超微粉體夏天無指紋圖譜探究

1、超微粉體夏天無指紋圖譜探究【摘要】目的建立夏天無超微粉體的hplc指紋圖譜, 為夏天無的質(zhì)量控制提供可靠方法。方法采用梯度洗脫進(jìn)行 色譜分離，固定相為diamonsil bds c18 ( 5 u in , 250mmx4. 6mm),流動(dòng)相為流動(dòng)相：a乙膳-b水(每loooml 水中加入冰乙酸30ml,三乙胺8ml),柱溫25°c,流速： 0. 8ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280nmo結(jié)果初步建立了夏天無超微粉 體的hplc指紋圖譜，標(biāo)定了 11個(gè)共有峰。結(jié)論建立的指紋 圖譜可以較好地反映夏天無超微粉體的內(nèi)在質(zhì)量。【關(guān)鍵詞】夏天無；超微粉體；hplc指紋圖譜夏天無為罌粟科植物伏生紫堇c

2、orydalis decumbens (thunb) pers.的干燥塊莖。主產(chǎn)于江西，在湖南、浙江、 江蘇等地。為民間常用藥材，具有活血、祛瘀、通絡(luò)、行氣 等功效，用于中風(fēng)偏癱、半身不遂等的治療。夏天無主要有 效成分為生物堿類，2010年版中國(guó)藥典將原阿片堿(pro), 鹽酸巴馬汀(pal)作為其定性和定量指標(biāo)。但這些成分存 在于罌粟科的多種植物中，并非夏天無特有成分，而且僅采 用一種或兩種成分對(duì)藥材進(jìn)行定性與定量，不能全面的反映 其內(nèi)在質(zhì)量。本文采用hplc法，對(duì)夏天無藥材進(jìn)行了 hplc 指紋圖譜研究，建立了一種能較全面地反映藥材質(zhì)量，并進(jìn) 行質(zhì)量控制的方法。1儀器與試藥agilent

3、1200 hplc （四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，紫外檢測(cè) 器）；agilent technologies 1200 compact lc 化學(xué)工作站; bfm-t6bi型貝利微粉機(jī)（濟(jì)南倍力粉體技術(shù)工程有限公司）。甲醇、乙睛（色譜純，tedia公司生產(chǎn)），冰乙酸（色譜 純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所），其它均為分析純，水為超 純水。原阿片堿（批號(hào)：110853-200402）延胡索乙素（批 號(hào)：110726-201011）鹽酸巴馬?。ㄅ?hào)：110732-200907） 均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。夏天無藥材共10批（分別購(gòu)買與湖南、江西等地，經(jīng) 湖南省中藥研究所鑒定均為罌粟科植物伏生紫堇夏天無 co

4、ydalis decumbens （thunb. ） pers.的干燥塊莖。樣品來 源見表1 o2. 2混合對(duì)照品配制取原阿片堿對(duì)照品10mg,精密稱定, 置50ml量瓶中，加1%鹽酸溶液5ml使溶解，再加甲醇至刻 度，搖勻。取鹽酸巴馬汀對(duì)照品10mg,精密稱定，置100ml 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。取延胡索乙素對(duì) 照品10嗎，精密稱定，置50ml量瓶中，加1%鹽酸溶液5ml 使溶解，再加甲醇至刻度，搖勻。精密量取上述三種溶液各 5ml,置同一 25ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得（每 iml含原阿片堿40吒、延胡索乙素40吒、鹽酸巴馬汀20 u g)o2.3超微粉體樣品的制

5、備3-4稱取夏天無粗粉200g于貝利粉碎機(jī)中，在最佳工藝條件下，進(jìn)行超微粉碎18分鐘, 即得夏天無超微粉體。粒徑分布為0.567-153. 943 um, d505 <9. 684 um, <75um的顆粒累積在98%以上。2. 4供試品溶液的制備取不同產(chǎn)地及市售10批夏天無超 微粉l0g,精密稱定，置looml三角錐形瓶中，加入甲醇 50ml,精密稱定重量，加熱回流1小時(shí)，放冷后補(bǔ)足減失的 重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過微孔濾膜（0.45um）濾過, 取續(xù)濾液，即得。3指紋圖譜方法學(xué)考察精密度試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液（no. 2,江西2）10nl,按以上色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記

