腸道菌群功能及檢測技術(shù)研究進(jìn)程

1、.腸道菌群功能及檢測技術(shù)研究進(jìn)程 摘要：大量的微生物存有于動物的胃腸內(nèi)，在經(jīng)過長期的進(jìn)化與選擇之后，它們形成了一個動態(tài)的微生物系統(tǒng)。腸道菌群與機體的相互作用對動物本身來說十分重要，近年來更是已經(jīng)成為研究的熱點問題。腸道菌群的功能主要體現(xiàn)在它對機體的生物屏障作用、營養(yǎng)作用、免疫作用等方面。腸道菌群的檢測方法是研究腸道菌群的重點和難點問題，當(dāng)前主要技術(shù)有分離培養(yǎng)、質(zhì)譜技術(shù)、宏基因組測序等。文章結(jié)合大量文獻(xiàn)資料，總結(jié)了當(dāng)前腸道菌群功能的相關(guān)研究成果及研究方法。 關(guān)鍵詞：腸道菌群;菌群功能;檢測技術(shù);分離培養(yǎng);質(zhì)譜技術(shù);宏基因組測序 動物腸道內(nèi)存有著大量的微生物，這些微生物在經(jīng)過長期的進(jìn)化與選擇之后逐

2、漸形成了一個動態(tài)的微生物系統(tǒng)。文章從腸道菌群的生物屏障作用、營養(yǎng)作用、免疫作用等方面介紹了腸道菌群功能，總結(jié)了當(dāng)前研究中常用的腸道菌群檢測技術(shù)分離培養(yǎng)、質(zhì)譜技術(shù)、宏基因組測序等，并對幾種檢測技術(shù)實行對比和分析，對未來可能的研究發(fā)展方向?qū)嵭蓄A(yù)測。 1腸道菌群介紹 腸道菌群，即腸道內(nèi)的正常微生物。人體的腸道菌群是一個由近1014個微生物復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)組成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)1?？茖W(xué)家對腸道微生物的研究能夠追溯到1886年，當(dāng)時已經(jīng)有人發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌并指出其對消化的作用。后來又有學(xué)者提出了“梅氏假說”，即酸奶中所富含的乳酸菌能夠?qū)δc道菌群產(chǎn)生作用，減少腐敗菌在腸道中的生長。之后關(guān)于腸道菌群與機體關(guān)系的相關(guān)探

3、索逐步加深，科學(xué)家們逐漸發(fā)現(xiàn)腸道菌群對于宿主的重大影響，并稱其為“被忽略的人體器官”。動物腸道內(nèi)存有著30屬500多種細(xì)菌，主要為厭氧菌、兼性厭氧菌和需氧菌，數(shù)量最多的為類桿菌、優(yōu)(真)桿菌、消化球菌及雙歧桿菌等專性厭氧菌，占99%以上，其中僅類桿菌及雙歧桿菌就占細(xì)菌總數(shù)的90%以上。其余還有數(shù)量較少的大腸桿菌、腸球菌、乳桿菌及韋榮小球菌，數(shù)量最少的葡萄球菌、魏氏梭菌、變形桿菌等。已有相關(guān)研究證實，腸道菌群既有“共性”，也有“個性”2，這主要體現(xiàn)在不同宿主體內(nèi)的微生物菌群組成情況上。不同個體相比，腸道菌群的主要組成類群非常相近，并都可分為擬桿菌型、普氏菌型及瘤胃球菌型，但微生物菌群的相對含量和

4、菌株種類在不同個體間的差異卻十分顯著，其影響因素主要為生存環(huán)境3、年齡4、生理狀況56等，除此之外飲食也是造成以上區(qū)別的一個重要原因，并且相對容易改變和控制。在各種因素影響著腸道菌群組成結(jié)構(gòu)的同時，腸道菌群也在對宿主的各個方面產(chǎn)生不同水準(zhǔn)的作用與影響。當(dāng)前，腸道菌群已經(jīng)成為科學(xué)家們研究的重點與熱點問題，并且已經(jīng)有很多相關(guān)研究取得了進(jìn)展。 2腸道菌群的功能 2.1生物屏障作用 腸道菌群的生物屏障作用即指頡頏外來致病菌的作用。早在1887年就已經(jīng)有科學(xué)家觀察到微生物之間具有頡頏作用，并利用這種頡頏作用成功預(yù)防和治療了家兔的炭疽病。1973年有人提出腸道菌群的減少可導(dǎo)致仔雞容易被致病性沙門氏桿菌感染

