動(dòng)物肝臟DNA提取和鑒定-實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1、甘肅中醫(yī)藥大學(xué)核酸的分類核酸的分類l DNA (DNA (脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸) ) 主要存在于細(xì)胞核的染色體中。主要存在于細(xì)胞核的染色體中。 核外也有少量核外也有少量DNADNA，如線粒體，如線粒體DNADNA（mtDNAmtDNA），葉綠），葉綠體體DNADNA（cpDNAcpDNA），質(zhì)粒），質(zhì)粒DNADNA。l RNARNA（核糖核酸）（核糖核酸） 存在于細(xì)胞質(zhì)中，如存在于細(xì)胞質(zhì)中，如mRNA, rRNA, tRNAmRNA, rRNA, tRNA等。等。l 除上述除上述DNADNA，RNARNA外，外，還有非細(xì)胞形式存在的病毒和噬還有非細(xì)胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含菌體，其

2、或只含DNADNA，或只含有，或只含有RNARNA。核酸的理化性質(zhì)核酸的理化性質(zhì)l在細(xì)胞內(nèi)通常與蛋白質(zhì)結(jié)合，以復(fù)合物形式存在在細(xì)胞內(nèi)通常與蛋白質(zhì)結(jié)合，以復(fù)合物形式存在l微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有機(jī)溶劑微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有機(jī)溶劑l在酸性溶液中容易降解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。在酸性溶液中容易降解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。lDNADNA溶液粘度很大，溶液粘度很大，RNARNA的粘度較小的粘度較小l在強(qiáng)大離心力的作用下，可以從溶液中沉降下來(lái)在強(qiáng)大離心力的作用下，可以從溶液中沉降下來(lái)l 濃鹽法：濃鹽法：利用利用RNA和和DNA在不同鹽濃度溶液中的溶解在不同鹽濃度溶液中的溶解度不同

3、將二者分離。度不同將二者分離。l離子去污劑法：離子去污劑法：利用利用SDS、CTAB（十六烷基三甲基溴（十六烷基三甲基溴化銨）等去污劑使蛋白質(zhì)變性，直接從生物材料中提取化銨）等去污劑使蛋白質(zhì)變性，直接從生物材料中提取DNA。l 苯酚抽提法：苯酚抽提法：苯酚既是蛋白變性劑，又能抑制苯酚既是蛋白變性劑，又能抑制DNase的降解。用苯酚處理勻漿液時(shí)，由于蛋白與的降解。用苯酚處理勻漿液時(shí)，由于蛋白與DNA連接鍵連接鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。溶于水相?；蚪M基因組DNA

4、的提取方法的提取方法 核酸制備中常用的去垢劑核酸制備中常用的去垢劑 核酸本身帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核核酸本身帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑。酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑。 去垢劑的作用：去垢劑的作用： 1 1溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂；溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂； 2 2溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來(lái)；來(lái)； 3 3對(duì)對(duì)RNase、DNase有一定的抑制作用。有一定的抑制作用。如：如：SDS、脫氧膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、4-4-氨基水楊酸鈉、萘氨基水楊酸鈉、萘-1

5、.5-1.5-二磺二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉 作用：作用： 1. 1.使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。成蛋白污染。 2.2.某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制 RNase活性和破裂細(xì)胞的作活性和破裂細(xì)胞的作用。用。 如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑l核酸制備中常用的酶核酸制備中常用的酶 DNase: :降解降解DNADNA RNase：降解：降解RNARNA 蛋白酶蛋白酶K K：降解蛋白質(zhì)：降解蛋白質(zhì)

6、 溶菌酶溶菌酶：破碎細(xì)胞：破碎細(xì)胞 核酸提取的主要步驟核酸提取的主要步驟l沉淀核酸，去除鹽類，沉淀核酸，去除鹽類，有機(jī)溶劑等雜質(zhì)有機(jī)溶劑等雜質(zhì)l除去與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、除去與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子：酚脂類等生物大分子：酚/氯仿抽提、氯仿抽提、蛋白變性劑（蛋白變性劑（SDS、異硫氰酸胍、異硫氰酸胍等）、蛋白酶處理、高鹽洗滌等）、蛋白酶處理、高鹽洗滌l除去其它不需要除去其它不需要的核酸分子的核酸分子l破碎細(xì)胞：研磨、組織勻漿、破碎細(xì)胞：研磨、組織勻漿、超聲、凍融；異硫氰酸胍、超聲、凍融；異硫氰酸胍、堿裂解；酶解（溶菌酶）堿裂解；酶解（溶菌酶）注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)l加入加入R

7、NA降解降解酶除酶除RNAl加入加入DNA酶抑制劑：檸酶抑制劑：檸檬酸、氰化物、砷酸鹽、檬酸、氰化物、砷酸鹽、EDTA、SDS、苯酚等、苯酚等l蛋白變性劑反應(yīng)蛋白變性劑反應(yīng)不宜過(guò)于劇烈不宜過(guò)于劇烈l 避免過(guò)酸、避免過(guò)酸、過(guò)堿及高溫過(guò)堿及高溫一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模阂弧?shí)驗(yàn)?zāi)康模?1、學(xué)習(xí)并掌握用濃鹽法從動(dòng)物組織中的提取DNA方法及其原理。 2、學(xué)習(xí)和掌握二苯胺法測(cè)定DNA的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理l溶于高鹽溶液（溶于高鹽溶液（1mol/L）, 微溶于低鹽溶液（微溶于低鹽溶液（0.14mol/L）l溶于低鹽溶液（溶于低鹽溶液（0.14mol/L） 微溶于高鹽溶液（微溶于高鹽溶液（1mol/L）