6、錄色譜圖，計(jì)算 其各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的rsd均小于 1.6%,表明儀器精密度好。重復(fù)性試驗(yàn)：取夏天無超微粉（n0. 2,江西2） 6份， 分別按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按擬定方法進(jìn) 樣，記錄色譜圖，計(jì)算其各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰 面積的rsd均小于1.6%,表明該實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性較好。穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試液（n0. 2,江西2）10 ul,分別在0, 6, 12, 24, 48h進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算其各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的rsd均小于1.7%,表明 供試品溶液在48小時(shí)內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。3. 1混合對(duì)照與樣品hplc圖譜測(cè)定分別精密吸取混合對(duì) 照

7、與供試品溶液10ul,注入高效液相色譜儀，測(cè)定，記錄 75分鐘的色譜圖?；旌蠈?duì)照色譜見圖1,供試品色譜見圖2。3. 2指紋圖譜的建立53. 2. 1共有指紋峰的標(biāo)定6采用相對(duì)保留時(shí)間標(biāo)定共 有指紋峰，以圖譜中原阿片堿色譜峰為參照物s峰，將各色 譜峰保留時(shí)間與同一圖譜中參照物的保留時(shí)間比較，其比值 為各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間，計(jì)算10批夏天無供試品指紋 圖譜中各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間。其中11個(gè)色譜峰為各樣 品所共有，故標(biāo)定它們?yōu)楣灿兄讣y峰。3.2.2相似度評(píng)價(jià)采用中國(guó)藥典委員會(huì)出版的中藥色 譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（2.0版）進(jìn)行相似度計(jì)算。設(shè)置第一批樣品圖譜為參照物圖譜，對(duì)照?qǐng)D譜生成方法 采用中

8、位數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.50,多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配， 生成對(duì)照指紋圖譜，10批夏天無超微粉體的共有模式指紋圖 譜見圖3。相似度計(jì)算結(jié)果表明，10批供試品的相似度均在 0. 90以上，見表3。3. 2.3聚類分析應(yīng)用軟件spss 16.0系統(tǒng)聚類法，對(duì)10 批夏天無超微粉體的hplc圖譜中各特征峰的相對(duì)峰面積進(jìn) 行分析，以歐氏平方距離為測(cè)度的聚類圖見圖4。從樹狀圖 中可以看出，10個(gè)不同產(chǎn)地的夏天無樣品分為3類，10分 為 i 類；6, 9 分為 ii 類；1, 2, 3, 4, 5, 7, 8 分為iii類。3. 3分析與討論3. 3. 1提取方法與溶劑的選擇3. 3. 1. 1生物堿成分提取對(duì)

9、不同濃度的提取溶劑（甲醇、 50%甲醇、含1%濃氨試液甲醇、含1%濃氨試液50%甲醇溶劑） 提取方法（超聲、回流）進(jìn)行了考察。超聲提取出生物堿成 分略低于回流提取，其中甲醇回流提取峰分離較好，達(dá)到基 線分離，效果最好。因此，選擇甲醇回流提取，并且處理方 法操作簡(jiǎn)便，快速可行。3. 3. 1.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇經(jīng)過查閱文獻(xiàn)，采用紫外吸收 波長(zhǎng)掃描，在200-400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，色譜圖 在280nm處特征性強(qiáng)，具有很好的代表性，故選用280nm作 為夏天無生物堿hplc指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。3. 3. 1. 3聚類分析結(jié)果應(yīng)用軟件spss16. 0系統(tǒng)聚類法， 對(duì)10批夏天無超微粉體的hplc圖譜中各特征峰的相對(duì)峰面 積進(jìn)行分析，三類成分相對(duì)峰面積系統(tǒng)聚類分析結(jié)果比較可 知10號(hào)（安徽亳州）單獨(dú)歸為一類，與含量結(jié)果相吻合， 其質(zhì)量較差；6號(hào)，9號(hào)樣品在三類成分的系統(tǒng)聚類分析中 歸屬有差別，其余樣品歸屬均相同。參考文獻(xiàn)1 徐發(fā)紅，羅躍華，陳偉康，等.hplc法同時(shí)測(cè)定夏天 無注射液中3個(gè)有效成分的含量.2戴靜波，張佳佳，劉梅夏天無髙效液色譜指紋圖譜 研究j時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2008, 19 (6)： 1437-1438.3蔡萍，匡建軍，蔡光先，等白術(shù)微粉細(xì)胞破壁率的 測(cè)定j湖南中醫(yī)雜志，2010, 26 (5