5、。隨著科學(xué)家對腸道菌群的深入研究，證實了腸道菌群具有保護(hù)機體、抵御外來致病菌的作用。腸道菌群的這種功能又被人為地劃分成生物屏障和化學(xué)屏障。生物屏障即指腸道正常菌群定殖于腸道中，以此對外來致病菌的定殖占位造成影響，使其無法在宿主體內(nèi)定居生長和繁殖。而化學(xué)屏障是指腸道菌群代謝產(chǎn)物(如乙酸、過氧化氫、細(xì)菌素等)對外來致病菌能夠產(chǎn)生致命作用或者能夠減少其在腸道內(nèi)的定殖。 2.2營養(yǎng)作用 腸道菌群的營養(yǎng)作用體現(xiàn)在多個方面。首先，其可消耗致病菌生長所需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)，從而抑制外來致病菌的生長繁殖，并利用宿主體內(nèi)不存有的酶補充宿主在消化酶上的缺陷7。這種行為增強了宿主機體對外來致病菌的抵御作用，并使得宿主

6、對于各種營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用水平更強。其次，腸道的正常微生物(如雙歧桿菌、乳酸桿菌等)能合成多種人體生長發(fā)育所必需的維生素，如B族維生素(維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12)、維生素K、煙酸、泛酸等，還能利用蛋白質(zhì)殘渣合成必需氨基酸，如天冬門氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸和蘇氨酸等，并參與糖類和蛋白質(zhì)的代謝，同時還能促動鐵、鎂、鋅等礦物元素的吸收，這些營養(yǎng)物質(zhì)對于宿主的機體來說是必需的，它們的缺乏會導(dǎo)致機體功能失常。細(xì)菌還能夠通過氧化、還原、水解等反應(yīng)使氨基酸脫氨產(chǎn)生氨、二氧化碳，以及乙酸、丙酸、丁酸、丙酮酸、琥珀酸等有機酸。 2.3免疫作用 腸道是動物與外界環(huán)境接觸最多的器官之一，也是機

7、體最大的免疫器官。腸黏膜中分布著超過全身半數(shù)的淋巴組織。腸道中定殖了大量的微生物。腸黏膜屏障包括機械屏障、免疫屏障與生物屏障。腸道正常菌群對腸黏膜免疫屏障功能的調(diào)控扮演著雙重角色。一方面，腸道菌群作為抗原對腸黏膜存有潛在的危害;另一方面，腸內(nèi)寄生菌可為腸黏膜細(xì)胞提供某些營養(yǎng)成分，維持腸道菌群平衡，激活腸道免疫系統(tǒng)8。除此之外，動物腸道菌群作為抗原物質(zhì)還能促動宿主的免疫器官發(fā)育，增加T、B淋巴細(xì)胞的數(shù)量，產(chǎn)生非特異性免疫作用;通過對宿主免疫系統(tǒng)的持續(xù)刺激，使其產(chǎn)生免疫反應(yīng)來增加機體的免疫水平9。例如雙歧桿菌，它是動物腸道內(nèi)數(shù)量最多的有益菌，含有腸道寄生菌共同抗原，能夠影響?zhàn)つっ庖叩闹饕в靡蜃臃?/p>

8、泌性球蛋白，在對機體的特異性與非特異性免疫上影響巨大10。已經(jīng)有相關(guān)研究證明減少接觸微生物的機會，會導(dǎo)致慢性炎性疾病的增多，并指出這可能是導(dǎo)致機體免疫調(diào)節(jié)缺陷的一個重要原因。菌群失調(diào)時，會導(dǎo)致機體的免疫紊亂和屏障功能減弱，這也是證明腸道菌群與機體免疫之間關(guān)系緊密的一個方面11。在實踐和生產(chǎn)中，腸道菌群已經(jīng)有和疫苗混合使用來提升抗體水平和作為具有免疫活性的佐劑的應(yīng)用。如在新城疫疫苗接種前后給雞喂食益生素，能夠提升雞血清中抗新城疫病毒血凝抑制抗體的含量并延長抗體的高峰期。光合細(xì)菌與H52混合使用，能夠提升雞體內(nèi)的球蛋白和雞傳染性支氣管炎病毒抗體水平。相關(guān)研究指出雙歧桿菌具有免疫佐劑活性。當(dāng)前，乳酸

