抗腫瘤藥物藥效學指導原則

1、抗腫瘤藥物藥效學指導原則一、基本原則1. 抗腫瘤藥物分類(1) 細胞毒類藥物 (cytotoxic agent) ：包括干擾核酸和蛋白質(zhì)合成、抑制拓撲 異構酶及作用于微管系統(tǒng)的藥物等；(2) 生物反應調(diào)節(jié)劑 (biological response modifier)；(3) 腫瘤耐藥逆轉劑 (resistance reversal agent) ；(4) 腫瘤治療增敏劑 (oncotherapy sensitizer)；(5) 腫瘤血管生成抑制劑 (tumor angiogenesis inhibitor)；分化誘導劑 (differentiation inducing agent) ；(7

2、) 生長因子抑制劑 (growth factor inhibitor) ；反義寡核苷酸 (antisense oligonucleotide) 。2. 抗腫瘤藥物藥效學需研究內(nèi)容2.1 包括體外抗腫瘤試驗，體內(nèi)抗腫瘤試驗。2.2 評價藥物的抗癌活性時，以體內(nèi)試驗結果為主，同時參考體外試驗結果以 做出正確的結論。2.3 I 類抗腫瘤新藥應進行藥物作用機制初步研究。二、體外抗腫瘤活性試驗1. 試驗目的1.1 對候選化合物進行初步篩選；1.2 了解候選化合物的抗瘤譜；1.3 為隨后進行的體內(nèi)抗腫瘤試驗提供參考，如劑量范圍、腫瘤類別等2. 試驗方法選用 10-15 株人癌細胞株，根據(jù)試驗目的選擇相應細

3、胞系及適量的細胞接種濃度，按常規(guī)細胞培養(yǎng)法進行培養(yǎng)；推薦使用四氮唑鹽MTT還原法、XTT還原法、磺酰羅丹明 B(SR 染色法、或 51Cr 釋放試驗、集落形成法等測定藥物的抗癌作 用。藥物與細胞共培養(yǎng)時間一般為 48-72 小時，貼壁細胞需先貼壁 24 小時后 再給藥。試驗應設陽性及陰性對照組，陽性對照用一定濃度的標準抗腫瘤藥， 陰性對照為溶媒對照。3. 評價標準 以同一樣品不同濃度對腫瘤細胞抑制率作圖可得到劑量效應曲線，然后采用 Logit法計算半數(shù)有效濃度(IC50值或EC50值)。體外試驗至少重復一次。附注：評價藥物抗癌活性的方法：1. MTT 還原法1.1 基本原理：四 氮 唑 MTT

4、,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide是一種能接受氫原子的染料?；罴毎€粒體中與NADP相關的脫氫酶在細胞內(nèi)可將黃色的MTT轉化成不溶性的藍紫色的甲月替(formazan)，而死的 細胞則無此功能。用二甲基亞諷(DMSO溶解甲月替后，在一定波長下用酶標 儀測定光密度值，即可定量測出細胞的存活率。1.2 操作步驟 :，用胰酶消化后，用含 10小牛血清的 RPMI l640 培養(yǎng)基配成 5000 個 ml 的 細胞懸液，接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種200卩l(xiāng) , 37C, 5% C02培養(yǎng)24 h。1.2.2 實

5、驗組換新的含不同濃度被測樣品的培養(yǎng)基，對照組則換含等體積溶劑的培養(yǎng)基，每組設35平行孔，37C, 5% CO2培養(yǎng)45 d。棄去上清液，每孔加入200卩I新鮮配制的含0.2 mg /ml MTT的無血清 培養(yǎng)基.37C繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心棄上清，并加入 200卩I DMSO,用微型超聲 振蕩器混勻后，在酶標儀上以試驗波長為 570 nm,參比波長為450 nm測定光密 度值。1.3 結果評定 :按下式計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率：腫瘤細胞生長抑制率= （1- OD實驗/OD對照）X 100% 以同一樣品的不同濃度對腫瘤細胞生長抑制率作圖可得到劑量反應曲線，從中 求出樣品的半數(shù)殺傷濃度IC50

