基礎生物學實驗(二)_基礎生物學實驗(安徽大學生物研究生復試,生命科學學院)

1、基礎生物學實驗基礎生物學實驗(二二)生態(tài)與環(huán)境技術生態(tài)與環(huán)境技術 （ 2005）實驗一 實驗二 實驗三 實驗四 實驗五 實驗六 實驗七 實驗八 實驗九 實驗十 實驗十一 實驗十二 實驗十三 實驗十四 微生物實驗部分微生物實驗部分 一、實驗目的：一、實驗目的： 1、學習微生物涂片、染色的操作技術、掌握細菌單染色和革蘭氏染色的方法； 2、初步掌握無菌操作技術； 3、學習并掌握油鏡的原理和使用方法。 微生物(Microorganism)是所有形體微小，單細胞或雖為細胞，但個體結(jié)構較為簡單，甚至沒有細胞結(jié)構的，一般無法用肉眼直接觀察，須借助于光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看清它們的外形的低等生物的統(tǒng)稱。它

2、們廣泛分布于土壤、空氣、水域或動植物體以及人體以外。在自然界中，微生物種類繁多，目前已知的大約10萬種以上。如沒有細胞結(jié)構的病毒(包括噬菌體)，單細胞的細菌、放線菌、立克次氏體、支原體、衣原體；屬于真菌的酵母菌、霉菌或單細胞的藻類以及原生動物等均屬微生物。研究這些微生物的生命活動及其與周圍環(huán)境相互關系的科學稱為微生物學(microbiology)。 1、種類繁多，分布極廣。2、形體微小，表面積與體積的比值大。 3、代謝類型多，代謝強度高。 4、生長繁殖迅速。 5、微生物容易發(fā)生變異。 微生物類群龐雜，種類繁多，包括細胞型和非細胞型兩類，凡具有細胞形態(tài)的微生物稱為細胞型微生物。按其細胞結(jié)構又可分

3、為原核微生物和真核微生物。原核微生物包括細菌、放線菌、藍細菌及其相近的微生物如立克次氏體、支原體、衣原體、螺旋體、粘細菌、鞘細菌和蛭弧菌，它們是本章介紹的重點；真核微生物包括霉菌和酵母菌。 細菌(bacteria)是微生物的一大類群，在自然界分布，種類多，與人類生產(chǎn)和生活關系也十分密切，是微生物學的主要研究對象由于細菌的細胞結(jié)構在原核生物中具有代表性，近年來研究較為深入。 1、球菌、球菌 球形的細菌稱為球菌，單獨存在時為圓形，幾個細菌聯(lián)在一起時其接觸面稍為扁平。按其分裂方向和分裂后排列狀態(tài)，可以分為：單球菌、雙球菌、四聯(lián)球菌、八疊球菌、鏈球菌、葡萄球菌。 2、桿菌、桿菌細胞呈桿狀或圓柱形，各種

4、桿菌的長度與直徑比例差異很大，有的粗短，有的細長，短桿菌近似球狀，長桿菌近似絲狀。一般來說，同一種桿菌其粗細比較穩(wěn)定，而長度則經(jīng)常因培養(yǎng)時間、培養(yǎng)條件不同而有較大變化。有的桿菌很直，有的梢彎曲，有的兩端截平如炭疽芽孢桿菌，有的略尖，有的半圓。 細菌大小隨種類不同差別很大，有的與最大的病毒粒子大小相近，在光學顯微鏡下勉強可見，有的與藻類細胞差不多，幾乎肉眼就可辨認，但多數(shù)細菌居于二者之間。盡管細菌細胞微小，采用顯微鏡測微尺能較容易、較準確地測量出它們的大小。球菌的大小以其直徑表示，桿菌和螺旋菌以其長度與寬度表示，不過螺旋菌的長度是菌體兩端點間的距離，而不是真正的長度，它的真正長度應按其螺旋的直徑

5、和圈數(shù)來計算。 微米micrometer,縮寫m，1微米=10-3毫米(mm)是測量細菌大小的常用單位。最小的細菌只有0.2微米，最大的可達80微米，但一般不超過幾微米。球菌直徑多為0.5-1微米；桿菌直徑與球菌相似，長度約為直徑的一倍或幾倍。桿菌還可細分為小型桿菌(0.2-0.40.7-1.5微米)、中型桿菌(0.5-12-3微米)和大型桿菌(1-1.253-8微米)；螺旋菌為0.3-11-50微米。 二、原理：二、原理： (一)油鏡：利用顯微鏡觀察菌體時，總希望能看見最細小的部分，即分辨率要高。顯微鏡的分辨力是指顯微鏡能夠辨別兩點之間最小距離的能力，主要是由接物鏡來決定的，它與物鏡的數(shù)值孔

6、徑成正比，與光波長度成反比。因此，物鏡的數(shù)值孔徑愈大，光波波長越短，顯微鏡的分辨力越大，被檢物體的細微結(jié)構也愈能明晰地區(qū)別出，所以，一個高的分辨力意味著一個小的可分辨距離，這兩個因素是成反比關系的，通常有人把分辨力說成是多少微米或納米，這實際上是把分辨力和最小分辨距離混淆起來了，顯微鏡的分辨力是用可分辨的最小距離來表示的： 能辨別兩點之間最小距離=/2NA 式中 =光波波長 NA=數(shù)值孔徑 我們?nèi)庋鬯芨惺艿墓獠ㄆ骄L度為0.55m，假如數(shù)值孔徑為0.65高倍物鏡，它能辨別兩點之間的距離為0.42m。而在0.42m以下的距離就分辨不出，即使用倍數(shù)更大的目鏡，使顯微鏡的總放大率增加，也仍然分辨不

