真菌學(xué)試驗(yàn)報(bào)告

1、真菌學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告一，實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私庹婢螒B(tài)的基木特征。2W掌握絲狀真菌制片方法。7夕掌握內(nèi)生真菌的分離方法掌握真菌的鑒定方法。一,前G真菌廣泛分布于地球表而.從高山、湖泊到田野、森林，從海洋、 高空到赤道、兩極，到處都有真菌。真菌雖然不在空氣中生長(zhǎng)繁殖， 但它的泡子卻成群的漂浮在天空，只要稍微注意你會(huì)發(fā)現(xiàn)人類原來(lái)生 活在真菌的汪洋大海中。當(dāng)今世界，生物技術(shù)已邁入世界經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)，真菌學(xué)在生物 技術(shù)的大潮中得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。真菌是原始的真核生物，具有廣泛 的多樣性，真菌生長(zhǎng)我繁殖迅速，在很短的時(shí)間內(nèi)就可以得到比動(dòng)物 和植物多得多的后代，能夠直接、快速地進(jìn)行遺傳性狀分離的分析。 因此，真菌可以作為

2、研究基礎(chǔ)生物學(xué)過(guò)程中的一個(gè)重要工具，真菌基 因的多樣性以及真菌分子生物學(xué)的發(fā)展，為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)提供了一個(gè) 廣闊的天地。植物的生長(zhǎng)環(huán)境直接影響內(nèi)生真菌的生物多樣性，植物物種的年 代越久遠(yuǎn)，其生物內(nèi)生真菌的多樣性越豐富：抗病原性能越強(qiáng)的植物, 其所含的內(nèi)生真菌具有抗菌活性的可能行就越大；其所含的內(nèi)生真菌 有可能產(chǎn)生與植物相同或相似的抗菌無(wú)知或產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)可能 參與了藥用植物的抗菌過(guò)程，木實(shí)驗(yàn)通過(guò)植物病原真菌和升、爐細(xì) 菌的抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)莖，根，花，種子或果實(shí)內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物具有 不同程度的抑菌能力，并且對(duì)彳+、爐有普片遍的抑菌作用。研究和 開發(fā)內(nèi)生真菌的尋找新的抗菌活性物質(zhì)具有廣泛的應(yīng)用前景。

3、三,材料與方法：材料：在校園內(nèi)采集銀杏、喜樹、桂花樹樣品包括葉、莖、根、花、種 子或果實(shí)。和2藥品與試劑：葡萄糖、蛋白月東、"歹歹勿、禺S0“ 曲力，馬鈴薯、瓊 脂。孟加拉紅，青霉素，鏈霉素，甲基藍(lán)，蛋白腺，酵母膏，蔗糖， 磷酸鹽，葡萄糖，瓊脂條，無(wú)菌水等。消毒劑：右的乙醇，07%升 汞（孕鄉(xiāng)）,次氯酸鈉溶液（含活性氯力）, %雙氧水。雙蒸水、 瓊脂糖，加飽和酚、疏基乙醇0 處許必咖"，石英砂，加飽和 酚，氯仿，異戊醇，無(wú)水乙醇，硼酸，冰醋酸，氯化鈉，鹽酸，氫氧 化鈉，勿加，en亦培養(yǎng)基：3.1.3.!鈴薯、葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基馬鈴薯汁滋滋，葡萄糖升瓊脂玄鄉(xiāng)（注：取去皮馬鈴薯宓