9、桿菌、鏈球菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌已經(jīng)被制成活菌制劑，已有多種制劑被廣泛應(yīng)用于微生物飼料添加劑和治療劑中，用來防治動物腸道疾病。 2.4其他作用 腸道菌群對機體除了具有屏障作用、營養(yǎng)作用和免疫作用之外，還能對機體的造血功能產(chǎn)生直接或者間接的影響。有學(xué)者使小鼠腸道微生物消失導(dǎo)致其骨髓和外周血中粒細(xì)胞生成減少，從而證明了這個觀點。腸道正常菌群能夠產(chǎn)生超氧化物歧化酶，使宿主體內(nèi)的自由基歧化反應(yīng)加速，有一定的抗衰老作用。腸道菌群還能產(chǎn)生多種酶，對腫瘤的產(chǎn)生有抑制作用12。腸道菌群對情緒也有影響，還可通過腸腦軸影響宿主的行為13。 3腸道菌群檢測技術(shù) 3.1分離培養(yǎng) 分離培養(yǎng)是最早在試驗中使用的一種方法，

10、當(dāng)前已經(jīng)相對比較成熟，應(yīng)用于很多研究領(lǐng)域。該方法主要是利用選擇性培養(yǎng)基把各種細(xì)菌分離開，并根據(jù)染色、生化反應(yīng)、血清學(xué)試驗等方法對分離出的細(xì)菌實行鑒別，這種方法還能夠用來測定活菌的數(shù)量。例如，徐鳳等14對2月齡斷奶羔羊、8月齡和2歲山羊瘤胃和回腸刮取物中的乳酸菌實行分離鑒定;白娜15利用純培養(yǎng)技術(shù)與16SrDNA技術(shù)結(jié)合對采集自內(nèi)蒙古錫林郭勒牧區(qū)的36份健康家畜糞便樣品中的微生物實行了分離鑒定;聶遠(yuǎn)洋等16利用不同培養(yǎng)基研究了不同年齡麥洼牦牛腸道菌群與其群落結(jié)構(gòu)的變化。這種利用不同培養(yǎng)基分離培養(yǎng)細(xì)菌的方法雖然已經(jīng)比較成熟，能顯示出不同細(xì)菌對宿主腸道系統(tǒng)中各種營養(yǎng)物質(zhì)的利用情況，但也有一定的缺點，

11、如該方法不但耗時長而且實行研究的微生物種類具有很大的局限性，自然界中有90%99%的微生物無法通過度離培養(yǎng)的方法實行分析，顯然可分析的這個小部分微生物對研究腸道菌群這個整體和腸道微生物系統(tǒng)與宿主的關(guān)系來說是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。 3.2質(zhì)譜技術(shù) 質(zhì)譜技術(shù)是利用腸道菌群中不同菌種的組成蛋白種類不同這個特性來對蛋白質(zhì)的種類實行鑒定，從而得出其組成細(xì)菌的功能和特性的。基質(zhì)輔助激光解析電離時間飛行質(zhì)譜(MALDITOF)的出現(xiàn)，成為從蛋白質(zhì)水平對腸道菌群實行研究的有效工具。質(zhì)譜技術(shù)的原理是利用激光輻射微生物樣品與等量基質(zhì)溶液揮發(fā)后形成的晶體，基質(zhì)吸收能量解析而樣品分子電離，對形成的離子峰與離子質(zhì)荷比的指紋圖譜實

12、行分析比較，然后再實行比對區(qū)分出腸道菌群的種類。該方法在研究不同腸道菌群的種類時快速而準(zhǔn)確，能夠區(qū)分不同菌群與不同狀態(tài)下的蛋白質(zhì)圖譜。但這種方法對樣品的采集和處理要求較高，且質(zhì)譜技術(shù)的分析方法當(dāng)前并不成熟，還需進(jìn)一步優(yōu)化。 3.3宏基因組測序 1998年宏基因組的概念被提出，當(dāng)時人們對它的定義是環(huán)境中所有微生物的遺傳信息，當(dāng)前主要是指環(huán)境中細(xì)菌和真菌基因組的和17。宏基因組測序技術(shù)又分為16SrDNA技術(shù)和全基因組測序技術(shù)。16SrDNA技術(shù)是當(dāng)前腸道菌群系統(tǒng)分類研究中最常用的一種方法，相較于5S和23SrDNA，16SrDNA大小適中，既容易獲取又能明顯比較出不同菌群的區(qū)別。16SrDNA技