7、出。只有改用數(shù)值孔徑更大的物鏡，增加其分辨力才行。例如用數(shù)值孔徑為1.25的油鏡時，能辨別兩點之間的最小距離=0.55/21.25=0.22m。 因此，我們可以看出，假如采用放大率為40倍的高倍鏡（NA=0.65）和放大率為24*的目鏡，雖然總放大率為960*，但其分辨的最小距離只有0.42m，假如采用放大率為100*的油鏡（NA=1.25）和放大率為9*的目鏡，雖然總的放大率為900*，但卻能分辨出0.22m間的距離。 微生物學研究用的顯微鏡的物鏡有低倍鏡10（16mm）、高倍鏡（4mm）和油鏡100（1.8mm）。油鏡常標有紅圈或黑圈，也有以“Ol(oilimmersion)”字樣表示。

8、使用時，油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與物鏡之間不是隔一層空氣，而是一層油質(zhì)，稱為油浸系。這種有常選用香柏油，因香柏油的折射率n=1.25，與玻璃相同，當光線通過玻片后，可直接通過香柏油進入物鏡發(fā)生折射，如果玻片與物鏡之間的介質(zhì)為空氣，稱為干燥系，當光線通過玻片后，受到折射發(fā)生散射現(xiàn)象，進入物鏡的光線雖然減少，這樣就減低了視野的照明度。 利用油鏡不但能增加照明度，更重要的是能增加數(shù)值孔徑，因為顯微鏡的放大率能由其數(shù)值孔徑?jīng)Q定的，所謂數(shù)值孔徑，即光線投射到物鏡上的最大角度（鏡口角）的一半正弦，乘上玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率所得的乘積，可用公式表示。NA=n.sin。式中NA=數(shù)值孔徑、n=介質(zhì)折射率

9、、=最大入射角的半數(shù)，即鏡口角的一半數(shù)。 所以，光線投射到物鏡的角度越大，顯微鏡的效能越大，該角度的大小決定于物鏡的直徑和焦距。同時，的理論限度為900，sin900=1,故以空氣介質(zhì)時（n=1），數(shù)值孔徑不能超過1，如以香柏油為介質(zhì)時，則n增大，數(shù)值孔徑也增大。如當光線入射角為1200，其半數(shù)的正弦為sin600=0.87。 以空氣為介質(zhì)時 NA=10.87=0.87； 以水為介質(zhì)時 NA=1.330.87=1.15; 以香柏油為介質(zhì)時 NA=1.520.87=1.32。 （二）、單染色：（二）、單染色： 由于細菌微小，無色透明，未經(jīng)染色往往不易被識別，因此只有借助于染色法可使細菌著色，與背

10、景形成鮮明對比，便容易在顯微鏡下觀察。 細菌的單染色的原理一般認為是微生物與各種不同性質(zhì)的染料具有親和力而被著色。由于細菌的等電點較低，pH25之間，故在近于中性的環(huán)境中，細菌多帶陰電，易于陽性的堿性染料結(jié)合而著色，因此細菌染色我們一般都用堿性苯胺染料如美藍、堿性復紅、結(jié)晶紫、沙黃、孔雀綠等。 單染色是一種染料使所有細胞都染上相同的顏色，此法簡便，適用于菌體一般形態(tài)的觀察，但不能鑒別細菌，它是染色的基礎，可以觀察細菌的大小。 （三）、革蘭氏染色：（三）、革蘭氏染色： 革蘭氏染色法是細菌學中一種重要的鑒別性染色方法，是1884年有丹麥醫(yī)生Gram創(chuàng)立的，延用至今的經(jīng)典染色法，經(jīng)過革蘭氏染色法后可

11、以把全部細菌分為G+和G-兩大類，鑒定細菌時首先要使用革蘭氏染色法。關于它機制眾說不一，以前有很多解釋，當前認為與細胞壁的結(jié)構和組成有很大關系。革蘭氏染色陽性細菌肽聚糖層厚，含量多，經(jīng)乙醇處理后使之發(fā)生脫水作用而使孔徑縮小，結(jié)晶紫與碘的復合物保留在細胞內(nèi)而不被脫色，復染后不著色，不留結(jié)晶紫的顏色；而革蘭氏染色陰性細菌肽聚糖層很薄，含量少，脂肪含量高，經(jīng)乙醇處理后部分細胞壁脂類可能被溶解并改變其組織狀態(tài)，細胞壁孔徑變大或通透性增加，不能阻止溶劑透入，酒精將結(jié)晶紫與碘的復合物洗脫，細菌被脫色，經(jīng)復染后染成紅色，所有本實驗的成敗關鍵是酒精脫色，脫色不夠?qū)⒏锾m氏染色陰性轉(zhuǎn)變?yōu)楦锾m氏染色陽性，脫色過度將

12、革蘭氏染色陽性變成革蘭氏染色陰性。其次涂片要均勻、薄；再者菌齡也可影響染色性，菌齡老，陳舊的細菌培養(yǎng)物，往往G+轉(zhuǎn)變成G-，一般做革蘭氏染色用18小時左右的細菌培養(yǎng)物，不要超過24小時，以免影響染色性。 細 胞 壁 G+ G-厚度與強度厚、致密、堅韌薄、疏松肽聚糖數(shù)量、含量多層、含量高、占細胞干重4090%單層、含量低、占細胞干重510%脂類含量少、占細胞干重14%多 、 占 細 胞 干 重1122%磷壁酸（垣酸） + 外壁酸（脂多糖、磷酸、脂蛋白） +三、材料：三、材料： 四、操作步驟：四、操作步驟： 圖1 單染色操作步驟五、結(jié)果：五、結(jié)果： 無菌操作技術：無菌操作技術是微生物學實驗中重要的