4、克，切成小塊，加水必毫升 煮沸分鐘，濾去馬鈴薯塊，將濾液補(bǔ)足至必毫升，加 葡萄糖克，瓊脂"克，溶化后分裝，3磅滅菌分鐘察氏瓊脂培養(yǎng)基蔗糖升昇鄉(xiāng)，總/。鄉(xiāng)，"0.5和頭SO戶Q0.0® 衲卩0“鄉(xiāng)，瓊脂 鄉(xiāng)，蒸憎水滋滋，自然曲3.7.M夕沙氏培養(yǎng)基蛋白腺鄉(xiāng)，葡萄糖或麥芽糖“鄉(xiāng)，瓊脂70克，水100心制法：7將上述物質(zhì)稱好，放入水中煮沸溶解（不必調(diào) 砂即有5 左右）分中號(hào)試管（約“毫升）包扎，高壓tt5°C20分鐘。趁熱斜好， 凝固備用。3.1.3.4馬丁氏培養(yǎng)基葡萄糖7%蛋白腺鄉(xiāng)，材廬5®禺SO/*/。鄉(xiāng)，7%孟加拉 紅3.34瓊脂水視Z,彫值自

5、然?？股赜梅ㄅc用量：培養(yǎng)基滅菌之后分裝前按鏈霉素切， 青霉素殳71用量加入，冷卻到45 C）土右未凝固時(shí)加入抗生素，混 勻倒平板。四,方法：«和采樣方法：在校園內(nèi)找到銀杏、喜樹、桂花樹并用刀采集葉、莖、根、皮、 種子。“.圧樣品前處理：分別取根、莖、葉、果實(shí)，用洗滌劑在自來(lái)水下洗凈。老樹皮用右酒精進(jìn)行表面消毒后，用銀子取出，于酒精燈上燒 灼3秒至表面焦糊，切成AS/大小置于尢"固體培養(yǎng)基上。對(duì)于根、莖、葉、果實(shí)按下列程序進(jìn)行表面消毒：右的酒精漂（浸）洗2七如-無(wú)菌水沖洗“6次一07%升汞不同的消毒時(shí)間（見(jiàn) 表仝2共設(shè)置7個(gè)梯度）一無(wú)菌水沖洗“"次一用滅菌濾紙吸干

6、多 余水分一無(wú)菌刀片將材料切成小塊將根、莖的表皮、韌皮部、木質(zhì)部 大致分開，并切成O0X%/大小。將果實(shí)的外種皮去掉，消毒之后將內(nèi)種皮去掉。滅菌時(shí)，瀝干的植物材料轉(zhuǎn)放到燒杯中，記好時(shí)間，倒入消毒溶 液，不時(shí)用玻璃棒輕輕攪動(dòng)，以促進(jìn)材料各部分與消毒溶液充分接觸, 驅(qū)除氣泡，使消毒徹底。在快到時(shí)間之前分鐘，開始把消毒液傾 入一備好的大燒杯內(nèi)，要注意勿使材料倒出，傾凈后立即倒入無(wú)菌水, 輕攪漂洗。滅菌時(shí)間是從倒入消毒液開始，至倒入無(wú)菌水時(shí)為止。滅 菌液要充分浸沒(méi)材料。寧可多用些滅菌液，切勿勉強(qiáng)在一個(gè)體積偏小 的容器中使用很多材料滅菌。4.1.3內(nèi)生菌的分離方法：將上述組織塊置于分離培養(yǎng)基上（每一平皿

7、培養(yǎng)5塊組織塊）于 刃巴恒溫培養(yǎng)，同時(shí)將上述消毒過(guò)程中最后一次沖洗組織塊后的無(wú)菌 水滴在培養(yǎng)基上平行培養(yǎng)，用以檢測(cè)消毒是否徹底。觀察菌絲生長(zhǎng)情 況及污染情況。am純化方法:培養(yǎng)夕"天后及時(shí)采用尖端菌絲挑取法，挑取形態(tài)不同的菌絲或 菌落移種到新鮮 E培養(yǎng)基上。純化頭“次以保證所得菌落為純培 養(yǎng)。z形態(tài)鑒定方法：4.2培養(yǎng)方法:42H培養(yǎng)基：查氏培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基和弋彳培養(yǎng)基。4.2. 2將“°C保存菌種活化刃欠；421.3將活化菌種分別點(diǎn)種沖、沙氏、察氏平板，每重復(fù)4.2.1.425aC恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天；421.5然后進(jìn)行菌落特征描述，取一個(gè)平行進(jìn)行制片（膠 帶子粘片法），