13、術(shù)的原理是通過直接獲取腸道菌群的DNA信息，與基因庫中的數(shù)據(jù)實行比較，經(jīng)過度析后能夠?qū)ζ鋵嵭蟹诸?。?dāng)前所有已知細(xì)菌的16SrDNA堿基序列都已經(jīng)能夠在基因庫中找到，這也為16SrDNA測定法在試驗研究中的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。王純等18用該方法對草魚與團(tuán)頭魴的腸道菌群結(jié)構(gòu)實行了比較分析，提出了草魚和團(tuán)頭魴消化道內(nèi)微生物群落營養(yǎng)物質(zhì)的代謝方式類似的觀點。這種技術(shù)解決了傳統(tǒng)的微生物鑒定方法難以鑒定眾多的生長習(xí)性復(fù)雜的微生物的問題，當(dāng)前已經(jīng)在很多研究中被使用。但是16SrDNA技術(shù)的費用較高、耗時長且不能實行定量分析，而且該技術(shù)依賴于PC技術(shù)，在PC中存有的樣品容易污染的問題也會影響16SrDNA的分

14、析結(jié)果，所以仍需對腸道菌群豐度和數(shù)量準(zhǔn)確變化的測定方法實行優(yōu)化。全基因組測序即對樣品核酸實行提取，測定其序列并對結(jié)果實行分析。測定過程中省略了擴(kuò)增程序，直接獲取核酸信息，與數(shù)據(jù)庫中的信息實行比對，經(jīng)過度析后得出致病菌的種類，用于檢測樣品中毒性菌株的耐藥性，實行相關(guān)毒理學(xué)研究。高菽蔓等19利用全基因組測序研究了犬副流感病毒CC14株全基因組序列特征。這種方法解決了傳統(tǒng)研究方法需要菌群分離的過程，更快速、便捷，也解決了有些菌種難以用傳統(tǒng)方法培養(yǎng)的問題。與16SrDNA技術(shù)相比不需要實行PC擴(kuò)增，避免了擴(kuò)增過程中樣品被污染的可能，結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。當(dāng)前，這種方法被廣泛應(yīng)用于腸道菌群和環(huán)境菌群的研究之中

15、，對于菌群的毒力作用與生活史的研究具有重要意義。 3.4其他技術(shù) 分子標(biāo)記法的靈敏性和特異性較高，常見的具體方法有熒光原位雜交技術(shù)、基因芯片技術(shù)等。熒光原位雜交技術(shù)能夠研究腸道細(xì)菌和其余組織之間的關(guān)系，并且能夠保持腸道菌群與腸道組織的原本情況。基因芯片技術(shù)即DNA微陣列，具有在處理多個基因時高效快速的特點。DNA指紋圖譜分析法依賴于分析對象的分子大小與核酸序列的不同，其中的變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)當(dāng)前已經(jīng)能夠分辨出只有一個堿基差異的基因序列，補充了傳統(tǒng)研究方法精度不高的缺點，被廣泛應(yīng)用于微生物多樣性和種群差異的研究中。這些對腸道菌群的研究方法在使用時并不是唯一的，在實際的研究中，有時可能會兩種甚至多種方法并用實行鑒定研究。 4小結(jié) 人們已經(jīng)意識到了腸道微生物對于宿主機體的重要性，不論是腸道菌群帶給機體抵御外來致病因素的屏障作用，對于機體的營養(yǎng)作用、免疫作用，還是其他作用，對于宿主來說都是不能忽視的。失去了腸道正常菌群的作用，機體會受到嚴(yán)重的損傷與一些功能的喪失?，F(xiàn)在已經(jīng)有很多的科學(xué)家投入到了腸道菌群的研究中，為揭示腸道菌群與宿主之間的關(guān)系和影響作出了巨大的貢獻(xiàn)。但是這些研究成果對于腸道菌群與機體相互作用的整體來說仍然僅僅其中的一小部分，仍然還有很多的內(nèi)容等待學(xué)者們?nèi)パ芯?。例?/p>