13、方面。所謂無菌操作技術，是防止微生物進入人體或其他物體造成污染的操作技術。例如，醫(yī)院在進行外科手術時，器械、手術室的滅菌就是防止微生物進入傷口造成感染。 微生物微小，無孔不入，在自然界的各個角落到處都有，空氣、人的體表、口腔、食道等都有微生物存在，所以在實驗時應嚴格進行無菌操作技術，防止雜菌污染。微生物實驗的成敗與無菌操作有密切的關系。 七、作業(yè)：七、作業(yè)：八、預習：八、預習：實驗二實驗二一、實驗目的：一、實驗目的： 二、原理：二、原理： 三、材料：三、材料： 四、方法及步驟：四、方法及步驟： 芽孢的特點是不能繁殖，休眠體，含水少、含脂高、不透明，對外界環(huán)境有很強的抵抗能力，有的芽孢在一定條件

14、下可保持活力數(shù)年甚至數(shù)十年之久，芽孢尤其能耐高溫，像枯草桿菌的芽孢，在沸水中可存活1小時，破傷風芽孢桿菌可存活3小時，而肉毒梭狀芽孢桿菌的芽孢可忍受6小時，即使在1800C干燥箱中仍可存活10分鐘，這主要是2.6吡啶二羧酸與鈣的復合物占芽孢干重515%的原理。 芽孢有的長在中央或近中央，圓形或橢圓形，芽孢的大小，位置，在分類鑒定上有一定的意義，它僅僅是芽孢細菌生活史的一個環(huán)節(jié)，它還是檢驗培養(yǎng)基滅菌徹底不徹底的依據(jù)。 芽孢染色的原理是利用細菌的芽孢和菌體對染料的親和力不同的原理，用不同的染料進行著色，使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區(qū)別。細菌的芽孢壁比營養(yǎng)細胞的細胞壁厚，致密、透性低，著色和脫色都

15、比營養(yǎng)細胞困難。因此，一般采用一種堿性染料（孔雀綠）并在微火上加熱或延長染色時間。我們采用加熱的方法，使菌體和芽孢同時都染上色后，再用水沖洗脫去菌體的染料，此時仍保留芽孢的顏色，并用對照染料來染菌體，這樣就將芽孢和菌體分別染成兩種不同的顏色。其步驟如下： 取枯草桿菌制成涂片、干燥、固定； 用試管夾夾住玻片的一端，在涂片上滴加孔雀綠3 4滴； 加熱5分鐘使冒蒸汽，切勿煮干； 冷卻、水洗（細水）； 蕃紅溶液復染2 3分鐘，水洗； 干燥、鏡檢； 結(jié)果：芽孢呈綠色，菌體呈紅色。 2、莢膜染色法：、莢膜染色法： 有些細菌生活在一定營養(yǎng)條件下，可向細胞壁表面分泌一層松散透明、疏松、柔軟、粘度極大，粘液狀或

16、膠質(zhì)狀的物質(zhì)即為莢膜。 莢膜的化學成分，主要是多糖、多肽、蛋白質(zhì)、脂以及由它們組成的復合物脂多糖、脂蛋白等。 莢膜雖不是細胞的主要結(jié)構，但它是細胞外碳源和能源性貯藏物質(zhì)，并能保護細胞免受干燥的影響，同時能增加默某些病原菌的致病能力，使之抵御宿主吞噬細胞的吞噬。 產(chǎn)莢膜細菌 ，常常給生產(chǎn)帶來麻煩，食品工業(yè)中的粘性面包，粘性牛奶，都是由于染了此類細菌引起的，對制糖工業(yè)威脅更大，由于產(chǎn)莢膜細菌的大量繁殖，增加了糖液粘度，影響了過濾速度，使生產(chǎn)蒙受損失。但在一定條件下，有害的東西可變?yōu)橛幸娴奈镔|(zhì)，如腸膜明串珠菌，在人為控制下，讓其利用蔗糖合成大量產(chǎn)莢膜物質(zhì)葡聚糖。葡聚糖是生產(chǎn)右旋糖酐的原料，而右旋糖酐

17、是帶代血漿的主要成分，具有維持血液滲透壓和增加血溶量的作用，臨床上還用于抗休克、消腫和解毒，所以在醫(yī)學上十分重要。莢膜比菌體要大。 其染色原理是莢膜包圍在細菌細胞外面的一層粘液性物質(zhì)，它是由多糖類衍生物、糖原或多肽所聚積而成，此層對染料結(jié)合力很弱，因此不易染色，故一般采用負染色的方法，使細菌和背景著色，背景與菌體之間形成一透明區(qū)即莢膜，便于觀察，由于莢膜很薄，容易變形，在制片是一般不用加熱固定。其步驟如下： 取鉀細菌一環(huán)，做成涂片，自然干燥（不能加熱干燥）；碳素墨水（用平整載玻片順菌液刮過）；風干；甲醇固定；水洗；蕃紅溶液12分鐘；自然干燥、鏡檢；結(jié)果：背景黑色、莢膜無色、菌體紅色。 五、繪圖

18、：六、預習： 實驗三實驗三一、實驗的目的一、實驗的目的 二、原理二、原理 營養(yǎng)菌絲：又叫初級菌絲體或一級菌絲體，匍匐生長于培養(yǎng)基內(nèi)，主要生理功能是吸收營養(yǎng)物，故亦稱基內(nèi)菌絲。營養(yǎng)菌絲一般無隔膜，直徑0.20.8，但長度相差很大，短的小于100，長的可達600以上，有的無色素，有的產(chǎn)生黃、橙、紅、紫、蘭、綠、褐、黑等不同色素，若是水溶性的色素，還可透入培養(yǎng)基內(nèi)，將培養(yǎng)基染上相應的顏色，如果是非水溶性（脂溶性）色素，則使菌落呈現(xiàn)相應的顏色，因此，色素是鑒定菌種的重要依據(jù)。 氣生菌絲：又稱二級菌絲體。營養(yǎng)菌絲體發(fā)育到一定時期，長出培養(yǎng)基外并伸向空間的菌絲為氣生菌絲。 孢子絲：當氣生菌絲體發(fā)育到一定程