8、觀察個(gè)體形態(tài)；421.6另兩個(gè)平行繼續(xù)培養(yǎng)至力天，取出；421.7重復(fù)步驟“，作為最終描述結(jié)果；421.8根據(jù)真菌分類鑒定手冊(cè)和相關(guān)資料分析確該菌的歸屬。“,22制片方法：膠帶粘貼法：選用在顯微鏡油鏡下觀察細(xì)致不粗糙且粘性好的膠 帶。取一小段膠帶從菌落表面的中心向邊緣粘，%乙醇固定，乳酸 石炭酸棉藍(lán)染色液染色，將粘有菌絲的一面向上，蓋上蓋玻片，于顯 微鏡下觀察產(chǎn)泡結(jié)構(gòu)等特征。鑒定標(biāo)準(zhǔn)：觀察的要點(diǎn)：彳2“菌落宏觀形態(tài)：大小：以菌落的直徑（*«*«）表不。顏色：包括菌落表面和背而的顏色，及色素是否滲入培養(yǎng)基。菌落表而的紋飾：如皺紋、輻射溝紋、同心環(huán)、整個(gè)菌落致密或 疏松等。菌落

9、的質(zhì)地：氈狀、毯狀、絨毛狀、棉絮狀、粉粒狀、革質(zhì)狀、 有無(wú)成束狀或繩狀的氣生菌絲。菌落的高度：扁平、凸起或隆起，及菌落中心部分狀況等。菌落邊緣：全緣、鋸齒狀、樹枝狀等。滲出物：菌落表而有無(wú)液滴及液滴的顏色等。425個(gè)體形態(tài)：菌絲的特征：表而性狀（粗糙或光滑），寬度等分生泡子梗：分支情況簡(jiǎn)單或復(fù)雜，輪生或單生等；長(zhǎng)短；基 部粗糙或光滑等。產(chǎn)泡結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征：形狀，大小，著生狀況（位置，單生、互 生或成輪生體）分生泡子的形態(tài)：形狀，大小，表面狀況，聚集方式（直鏈、斜 鏈或聚集成頭）分子生物學(xué)鑒定：培養(yǎng)方法：培養(yǎng)基成分與不加瓊脂的 吟固體培養(yǎng)基成分相同。將液體培 養(yǎng)基以7羽必每瓶分裝至02三角瓶中，

10、用了層紗布封口。WC, 蒸汽滅菌203將菌絲致密的真菌接種到液體培養(yǎng)基中，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中0、I2g 培養(yǎng)G7天。用兩層滅菌紗布過(guò)濾菌絲球，用無(wú)菌蒸憎水沖洗菌絲球S次，避免 培養(yǎng)基中的糖類和蛋白對(duì)*提取的影響。下烘干菌絲，但是不要過(guò)于干 燥，然后進(jìn)行*的提取。“，M2基因組羽的提取捉取采刖 0*73* 法 ° 纟7矽（dncmcdc, I' / 烷 基三乙基浪化鍍）是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù) 合物，在高鹽溶液中是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度時(shí)，從 溶液中沉淀，通過(guò)離心可將刃診與核酸的復(fù)合物同蛋口質(zhì)、多糖類 物質(zhì)分開，然后將0%與核酸的復(fù)合物沉淀溶解于

11、高鹽溶液，再加 乙醇使核酸沉淀，刃蟲能溶解于乙醇。刃蟲法的好處是能很好地去掉糖類雜質(zhì)，提取前期可得到高含量的*?！?M2用 刃并法提取材料刃的具體步驟如下:將切3%在分&水浴鍋中預(yù)熱，研缽用液氮預(yù)冷；432.2取0鄉(xiāng)左右菌絲體，在液氮中迅速研磨成粉末后，迅速加 入刃必預(yù)熱的提取液及矽“郵銃基乙醇，混合均勻后把混合液轉(zhuǎn)入 2弘必離心管中700以/管；432.3于650水浴保溫0.5心 時(shí)間不能超過(guò)7.%。保溫期間要 輕輕振搖幾次;4.M2.4冷卻至室溫后，加入等體積（7002的飽和酚：氯仿：異戊醇忽5： %:，充分混勻后靜置7久心。432.5萬(wàn)Z1200&甘,1皿,室溫幾去沉淀，