6、。合成化合物或植物提取純品的IC50V 10卩g/ m1或植物粗提物的IC50 V 20卩g/m1時，貝卩判斷樣品在體外對腫瘤細胞有殺傷 作用。2. 生長曲線法的基本原理：在最適條件下，腫瘤細胞在培養(yǎng)液中呈指數(shù)生長，如取細胞數(shù)的對數(shù)與培養(yǎng)時 間作圖可得一條直線，故稱此時為對數(shù)生長期。隨著細胞密度不斷增高，由于 代謝產(chǎn)物的積聚及營養(yǎng)物的消耗，細胞生長逐漸減慢以致停止，此時稱高坪期 或穩(wěn)定期。因此藥物對細胞生長的影響可通過生長曲線反映出來。3. 染料排斥試驗的基本原理： 活細胞有排斥某些染料如伊紅、臺盼藍、苯胺黑等的能力，而死細胞由于膜完 整性的破壞，可被著色。因此培養(yǎng)的腫瘤細胞中加入這些染料，一

7、定時間后， 對著色和未著色的細胞進行計數(shù)，即可算出被殺死的細胞比例。4. 集落形成法的基本原理： 克隆原細胞具有持續(xù)增殖能力，當單個細胞分裂 6 代或 6 代以上時，其后代所 組成的群體 (集落)便含 50 個以上細胞。通過集落計數(shù)可對克隆原細胞作定量分 析。它反映了單個細胞的增殖潛力，故能較靈敏地測定抗癌藥的活性，日前被 認為是一種較理想的檢測方法。常用的集落形成法可分為貼壁法及半固體培養(yǎng) 法兩種。5. SRB 法的基本原理：SRB(sulforhodamine 是一種蛋白質(zhì)結合染料，粉紅色，可溶于水。 SRB 可與生物大分子中的堿性氨基酸結合。其在 515 nm波長的0D讀數(shù)與細胞數(shù)呈良好

8、的 線性關系。故可用作細胞數(shù)的定量。 MTT法的一個缺點是0D直可隨放置時間而 變，而SRB法無此現(xiàn)象。因此更適用于進行大規(guī)模的試驗。三、體內(nèi)抗腫瘤試驗 體內(nèi)抗腫瘤試驗必須選用三種以上腫瘤模型，其中至少一種為人癌裸小鼠移植 模型或其它人癌小鼠模型。試驗結果三種模型均為有效，再重復一次也為有效， 評定該化合物對這些實驗性腫瘤具有治療作用。鼓勵使用人類腫瘤裸鼠移植瘤模型和多種類的移植瘤模型、原位接種模型和中 空纖維測定 (hollow-fiber assay)等方法。1. 動物 動物要求健康，符合等級動物要求，有實驗動物合格證。雌雄均可，但同一批 實驗中動物性別必須相同。小鼠鼠齡為 5-6 周，體

9、重為 18-22 克。評價同一物 質(zhì)的活性時，不同批次的實驗必須采用同一品系的小鼠。2. 腫瘤模型2.1 小鼠腫瘤模型淋巴細胞白血病腹水瘤 L1210和P388白血病L-615、宮頸癌U14肝癌H22Lewis肺癌、黑色素瘤B16、網(wǎng)織細胞瘤M5076腸癌26、腸腺癌38、乳腺癌CD8F1艾氏腹水瘤(EAC、肉瘤-180等，以及各種小鼠腫瘤的亞型和耐藥株等。2.2 人癌裸小鼠移植瘤模型 應選用體外試驗敏感細胞株進行體內(nèi)抗人癌裸小鼠移植瘤試驗。 模型建立和使 用應注意：(1) 移植瘤一般由相應的細胞株移植而建立，對細胞株和移植瘤的化療敏感性 應予了解。(2) 移植瘤復蘇后一般應傳 2-3 代后再

10、用于體內(nèi)抗腫瘤試驗。(3) 對模型生長情況應全面了解，尤其是生長快的模型(4) 為了保持移植瘤的生物學特性和遺傳特性，復蘇后移植瘤體內(nèi)傳代應少于15-20 代3. 試驗過程3.1 接種： 腫瘤接種方法主要有皮下接種、腹腔接種和原位接種。3.1.1 皮下腫瘤模型 選擇腫瘤生長旺盛且無潰破的荷瘤小鼠，頸椎脫臼處死，在無菌條件下（超凈 臺或接種罩），用碘酒、酒精或新潔爾滅消毒動物皮膚，切開皮膚，剝離腫瘤。 將瘤組織剪成 1.5 mm3 左右，用套管針接種于動物一側或雙側腋窩皮下；或制 成細胞懸液，然后按一定比例加入無菌生理鹽水，一般每只小鼠接種腫瘤細胞 數(shù)量為（1-5） x 106。3.1.2 腹水