19、度，其上分化出可形成孢子的菌絲即孢子絲，又名產(chǎn)孢絲或繁殖絲。放線菌最突出的特性之一是產(chǎn)生大量的、種類繁多的抗生素，根據(jù)估計，全世界共發(fā)現(xiàn)4000多種抗生素，其中絕大部分是由放線菌產(chǎn)生的。 2 2、霉菌：、霉菌： 霉菌是一些“絲狀真菌”的統(tǒng)稱，不是分類學上的名詞。凡是在基質(zhì)上長成毛狀、棉絮狀或蜘蛛網(wǎng)狀的絲狀真菌統(tǒng)稱霉菌。 霉菌形態(tài)比細菌、放線菌復雜，個體比較大，具有分枝的菌絲體和分化的繁殖器官。因此，在觀察是要注意菌絲的直徑大小，菌絲體有無隔膜，營養(yǎng)菌絲有無假根，無性繁殖或有性繁殖時形成的孢子是哪一種，孢子是怎樣著生的。 由于霉菌的菌絲較粗大，而且孢子容易飛散，如將菌體置于水中容易變形，故觀察時

20、狀不用水浸法制片，而將菌體置于乳酸石炭酸棉蘭染液中，使細胞不易干燥，并有殺菌作用。 三、材料三、材料 四、方法及步驟四、方法及步驟 圖 扦片法 2、霉菌：、霉菌：在載玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉蘭用鑷子取少許霉菌（三種）于染色液中挑開菌絲蓋上蓋玻片鏡檢。 六、作業(yè)六、作業(yè) 七、預習七、預習 實驗四實驗四 一、實驗目的一、實驗目的 二、原理二、原理 計數(shù)板是一塊特制的厚載玻片，玻片上有四個槽構成三個平臺，中間的平臺又由一短的橫槽隔成兩半，其上各刻有一個小方格網(wǎng)。每個方格網(wǎng)共分9個大方格，只有中央的大方格供計數(shù)用稱為計數(shù)室，其邊長為1mm，共刻有400小方格，當加蓋玻片于突起部分上面時，計數(shù)室即形成

21、一個體積為0.1立方毫米（面積為1平方毫米，深度為0.1毫米）。計數(shù)板的規(guī)格有兩種，一種是25中方格16小格=400小格，另一種是16中方格25小格=400小格，但其總體積均為0.1立方毫米（見圖）。 將要數(shù)的樣品（酵母菌）做成懸液，加一滴在計數(shù)板上，蓋上蓋玻片，就可以根據(jù)顯微鏡下觀察到的每小格內(nèi)平均的酵母菌細胞數(shù)，計算出每ml培養(yǎng)液中酵母菌的總數(shù)。其計算公式如下：、1625的計數(shù)板 酵母細胞數(shù)1ml=100小格內(nèi)菌數(shù)/100400103稀釋倍數(shù)2516的計數(shù)板 酵母細胞數(shù)1ml=80小格內(nèi)菌數(shù)/80400103稀釋倍數(shù)五方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)B，1ml=1立方厘米=1000立方毫米

22、。 總菌數(shù)=A/525101000B。 2、顯微鏡測微技術：、顯微鏡測微技術： 微生物的大小通常用測微計來測量，測微計分別有接目鏡測微尺和鏡臺測微尺兩部分。接目鏡測微尺是一塊圓形玻片，在中央有一帶刻度的尺，等份成50或100小格，而每一格的大小是相對的，在同一接目鏡下，它是隨不同放大率的物鏡而改變其相對比例；鏡臺測微尺為一塊載玻片，上面膠有一圓形玻片，其中央部分有精確的刻度尺，刻度尺的長度是已知的，長度為1mm等份為100小格，每小格間的距離為0.01mm，即10微米。因為鏡臺測微尺是放置在載物臺上，所以它每格的長度就是測量時的實際長度。在使用時，必須先用鏡臺測微尺來校正目鏡測微尺，以求出在某

23、一放大率下，目鏡測微尺每小格所代表的實際長度，然后將鏡臺測微尺換上標本，在相同放大率下測出標本上微生物占目鏡測微尺幾格，就可算出微生物的大小。 三、器材三、器材 四、方法及步驟四、方法及步驟 取已稀釋到100倍（或50倍）的酵母菌懸液一管，用滴管滴一滴于蓋玻片邊緣，使菌液自行滲入（不能有氣泡產(chǎn)生），多余的菌液用吸水紙吸干，置于顯微鏡下計數(shù)。 計數(shù)時，按計數(shù)板的對角線方法，數(shù)右上右下，左上左下，通常以記五個中格的菌值來代表計數(shù)室中的含菌量，即各角上的中格及中央的一個中格的酵母數(shù)（即80小格），每個樣品計數(shù)需要重復兩次，若數(shù)據(jù)相差太大，則要重復計數(shù)。 計數(shù)完畢后，將計數(shù)器在水龍頭下沖洗，絕不能用硬

24、物洗刷，以防損壞計數(shù)室，洗完后自行涼干或用吹風機吹干，鏡檢觀察每小格內(nèi)是否有殘留的菌體和其他沉積物，若不干凈則必須重復洗滌至干凈為止。 2 2、測微技術：、測微技術： 接目鏡測微尺的校正： 接目鏡測微尺是一塊圓形玻片，在玻片中央刻有刻度尺，等份成50或100小格，每小格的長度必須經(jīng)鏡臺測微尺校正后求得（見圖）。 鏡臺測微尺為一塊載玻片，在上面膠有一塊圓玻片，其中央有精確的刻度尺，長度為1mm等分為100小格，每小格為10 接目鏡測微尺裝入接目鏡內(nèi)隔板（光欄）上，刻度向下，并把鏡臺測微尺置于載物臺上。 先用低倍鏡校對，調(diào)節(jié)至能清晰地看到鏡臺測微尺為止 移動鏡臺測微尺和旋轉(zhuǎn)目鏡測微尺，使兩者的刻度

