致。 顛倒分析物和固化物 更換傳感器 更換緩沖液，加入更高濃度的去污劑或者鹽 檢查一下分析物中是否含有其他物質(zhì)Capture 傳感器SA傳感器AR2G傳感器APS傳感器31分析物濃度選擇如果要獲得準(zhǔn)確的KD值，需要檢測至少4個適合的濃度。最佳的濃度范圍是10-20*KD 到 0.1*KD值,有良好的分散性。如果不知道濃度范圍，可以在預(yù)實驗中嘗試寬泛的濃度范圍，比如10倍梯度稀釋，比如10nM,100nM,1000nM最高濃度結(jié)合曲線需要出現(xiàn)適中太高太低32數(shù)據(jù)處理-圖形處理原始數(shù)據(jù)處理后數(shù)據(jù)1.as

20、sociation/dissoication步驟的提取2.起始信號的歸零3.reference well的扣除4.reference sensor的扣除5.“gap”的調(diào)整Reference well:association 步驟為零濃度（buffer），但是與其他傳感器一樣loadingReference sensor:well:association 步驟為測試濃度（buffer），無 loading33數(shù)據(jù)處理-擬合分析Local fitting&global fittingLocal fittingglobal fittingLocal fitting:computes kin

21、etic constants for each curve Global fitting:an analysis includes all of the binding curve data in the group and generates kinetic constants for the entire group 擬合之前先去掉一些沒有信號的曲線！34如何判定數(shù)據(jù)是否可信目測擬合曲線與實測曲線較為一致（1:1擬合），擬合曲線貼近實測曲線R2 和2 值的考察 R2 表示擬合曲線與實測曲線的相似度，越接近與1越好，一般要求大于0.95. 2表示了擬合曲線與實測曲線的誤差，越小越好。計算的誤

22、差值，應(yīng)該比計算值小一個數(shù)量級（比如Kon值為105，那么Kon error應(yīng)該小于104）。35如果發(fā)現(xiàn)擬合的不好？擬合曲線與實測曲線差別太大，則說明獲得KD值不準(zhǔn)確計算方法：去掉一些高濃度點進(jìn)行擬合。實驗改進(jìn)：將含有多個結(jié)合位點的物質(zhì)進(jìn)行固化優(yōu)化緩沖液，加入更高濃度的去污劑和鹽，DTT有可能本身就不是1:1結(jié)合！36小分子（4nm）,一般固化使用SSA傳感器 小分子的親和力比較低（uM級別），分析濃度比較高，起始濃度100-200uM 必須做reference sensor,并進(jìn)行雙扣除Sensor and sample plate layoutSetting in data proces

23、singSetting in processing data analysis37Agenda生物膜干涉技術(shù)原理與動力學(xué)基礎(chǔ)OCTET相互作用儀的大體應(yīng)用生物分子的固化與傳感器的選擇結(jié)合解離的注意點和數(shù)據(jù)分析再生條件的摸索定量分析38快解離 如果解離的比較快，而且可以回到與結(jié)合前baseline相同的信號水平，說明傳感器的分析物充分脫落，不需要加入額外的再生試劑進(jìn)行再生解離后回到起點結(jié)合起點傳感器可以進(jìn)行下一個分析物的測試。39傳感器的再生再生再生回回到原始到原始傳傳感器感器固固化抗體化抗體結(jié)結(jié)合抗原合抗原原原始始傳傳感器感器再生再生固固化化分析物分析物結(jié)結(jié)合合原原始始傳傳感器感器SA傳感器的

24、再生Capture method:Direct method:40再生效果驗證KD (M)Kon(1/Ms)Kdis(1/s)3.66E-093.97E+051.45E-033.45E-094.06E+051.40E-033.75E-093.89E+051.46E-033.94E-093.84E+051.51E-033.99E-093.77E+051.50E-03Full assayCycle 1Cycle 2Cycle 3Cycle 441Ligand or analyte?One-shot assayFull kinetic assayregenerationMultiple cycles

25、Capture or chemical couplingBiosensor selectionThe number of samplesWhether the conc. is known?Crude sample or not?Is loading step successful and stable?Is there binding?Concentration range for full kinetic assaydissociation is fast or slowIs there any NSB?Whether fitting is good or not?By witnessX2

26、,R2Koff errorSignal decayKD valueCommercial capture biosensors can ignore this step42有獎問答下面哪些說法是正確的A 分析物緩沖液一般需要加入去污劑B 分析物濃度范圍需要適當(dāng)才可以獲得準(zhǔn)確的KD值C 分析物每個濃度的結(jié)合曲線需要達(dá)到平衡D 在擬合KD值前，需要對沒有信號的結(jié)合曲線進(jìn)行剔除E 基于氨基偶聯(lián)方式傳感器再生完畢后的需要再做固化F 非特異性是指分析物與傳感器本身的結(jié)合43Agenda生物膜干涉技術(shù)原理與動力學(xué)基礎(chǔ)OCTET相互作用儀的大體應(yīng)用生物分子的固化與傳感器的選擇結(jié)合解離的注意點和數(shù)據(jù)分析預(yù)實驗的

27、重要性再生條件的摸索定量分析44定量傳感器的選擇測定物質(zhì)一般方法測定范圍高靈敏度方法測定范圍是否可以再生Anti-Human IgG Fc（AHQ）人免疫球蛋白所有亞型1-100ug/mlN/A否Anti-Murine IgG (Fab)2(AMQ)鼠疫球蛋白所有亞型1-100ug/mlN/A否Protein A不同種屬不同亞型免疫球蛋白1-700ug/ml0.05-300ug/ml是Protein G不同種屬不同亞型免疫球蛋白1-700ug/ml0.05-300ug/ml是Protein L不同種屬不同亞型免疫球蛋白1-700ug/ml0.05-300ug/ml是NTAhistag蛋白0.5-1000ug/mlN/A是Anti-GSTGST蛋白0.25-2000ug/ml0.1-200ug/ml是Anti-Human Fab-CH1 (FAB)FAB0.25-2000ug/mlN/A是anti-flagflag0.25-2000ug/mlN/A