11、瘤模型 無菌條件下，消毒動物皮膚，吸取生長良好的動物腹水，以生理鹽水按一定比 例稀釋后接種于動物腹腔，接種細胞數(shù)量一般為（1-5）x 106。3.1.3 原位接種模型 原位接種是指將來源于某臟器的腫瘤接種在動物的某臟器，如將人肝癌接種在 裸小鼠的肝臟。原位接種不是常規(guī)的方法，但有其優(yōu)越性，是鼓勵使用的方法。 主要有肺、肝、胃、腸、乳腺、顱內(nèi)等原位接種方法。3.2 動物分組3.2.1 試驗設陰性對照組、陽性對照組、治療組。3.2.2 治療組設高、中、低三個劑量組。小鼠腫瘤和腹水瘤接種后次日將動物 隨機分組，裸鼠移植瘤用游標卡尺測量移植瘤直徑， 待腫瘤生長至 100300mm3 后將動物隨機分組。

12、3.2.3 動物數(shù)普通小鼠每組 10 只，裸鼠 6 只。 陰性對照組動物數(shù)為治療組動物數(shù)X實驗組數(shù)1/23.3 劑量設置3.3.1 治療組設高、中、低劑量治療組，一般按 4:2:1 設置，高劑量使用最大 耐受量或 LD 1 0的劑量。3.3.2 陰性對照組給予相應的溶劑；3.3.3 陽性對照藥選用對該動物敏感的、臨床應用的抗腫瘤藥物，3.3.4 如受試物為一抗癌藥物的衍生物或類似物時，必須選用該抗癌藥物作為 陽性對照藥。3.4 陽性對照藥選擇原則療效確切；與被試物質(zhì)化學結構類似；與被試物質(zhì)有類似的作用機理3.5 藥物配制 溶于水的藥物，用生理鹽水或蒸餾水配制；如用酸、堿溶解者，可先用小量酸(0

13、.1-0.5N HCI)或堿(NaHC03 Na2CO3 NaOH溶解，調(diào)節(jié) pH在 4.5-9.0 的范圍 內(nèi)。用乙醇、丙二醇、吐溫80、DMS助溶的藥物，或用吐溫60、吐溫80、2-3% 淀粉、 0.5%羧甲基纖維素制成混懸液的藥物，可腹腔注射或口服，但必須設相 同濃度的溶劑對照組。用注射用花生油配制的溶液或乳劑可口服、皮下或肌肉 注射。3.6 給藥方案和給藥途徑 分組當日開始給藥，根據(jù)不同藥物的代謝動力學和毒性反應等確定給藥方案。給藥途徑應與推薦臨床用藥的途徑相同。 給藥次數(shù)較多，或被試物質(zhì)溶解性較 差，靜脈給藥有困難時，可考慮使用腹腔給藥，但在評價藥效時要注意這兩種 給藥途徑是有差別的

14、。 可采取瘤周、瘤內(nèi)、肌肉、皮下給藥途徑。腹水瘤試驗 時一般不能應用腹腔給藥途徑。4 評價標準4.1 腹水瘤模型 接種給藥后，觀察和記錄動物死亡時間，計算生存天數(shù)。如陰性對照組20%動物存活時間超過 4 周，表明腹水瘤生長不良，實驗作廢。采用中位生存時間(即 median survival time,MST )來評價每組的生存時間 ， 其計算公式為：每組鼠數(shù)的中間數(shù) - 中間生存天數(shù)前死亡的鼠數(shù)MST=(中間生存天數(shù)-0.5 ) +中間生存天數(shù)死亡的鼠數(shù)治療組與對照組的比較，采用 T/C( %)來表示，計算公式為：T MSTT/C % =X 100%C MSTT MST治療組MST; C MS