25、平行，并使目鏡測微尺的“O”與鏡臺測微尺的一條線重合，然后找出兩個尺的另一條線重合線之間兩種測微尺上的格數(shù) 按照下列公式即可求出在低倍鏡下目鏡測微尺每格的長度：目鏡測微尺每格長度（微米）=兩條重合線間鏡臺測微尺格數(shù)10 兩條重合線間目鏡測微尺格數(shù)如：目測為30小格等于臺測為20小格，已知臺測每格為10微米，則20小格的寬度為2020=200微米，那么相應的在目鏡測微尺上每格長度為（2020）30=6.6（微米）。 用同樣方法校正并求出在高倍鏡上目鏡測微尺每格的長度。 （2）菌體大小的測定： 接目鏡測微尺校正好后，將鏡臺測微尺從載物臺上取下來，換上待測標本。 在高倍鏡下，以目鏡測微尺來測量標本的

26、長和寬各占幾格，即可算出該標本的大小。 （1）將目鏡測微尺校正結(jié)果填人下表接物鏡接物鏡倍數(shù)目鏡測微尺格數(shù)鏡臺測微尺格數(shù)目鏡測微尺每格代表的長度/m低倍鏡高倍鏡油鏡 （2）將各菌測定結(jié)果填入下表 目鏡測微尺寬長 微生物名稱每格代表的長度/m目鏡測微尺格數(shù)寬度/m目鏡測微尺格數(shù)長度/m菌體大小范圍/m釀酒酵母 果將結(jié)果記錄于下表中。A表示五個中方格中的總菌數(shù)；B表示菌液稀釋倍數(shù)。 AB二室菌數(shù)/mL 各中格中菌數(shù) 12345 平均值 第一室 第二室 實驗五實驗五 培養(yǎng)基的制備與滅菌培養(yǎng)基的制備與滅菌 二、原理二、原理 1、培養(yǎng)基：、培養(yǎng)基：培養(yǎng)基是按照微生物生長繁殖所需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)，用人工的方

27、法配制而成的一種基質(zhì)。它是微生物的生活環(huán)境，各種微生物對養(yǎng)分和培養(yǎng)基的物理、化學條件要求不一樣，為了分離、培養(yǎng)、鑒定、保存和研究不同種類的微生物，就應當根據(jù)它們的需要，配制合適的培養(yǎng)基。微生物在培養(yǎng)基上生長、發(fā)育，必須在一定的最適酸堿度范圍才能表現(xiàn)出它們最好的生命活動。不同的微生物對對酸堿度的要求不同，因此，我們在配制培養(yǎng)基時，必須調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值。 培養(yǎng)基的種類繁多，根據(jù)培養(yǎng)基的成分、物理性狀不同，可分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基 天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基：主要成分是復雜的天然有機物質(zhì)，如馬鈴薯、玉米粉、豆餅粉、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等，

28、這些復雜天然有機物質(zhì)的成分不完全了解，每次所用的原料，其中各成分的數(shù)量也不恒定的天然有機物質(zhì)配制成的培養(yǎng)基，如：牛肉膏蛋白胨、馬鈴薯、麥芽汁培養(yǎng)基。適用于生產(chǎn)上大規(guī)模培養(yǎng)微生物。 合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基是用化學成分完全了解的純化合物藥品配制而成的培養(yǎng)基，也稱化學成分明確的培養(yǎng)基（chemically defined medium），高氏一號培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基等。一般適用于在實驗室范圍內(nèi)研究微生物的形態(tài)、營養(yǎng)代謝、分類鑒定、生物測定、菌種選育和遺傳分析等工作。 半合成培養(yǎng)基：半合成培養(yǎng)基：在以天然有機物作為微生物營養(yǎng)來源的同時，適當補充一些成分已知的化學藥品所配制的培養(yǎng)基叫半合成培養(yǎng)

29、基。大多數(shù)微生物都能在此種培養(yǎng)基上生長，應用廣泛，如，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，很多霉菌都生長良好。 固體培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑即為固體培養(yǎng)基，常用凝固劑有瓊脂、明膠、硅膠，硅膠用于配制自養(yǎng)微生物的固體培養(yǎng)基；對于其他多數(shù)微生物來講，瓊脂最為合適，一般加入1.52.5%即可凝固成固體，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基等。此培養(yǎng)基可供微生物的分離、鑒定、活菌計數(shù)、菌種保藏等。 半固體培養(yǎng)基：半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入少量凝固劑即配成為半固體培養(yǎng)基，如，加入0.20.7%瓊脂作為凝固劑。用來觀察細菌運動特征、鑒定菌種、菌種保藏和噬菌體的效價滴定等。 液體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基：不加任何凝固劑

30、配好后成為液體狀態(tài)的培養(yǎng)基。如，糖發(fā)酵液體培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基等。常用于大規(guī)模的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)、遺傳學研究、生理代謝等基本理論的研究工作。 根據(jù)培養(yǎng)基的特殊用途可分為基礎培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基： 基礎培養(yǎng)基：基礎培養(yǎng)基：含有一般細菌生長繁殖需要的基本營養(yǎng)物質(zhì)，常用的基礎培養(yǎng)基是牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，也是作為某些特殊培養(yǎng)基的基礎成分。 加富培養(yǎng)基：加富培養(yǎng)基：是在基礎培養(yǎng)基中加入血、血清、動物組織提取液或植物組織提取液，主要用于對培養(yǎng)某些微生物要求比較苛刻的營養(yǎng)。 選擇培養(yǎng)基：選擇培養(yǎng)基：是根據(jù)某一種或某一類微生物的特殊營養(yǎng)要求或?qū)σ恍┪锢?、化學條件的抗性而設計的培養(yǎng)基。一種是