12、將上清液轉(zhuǎn)入干凈 離心管中。432.6根據(jù)雜質(zhì)的去除情況重復(fù)步驟“、5數(shù)次，直至無(wú)雜質(zhì);4.327加入等體積氯仿：異戊醇（： 抽提一次以去除飽和酚， 離心室 溫丿；432.S將上清液逐滴加入兩倍體積的力C預(yù)冷無(wú)水乙醇，以沉淀出FM。曲放H*. 10 - 20倫誠(chéng),可以過(guò)夜;432.9挑取或離心去上清液S弘Q的方法取出刃*右乙醇洗滌兩次；<to>歹匕保溫箱中干燥后溶于適量的店緩沖液中“t?備用。么“所用引物們S5:矽乂"鄉(xiāng)加族久0%加妬嗨鄉(xiāng)們S4： %牝牝7"7升7"初？“.“.卩空反應(yīng)條件:“""7體系：Q空反應(yīng)體系為羽u公體系，包

13、括:11108%頁(yè)腳內(nèi)容爐G7S （厶g cC77P. %7P、7P）：各 200p %0.2i %7矽酶:72滋,送測(cè)序公司。勿分模板:預(yù)變性亦C變性亦C復(fù)性57°C延伸72°C延伸補(bǔ)齊72C10mui“"？條件：擴(kuò)增條件弘55個(gè)循環(huán)443測(cè)序方法:“"“序例分析:五.結(jié)果及分析：結(jié)果：試驗(yàn)分離到兩種真菌5 7八爪金盤分離到菌種查氏正反照菌落宏觀形態(tài)：大小：菌落的直徑顏色：包括菌落表面棕黑色背而灰色，色素滲入培養(yǎng)基。菌落表而的紋飾：如皺紋、整個(gè)菌落致密。菌落的質(zhì)地：氈狀菌落的高度：凸起或隆起。菌落邊緣：鋸齒狀。滲出物：菌落表而無(wú)液滴。5/?個(gè)體形態(tài)：菌

14、絲的特征：表而粗糙。分生泡子梗：分支復(fù)雜，輪生。5/6分子生物學(xué)鑒定通過(guò)R豕擴(kuò)增和序列分析，送公司檢測(cè)得到的序列為：伯gmese妙如如eesgemeg%妙初 e妙切知" 滬只艸ermgsgigig斤丼幻只we丼只只ax尹e斤前幻阿的只幻engxxeg®共 eegguEs丹ge滬ernsec斤 “幵纟©eg enggixng%meg eg劣egeege劣geg只ee%gggueme ugieee丼斤gegngiggx只艸mieg幵斤xqq釦彳門egggxggsxgeeg 丼也幻sgmxggg/nxeeegsgxx 07i幻s尺斤幻gq旳通過(guò)他”序列分析得到的結(jié)果為：

15、勺如必滋加“ 100況wz彳鍛m tAc 2ceuf Sc鄉(xiāng)心宓©Cosor fortcor*tO»»rySc鄉(xiāng)心宓&認(rèn)q 沏叫S 祇 afq傀的tota:Oescriftionr r r r r r r r r r r r r r r rlir»"jnranftir.：uc dmai r. 1 -A7-122-0?S-fl 1 -iir<c IBS fivr：zfr« R賀；=2 -nai sc.：i|c<ii"a irramy traMmh- crartr 11 / .' 1cm】z»

16、;m;th -. KT , J；I Kr ;r>n nCbdospcrum ip &S-S12 lfinbscc l r I q .-r 21 r* PXm1Lacona "d rtcrrul tnwcnbaClicasccrTini tcrursimin IdS rfiTIA Q*fie Ip * iflHA aener f QT£,snd ntwryiltjyg"IU“2U, UL了忙匕Ld/ IdUrriA rr fnfrn<L dm a f?Fi*Al，久C 1nd fifiiritnsan an】1口11411,til Pt J AA