15、T陰性對照組 MST評價標準以125%界，當T/C%> 125%時。視為有效，反之則無效。4.2 裸鼠移植瘤模型 推薦使用測量瘤徑的方法，動態(tài)觀察受試物抗腫瘤的效應。腫瘤直徑的測量次 數(shù)根據(jù)移植瘤的生長情況而定，一般為每周 2-3 次, 每次測量同時還需稱鼠重。 腫瘤體積 (tumor volume,TV) 的計算公式為：V = 1/2 x aX b2 或 n /6 x ax bXc其中 a、b、c 分別表示長寬高。兩公式的相關性極好，可采用任一公式。 根據(jù)測量結果計算出相對腫瘤體積( relative tumor volume，RTV)， RTV = Vt / VO。其中VO為分籠給藥

16、時(即dO)測量所得腫瘤體積，Vt為每一次測量時的 腫瘤體積?？鼓[瘤活性評價指標為相對腫瘤增殖率 T/C(%) TRTVT/C % =X 100%CRTVTRTV治療組RTV ; CRTV陰性對照組 RTV療效評價標準：T/C % >60 %為無效；T/C % < 60%并經(jīng)統(tǒng)計學處理 PV0.05為 有效。4.3 小鼠腫瘤模型 生長較慢小鼠腫瘤采用與裸鼠移植瘤同樣的測量瘤徑的評價方法。 生長較快小鼠腫瘤可采用稱瘤重的方法評價。試驗結束后處死動物，稱體重， 解剖剝離瘤塊，稱瘤重。陰性對照組腫瘤平均瘤重小于 1 克，或 20%腫瘤重量小 于 400毫克，表示腫瘤生長不良，試驗作廢。療

17、效評價公式：X 100%給藥組平均瘤重-陰性對照組平均瘤重腫瘤生長抑制率二 陰性對照組平均瘤重評價標準：腫瘤生長抑制率40%為無效；腫瘤生長抑制率40%并經(jīng)統(tǒng)計學處理 PV0.05 為有效。4.4原位接種模型不同原位接種模型可采用不同評價方法，主要有瘤重和生存時間評價法。如肝 原位接種可用瘤重評價，顱內(nèi)接種可用生存時間評價。評價方法、標準和注意 事項同腹水瘤模型和小鼠腫瘤模型。四、抗腫瘤藥物的特殊要求I類抗腫瘤新藥應進行藥物作用機制的初步研究。 非細胞毒類藥物除完成體內(nèi)外 抗腫瘤試驗，還應進行特定抗腫瘤作用研究。1.生物反應調(diào)節(jié)劑藥效學包括：體內(nèi)抗癌試驗和免疫功能研究。1.1體內(nèi)抗癌試驗注意點

18、：模型：裸鼠是免疫缺陷動物，一般應用正常免疫鼠腫瘤模型。給藥時間：可按常規(guī)給藥，也可在接種前預先給藥，接種后繼續(xù)給藥或停藥。腫瘤細胞接種量：可比細胞毒類藥物低一個數(shù)量級， 一般為(1-5)105個瘤細胞/小鼠。給藥方法：可單獨給藥，也可與其它抗腫瘤藥物合并使用，觀察增效或減毒作 用。1.2 免疫功能試驗方法具有抑瘤作用的生物反應調(diào)節(jié)劑，還需作免疫功能測定 , 以明確其抑瘤作用是否 與免疫功能調(diào)控有關。免疫功能測定包括細胞免疫和體液免疫兩方面。 免疫功能測定有：（ 1） 巨噬細胞功能測定（ 2） 天然殺傷細胞 （natural kill cell）測定（ 3） 淋巴細胞轉化試驗（ 4） 淋巴因子

19、活化的殺傷細胞測定 （lymphocyte- activated killer cell）（5） 各種細胞因子測定，如 IL-2、IL-6、IL-12、IFN- 丫、TNF-a 等。（ 6） 遲發(fā)型超敏反應檢測2. 腫瘤耐藥逆轉劑2.1 體外抗耐藥活性試驗選擇2-3對腫瘤耐藥/敏感細胞株，采用MTT法或SRB法測定細胞毒性。一般在 無毒劑量或相當于 IC 1 0的劑量下設三個劑量， 并設立相應的陽性和陰性對照組。評價逆轉效果用逆轉倍數(shù)（fold reversal, FR）表示：FR=IC50（不加逆轉 劑）/IC50（加逆轉劑）。注意的方面：耐藥株的耐藥性：耐藥株因傳代，尤其是撤藥后耐藥性可改