31、根據(jù)某些微生物對碳、氮源等營養(yǎng)的特殊要求所設計的選擇性培養(yǎng)基，就可以分離到能分解某些物質(zhì)的微生物。如以纖維素作唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基，可以分離到分解纖維素微生物；無氮培養(yǎng)基可以分離到固氮微生物。另一種是根據(jù)某些微生物對一些物理、化學因素的抗性而設計的培養(yǎng)基，最常用的是在培養(yǎng)基中加入某些化學物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長繁殖。如在分離放線菌時，在培養(yǎng)基中添加10%的酚數(shù)滴可抑制細菌和霉菌的生長，又如分離霉菌的馬丁氏（Martun）培養(yǎng)基。 鑒別培養(yǎng)基：鑒別培養(yǎng)基：是在基礎培養(yǎng)基中加入某種化合物或化學試劑，某種微生物在這種培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，它所產(chǎn)生的某種代謝產(chǎn)物與某種化合物或化學試劑能發(fā)生某種明顯

32、的特征性反應，根據(jù)這一特征性反應可以將某種微生物與其他種微生物區(qū)別開來，如糖發(fā)酵培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基 2、滅菌：、滅菌： 消毒與滅菌兩者有不同的概念。消毒一般是指消滅病原菌和有害微生物的營養(yǎng)體而言，而不能殺死全部芽孢，因此，消毒只是一種常用的衛(wèi)生措施；滅菌則是指殺滅一切微生物的營養(yǎng)體、芽孢和孢子，因此，滅菌后的物品是無菌的。滅菌的方法很多，有加熱、過濾、照射和化學藥品等。 加熱法：加熱法：又分干熱滅菌和濕熱滅菌兩種。 a干熱滅菌：干熱滅菌：有火焰燒灼和熱空氣滅菌兩種?；鹧鏌茰缇m用于接種環(huán)、接種針和金屬用具（如鑷子）等，無菌操作時的試管口和瓶口也在火焰上短暫燒灼滅菌。通常所說的干熱滅菌是在

33、電熱干燥箱內(nèi)滅菌，此法適用于玻璃器皿（如吸管和培養(yǎng)皿）等的滅菌，在熱空氣1601700C下保溫2小時進行滅菌。 b濕熱滅菌：濕熱滅菌：高壓蒸汽滅菌發(fā) 此法時將物品放在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持1530分鐘進行滅菌，時間的長短可根據(jù)滅菌物品種類和數(shù)量的不同而有所變化，以到達徹底滅菌為準。這種滅菌適用于培養(yǎng)基等的滅菌。間歇滅菌法 有少數(shù)培養(yǎng)基例如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、含糖培養(yǎng)基等用于干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌均會受到破壞，則必須用間歇滅菌法。此法是用阿諾氏流動蒸汽滅菌器進行滅菌，將滅菌培養(yǎng)基放入滅菌器內(nèi)，每天加熱1000C，30分鐘，連續(xù)3天，第一天加

34、熱后，其中的營養(yǎng)體被殺死，將培養(yǎng)物去出放室溫下1824小時，使其中的芽孢發(fā)育成營養(yǎng)體，第二天再加熱1000C，30分鐘，發(fā)育的營養(yǎng)體有被殺死，但可能仍有芽孢，故再重復一次，使徹底滅菌。煮沸消毒法 注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般微生物學實驗室中煮沸消毒時間1015分鐘，人用注射器和手術器械在有條件的地方，一般均采用高壓蒸汽滅菌法或干熱滅菌法滅菌。 表 蛋白質(zhì)含水量與凝固所需溫度的關系卵白蛋白含量/%30分鐘內(nèi)凝固所需的溫度505625748018809061450160170滅菌鍋留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關系全部空氣排2/3空氣排l/2空氣排l/3空氣排空氣全不排壓力數(shù)MPaKg

35、/cm2Ib/in2出時的溫度/出時的溫度/出時的溫度/出時的溫度/出時的溫度/0.030.070.100.140.170.210.350.701.051.401.752.1051015202530108.8115.6121_3126.2130.0l34.610010911512112613094105112118124128901001091151211267290100109115121表 干熱濕熱穿透力及滅菌效果比較溫度/時間/h滅菌透過布層的溫度/ 20層10層100層 干熱130-140濕熱105.343861017210170.5101不完全完全 三、材料：三、材料： 1、藥品、藥

36、品：Nacl 蛋白胨 牛肉膏 可溶性淀粉 K2HPO4 Hcl NaOH 瓊脂 葡萄糖 蔗糖 NaSO4 黃豆芽 馬鈴薯等。 2、器材：、器材：臺秤 三角瓶 試管 漏斗 電爐 搪瓷杯（鋁鍋） 試管架 玻棒 滴管 稱量紙 pH試紙 棉花 紗布 牛皮紙 棉線 滅菌鍋 干燥箱等。 四、方法及步驟：四、方法及步驟： 1、一般培養(yǎng)基的配制：、一般培養(yǎng)基的配制： 稱量：稱量：按照培養(yǎng)基配方，稱取各種成分； 熔化：熔化：在容器中先加入所需蒸餾水水量的一部分，依次將各成分加入，使全部溶解，最后補足水量。若用蛋白胨、牛肉膏等物質(zhì)配制培養(yǎng)基時，需加熱溶解，并補足因蒸發(fā)而減少的水分。配制固體培養(yǎng)基時，先將上述配好的