17、C jntTl V /tl11 Irrm rai* Mh'ije.fTRSd 18*lid H_N1 u i、iWXGErdF4 UGUaiAabm?lRMAn«ie Win|arnsiraIjrrdlHC rur»：i 必 fTHR£Ur»:Mtrgfur»iK dmafTkOda 1BSUnaikreCfumsdaiefTHTcSA、俠fTHTai 1肛Ueaanc fu 儻心 den? fTHTdl 1&S Ab”orr必lj“mrmchir>：i俺£5仁；？*»花“九?1尺"(<

18、：的9 0叭2的0舊"4' "f和58£c：omc*r 前2ndir“mNtrUgfLRChjmu&CmglTS矩8 HR 俗SciMsynilRMAo莎3-Mrt3g(»ncg nhni3lF3n$cn対d3DI 58$n：®niMfinAqgM.2ndrtMMlUnailred sod furyis done RlJO (AS rijoscmbl Rflqem padul sequence; mtemM transoued spacer 15 89 nboaonnl RHA qene, a" ntemal i:Ma

19、x sccreTotal scoreQuaycaverE vrfueMax riertAccs&wn1035103598%0093%、F28斛"f10351(05m0.099%GO 妙口 f10%們98%00mGU797“111055値98S00MOBEl1033103J98S00林10331D3398S0099%GU 72167111033103398%0099%GU721555 110約1(G39870.0gCU721&乙 110331(3)98%00紐GU 721631 110J31(3398H00GU7215S10X3IKtJ96S00烷GU721527.11

20、033103J98%0099%GUT21513 11033103398%0099%GU7213<0 110»1(3398H0.0gF功血2110站個(gè)S8S0.0夠EV71&M&1103110319BH00曲8沁1n»；vn?i rhc n如r s：inMmaiTRUn cultured fungus clone L046937-122-075-C01 -u nis 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gen

21、e, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequenceGenBanK： JF269117.1FASTA Gmohicw PaeSalLOCUSDEFINITIONUncultured rungus clone gene, partial sequence: rii>o3caal RITA aene, and602 bp L016937-l2Z-075-COl-uni5 185 ZlbO30mal RNA internal transcribe

22、d spacer lz 58S incemal cranacrlled 3pacer 2, coxtple匚eMAm*ar ENV 02MOV-2011XCCES5I0MVER3ICNREWORDSsecruence; aril 285 rlbcsomal 2Spaxilai sequenceJF2B9117 JF239117.1 ENV.GI:35472O3?4SOURCEORGANISMuncuicurca rungusunculcured runausEuicaryova; Funai; environaenLal daitple日.REFZREKCEAUTHORS1 (bases 1

23、co 602)Fzohlich-Hoxoisky J, 3uzzows3H. Xiu,2. Hngling,G.Solamzn,P.A.F FraserrE.P, Mayol-BracerarO.L, Artaxo,P.r 0eg*rowr D. f Conrad, R Andreas,H.0, Deispres, VR and Poschlr U.TITLEJOURNAL REFZREt：CEAUIHCR5TITLE3iogccaropny m tne air: rungal diversicy over lend ard oceana Siogecsci Discuss 8r 7071-7

24、096 (2011)2 (bases 1 go 602)Frohlich-Wouolsky,J,OespreaVR and Poschl,U Direct SubmissionJOURNAL Submitted (01-FEB-2011) Biogecchemistry Max Planok Institute foxChemistry, Joh-Jcachin-EEcheM-Nmo 27, Mainz 5512Sr GermanyFEATURESsourceLocaulon/Qualiriers】.602/oraanisn；=r,uncultured funavsr,/nci_c7pe=,gencmic dna”/iaola*icn 3ourcc-"air filter airplc"/dh_xref=ntaxon:175245n/clone=nL046937-122-C75-C01