20、變或消失；試驗前必須對試驗耐藥株進行耐藥倍數(shù) (FR) 測定，確保試驗的可靠性。若非逆轉多藥 耐藥 (MDR) 而是逆轉單藥耐藥，則實驗的瘤株中需有針對該藥的耐藥細胞株。 陽性對照藥建議采用維拉帕米(verapamil) 10 卩M環(huán)孢菌素 A (cyclosporin A) 3 卩 M。2.2 體內(nèi)抗腫瘤耐藥活性試驗小鼠敏感和對應的耐藥腫瘤和人癌裸鼠敏感和對應的耐藥移植瘤。2.3 耐藥基因及其表達產(chǎn)物測定 可測定腫瘤細胞內(nèi)的藥物濃度變化和耐藥基因及其表達產(chǎn)物，初步明確其逆轉 耐 藥 機 制 。 包 括 多 藥 耐 藥 基 因 及 其 編 碼 蛋 白 (multidrug resistance

21、gene/p-glycoprotein,Mdr1/Pgp)resistance-related多 藥 耐 藥 相 關 蛋 白 (multidrugprotein, MRP) 、 肺 耐 藥 相 關 蛋 白 (lungresistance-related protein, LRP)、其它與耐藥相關的基因 / 蛋白及酶等。3. 抗腫瘤轉移藥物 腫瘤是否轉移不僅依賴于腫瘤細胞本身具有的內(nèi)在轉移潛能，而且也取決于機 體抗轉移因素的消長。所以，抗轉移藥物只有在動物體內(nèi)模型上才能得出符合 實際的結果。3.1 體外試驗測定候選化合物作用下腫瘤細胞對基底膜的侵襲、粘附和腫瘤細胞趨化性運動 的能力。3.2 體內(nèi)

22、試驗小鼠 B16 黑色素瘤、小鼠 Lewis 肺癌等和人癌裸鼠移植高轉移瘤模型。3.2.2 接種方法： 常用靜脈注射方法，也可用皮下接種等方法。3.2.3 評價指標 接種給藥后，觀察記錄動物死亡時間，計算生存天數(shù)。試驗結束后，稱動物體 重、肺重、移植瘤重，解剖顯微鏡下計數(shù)肺轉移瘤灶、測瘤徑 （ 計算肺轉移瘤體 積）和病理組織學切片觀察等；計算轉移率轉移抑制率二1 -（ 治療組轉移率/對照組轉移率）X 100%4. 腫瘤血管生成抑制劑4.1 體外試驗 體外試驗模型有 :（ 1 ）人血管內(nèi)皮細胞模型： 人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞和人微血管（肺、皮膚等）內(nèi)皮細胞。（2）血管形成促進因子等刺激細胞DNA合成

23、、增殖、遷移、血管形成（tube或堿性成纖formation） 來觀察藥物的抗血管形成作用。如血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF) 維細胞生長因子 (basic fibroblast growth factor,bFGF)(3)腫瘤細胞模型：主要應用國內(nèi)已建立的人實體癌細胞系，確定VEGF FGF等高分泌的細胞株。檢測細胞增殖、轉移能力及血管形成因子的基因表達狀況來評價藥物。4.2 體內(nèi)試驗4.2.1 血管抑制試驗經(jīng)典的血管形成評價方法有：雞絨毛膜尿囊和卵黃膜囊( CAM、嚙齒動物虹膜 和角膜等。也可用如皮下移植塑料或多孔的 polytetrafluoroethylene 管、皮 下移植無菌的海綿； 一些自然的或化學修飾的物質(zhì)如 Matrigel 和纖維凝膠等用 于體內(nèi)模型。4.2.2 抗腫瘤試驗 通過觀察新生血管生成抑制劑的體內(nèi)抗腫瘤效應檢測移植瘤的血管密度、血管 生成因子和抑制因子的分泌和表達，以及腫瘤的轉移情況等綜合評價腫瘤血管 生成抑制劑的作用和作用機制。5. 分化誘導劑 分化誘導劑的藥效學研究包括體外和體內(nèi)研究模型；目前的藥物主要能對急性 白血病進行有效的分化治療。陽性對照藥選用維甲酸類 (