37、液體培養(yǎng)基加熱到快沸時，再將稱好的瓊脂加入，繼續(xù)加熱到瓊脂完全溶化，在加熱溶解過程中要不斷攪拌，以免瓊脂糊底，并控制火力，防止沸騰外溢。 矯正矯正pH值：值：初配制好的培養(yǎng)基，往往不能符合所需求的pH值，故必須矯正，用精密pH試紙，以1NHCl或1NnaOH調(diào)節(jié)至所需要的pH值。 過濾：過濾：用濾紙、棉花或雙層紗布過濾。 分狀：分狀：根據(jù)不同的需要，可將制成的培養(yǎng)基分裝于三角瓶或試管內(nèi)，分裝時取玻璃漏斗一只，裝在漏斗架上，漏斗下連接橡皮管與一根玻璃管相接，橡皮管上夾一只彈簧夾，將培養(yǎng)基到入漏斗內(nèi)，用左手拿空試管的中部，并將漏斗下玻璃管插入試管內(nèi)，以右手拇指和食指開放彈簧夾，中指及無名指夾住玻璃

38、管上端，使培養(yǎng)基流入管內(nèi)（見圖）。注意不要使培養(yǎng)基沾污上段管壁及管口，保持棉塞的干凈。分裝量根據(jù)試管大小和實際需要而定。制備試管斜面培養(yǎng)基時，每支的分裝量約為管高1/5左右為度，液體培養(yǎng)基分裝試管的量以管高的1/4左右為宜，三角瓶的分裝量，不宜超過三角瓶的一半。 棉塞的制作與滅菌：棉塞的制作與滅菌：棉塞要做的形狀、大小、松緊完全合適，緊貼管壁不留縫隙，正常的棉塞，頭稍大些，約有2/5在外，3/5在試管內(nèi)（見圖1），塞好棉塞后，用牛皮紙包扎，置高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌。 斜面培養(yǎng)基的制作：斜面培養(yǎng)基的制作：固體培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，如果要做成斜面，則在取出試管后略為冷卻，而后放置桌上，管口端放在木條上或其

39、他支持物上，使其傾斜，傾斜度以培養(yǎng)基正好形成斜面為準（見圖2）。 無菌試驗：無菌試驗：培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，必須先放進370C恒溫箱內(nèi)，經(jīng)24小時后，若無微生物生長才能使用。 2、滅菌：、滅菌： 滅菌是微生物生產(chǎn)和實驗的基本技術，其方法很多，因滅菌對象及設備條件不同而適當選用。下面分別介紹幾種常用的滅菌方法。 干熱滅菌：干熱滅菌：這種滅菌法是利用熱空氣使物體升溫，而導致物體上所帶的微生物由于干熱脫水而死亡。常用于空玻璃器皿、金屬用具等的滅菌，對于帶膠皮的物品、液體及固體培養(yǎng)基等不能使用此法滅菌。 使用步驟： 將要滅菌的器皿（培養(yǎng)皿、吸管等）包扎好，放入恒溫干燥箱內(nèi)。 接通電源，打開開關；旋動恒溫調(diào)節(jié)

40、器至1600C，當達到此溫度時，借助恒溫調(diào)節(jié)器的自動控制，保持恒溫兩小時。兩小時后，關掉電源，當溫度降至與室溫差不多時，打開箱門，去出滅菌物品，并將調(diào)節(jié)器旋轉(zhuǎn)到“0”。 （2）高壓蒸汽滅菌 此種滅菌方法的原理是在一密閉容器中，煮沸時形成的蒸汽不能擴散到容器外面去，而堆積在密閉的容器內(nèi)，使蒸汽壓力升高；隨著水的煮沸，溫度也就相應增高。利用過熱的蒸汽來使細菌及其耐熱芽孢蛋白質(zhì)凝固變性，以致失去生命力，從而達到徹底滅菌的效果。 高壓蒸汽滅菌是最有效的滅菌方法。一般在1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持1530分鐘進行滅菌，就可殺死一切微生物細胞及其芽孢或孢子。進行高壓蒸汽滅菌的

41、儀器叫高壓蒸汽滅菌鍋。滅菌對象是培養(yǎng)基、玻璃器皿和各種不因高溫處理而變質(zhì)的物品材料。但對一些不耐高溫、高壓的溶液或培養(yǎng)基不宜用此種方法。 鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三腳擱架相平為宜。 打開滅菌鍋蓋，把要滅菌的材料裝入鍋內(nèi)，注意不要放得太擠，防礙蒸汽流通，影響滅菌效果。 蓋好滅菌鍋鍋蓋，按對角線形式均勻擰緊鍋蓋上的螺栓，螺栓松緊一致，切勿漏氣。 打開排汽開關，以排除鍋內(nèi)的冷空氣。 打開電源，排除冷空氣。水沸騰后，滅菌鍋內(nèi)就逐漸充滿蒸汽，并將冷空氣排出，待冷空氣完全排盡后，關閉排汽開關。讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升，當鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時。控制熱源，維持壓力至所需時間。本實驗用1.05k

42、g/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持1530分鐘。 滅菌所需時間到后，關閉熱源。 讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當壓力降至“0”時，打開排汽開關。 打開滅菌鍋蓋，去出已滅菌的物品及培養(yǎng)基。 將取出的滅菌培養(yǎng)基放入370C恒溫箱中培養(yǎng)24小時，經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可使用。 （3） 間隙滅菌 有少數(shù)培養(yǎng)基例如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、含糖培養(yǎng)基等用于干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌均會受到破壞，則必須用間歇滅菌法。此法是用阿諾氏流動蒸汽滅菌器進行滅菌，將滅菌培養(yǎng)基放入滅菌器內(nèi)，每天加熱1000C，30分鐘，連續(xù)3天，第一天加熱后，其中的營養(yǎng)體被殺死，將培養(yǎng)物去出放室溫下1824小時，使其中的芽孢發(fā)育成

43、營養(yǎng)體，第二天再加熱1000C，30分鐘，發(fā)育的營養(yǎng)體有被殺死，但可能仍有芽孢，故再重復一次，使徹底滅菌。 (4)紫外線滅菌 紫外線是一種強殺菌劑，其波長在20003000之間都具有殺菌作用，其中以25002800者殺菌力最強。它的殺菌機制主要是因為它誘導了胸腺嘧啶二聚體的形成，從而抑制了DNA的復制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成o，再使O2氧化成臭氧(O3)或使水（H2O）氧化生成過氧化氫（H2O2）,O3和H2O2均有殺菌作用。它的殺菌作用隨劑量的增加而增加，不同微生物對紫外線的敏感性是不同的。一般細菌經(jīng)紫外線照射510分鐘，即可死亡。接種室和接種箱常紫外線燈光作空氣滅菌。由于紫

44、外線穿透力不強，故一般只適用于物體表面和環(huán)境的滅菌。為了加強紫外線的滅菌效果，在開燈以前，可以在接種室內(nèi)噴霧苯酚溶液。室內(nèi)的桌面和坐凳可用0.1%新潔爾滅溶液擦洗，然后再開紫外線燈光照射2050%分鐘（視接種室大小而定），以殺死空氣中各種微生物細胞及芽孢為原則，必要時，可做無菌檢查。 五、為下一次實驗準備：五、為下一次實驗準備： 六、作業(yè)：六、作業(yè)： 七、預習：七、預習： 實驗六實驗六 微生物的純種分離培養(yǎng)微生物的純種分離培養(yǎng) 二、實驗原理 在自然界里，微生物的種類繁多，數(shù)量很大，幾乎都是雜居在一起的，為了適應工、農(nóng)、醫(yī)發(fā)展的需要，常常從自然界中分離，以獲得新的種。土壤是微生物的大本營，在土壤

45、物質(zhì)轉(zhuǎn)化中具有多種重要作用，它與土壤肥力和植物營養(yǎng)有密切關系，同時又是工業(yè)和醫(yī)藥用菌的資源。純種分離是從含有很多種微生物的自然材料中，通過稀釋分離、劃線分離、單細胞分離等方法，使它由單個的個體在固體培養(yǎng)基上繁殖形成單個菌落，由于此菌落是由一個個體繁殖而來的，故可獲得了純種。這種獲得單個菌株純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離和純化。 從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。常用的方法有1.簡易單細胞挑取法它需要特制的顯微操縱器或其他顯微技術，因而其使用受到限制。簡易單孢子分離法是一種不需顯微單孢操作器，直接在普通顯微鏡下利用低倍鏡分離單孢子的方法。它采用很細的毛

46、細管吸取較稀的萌發(fā)的孢子懸浮液滴在培養(yǎng)皿蓋的內(nèi)壁上，在低倍鏡下逐個檢查微滴。將只含有一個萌發(fā)孢子的微滴放一小塊營養(yǎng)瓊脂片，使其發(fā)育成微菌落。再將微菌落轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中，即可獲得僅由單個孢子發(fā)育而成的純培養(yǎng)。 2.平板分離法該方法操作簡便，普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理包括兩方面：（1）選擇適合于待分離微生物的生長條件，如營養(yǎng)、酸堿度、溫度和氧等要求或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。（2）微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成的單個菌落可以是由一個細胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲取單個菌落的方法可通過稀釋涂布

47、平板或平板劃線等技術完成。 三、實驗用品(一)材料 土壤樣品、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基、豆芽汁培養(yǎng)基。(二)器材 無菌培養(yǎng)皿、無菌吸管、無菌水、酒精燈、接種環(huán)、接種針、火柴等。 四、實驗操作（一）好氧性微生物的分離1.連續(xù)稀釋分離法（1）稀釋土樣 稱1g土樣，在火焰旁加到有99mL無菌水和少許玻璃珠的三角燒瓶內(nèi)，將瓶子依左右方向振蕩數(shù)十次，使土樣與水充分混合，將菌分散，土樣中的菌被稀釋了100倍，土壤懸液的稀釋度為10-2。用無菌吸管吸取土壤懸液lmL，加到一個盛有9mL無菌水的試管內(nèi)，稀釋1000倍制成稀釋度為10-3。的土壤懸液，將此吸管在試管內(nèi)反復吹洗3次，然后取

48、出，通過火焰，再插入紙?zhí)變?nèi)，以備再用。輕輕搖動試管，使菌液均勻。再用剛才用過的吸管，插入試管內(nèi)，反復吹洗3次，然后取出lmL菌液，加到另一支9mL無菌水中，制成稀釋度為10-4的土壤懸液（圖2-1）。用微量加樣器亦需反復吸吹3次，用畢棄去塑料吸嘴。 同法按每級稀釋10倍的次序得到lO-5、10-6的土壤稀釋液，稀釋完后，用最后一支吸管（或塑料吸嘴），由最小的稀釋液（10-6）開始吸取0.2mL加到編號為10-6的培養(yǎng)皿，再依次分別從10-5、10-4試管中各吸取0.2mL稀釋液，加到相應編號的培養(yǎng)皿內(nèi)，每次吸取時，吸管都要在稀釋液中反復吹洗幾次。 圖2-1 從土壤分離微生物操作過程 制備土壤稀釋液稱取士樣10g，放人盛90m1無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20min，使土樣與水充分混合，將細胞分散。用一支1ml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取1ml(無菌操作見圖2-2)加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10-1、10-2、