8、p 核酸含量的測(cè)定方法：紫外吸收法、定磷法和分別針核酸含量的測(cè)定方法：紫外吸收法、定磷法和分別針對(duì)對(duì)DNA和和RNA的顏色反應(yīng)方法。的顏色反應(yīng)方法。p 脫氧核糖核酸中的脫氧核糖在脫氧核糖核酸中的脫氧核糖在酸性環(huán)境酸性環(huán)境中變成中變成-羥基羥基-酮基戊醛與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色化合物，在酮基戊醛與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色化合物，在595nm處有最大的吸收處有最大的吸收 。p DNA20400微克范圍內(nèi)，光密度與微克范圍內(nèi)，光密度與DNA的濃度成正比，的濃度成正比，在反應(yīng)液中加入少量乙醛，可以提高反應(yīng)的靈敏度。在反應(yīng)液中加入少量乙醛，可以提高反應(yīng)的靈敏度。 三、實(shí)驗(yàn)試劑三、實(shí)驗(yàn)試劑l95%冷

9、乙醇、冷乙醇、NaCl固體固體l二苯胺：稱取純二苯胺二苯胺：稱取純二苯胺1g溶于溶于100ml冰醋酸中，加入冰醋酸中，加入10ml過(guò)過(guò)氯酸，混勻。臨用時(shí)加氯酸，混勻。臨用時(shí)加1ml1.6%乙醛溶液，所配置試乙醛溶液，所配置試劑應(yīng)為無(wú)色。劑應(yīng)為無(wú)色。l0.14molL NaCl0.05molL 檸檬酸鈉緩沖液檸檬酸鈉緩沖液(PH=6.8)lDNA標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)液200ug/ml:DNA鈉鈉鹽用鹽用5mmol/L的的NaOH配制。配制。l氯仿氯仿/異戊醇異戊醇=20：1（V/V）l5% SDS組織搗碎勻漿機(jī)組織搗碎勻漿機(jī)豬肝豬肝8g勻勻 漿漿16ml的的 檸檬酸鈉緩沖液檸檬酸鈉緩沖液離心，離心，400

10、0r/min ,10min上清（棄掉）上清（棄掉）沉淀沉淀沉淀沉淀25ml緩沖液洗滌緩沖液洗滌離心，離心，4000r/min ,20min上清（棄掉）上清（棄掉）40ml的的 檸檬酸鈉緩沖液檸檬酸鈉緩沖液沉淀沉淀21ml氯仿氯仿/異戊醇異戊醇4ml 5% SDS振蕩振蕩 30 min（保鮮膜封口）（保鮮膜封口）加入加入3.6gNaCl 固體，固體，終濃度為終濃度為1mol/L離心，離心，3500r/min ,20min吸取上清（量取體積）吸取上清（量取體積）95%冷乙醇（緩慢加入）邊冷乙醇（緩慢加入）邊加邊朝一個(gè)方向緩慢攪動(dòng)加邊朝一個(gè)方向緩慢攪動(dòng)DNA粗制品粗制品除去蛋白質(zhì)的方法除去蛋白質(zhì)的方

11、法 lSDS（十二烷基硫酸鈉）等去（十二烷基硫酸鈉）等去污劑使蛋白質(zhì)變性，可以直接污劑使蛋白質(zhì)變性，可以直接從生物材料中提取從生物材料中提取DNAl防止防止DNA酶的降解，提取時(shí)可酶的降解，提取時(shí)可加入適量加入適量EDTA（乙二胺四乙（乙二胺四乙酸）、檸檬酸，以降低酸）、檸檬酸，以降低DNA酶酶的活性的活性l氯仿一異成醇使蛋白氯仿一異成醇使蛋白質(zhì)變性，離心除去變質(zhì)變性，離心除去變性蛋白質(zhì)性蛋白質(zhì)DNA的定量測(cè)定的定量測(cè)定lDNA粗品用粗品用5mmol/LNaOH溶解并定容至溶解并定容至50ml，作為待測(cè)品。，作為待測(cè)品。l 混勻，混勻，60水浴保溫水浴保溫45min，冷卻后，冷卻后，595nm處，比色。處，比色。l以吸光度以吸光度A595nm對(duì)對(duì)DNA含量（含量（ug）作圖，）作圖， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。l從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的DNA含量。含量。l計(jì)算計(jì)算100g豬肝中豬肝中DNA的含量：的含量： 待測(cè)樣品中待測(cè)樣品中DNA的質(zhì)量的質(zhì)量25(稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)) 稱取豬肝的質(zhì)量稱取豬肝的質(zhì)量=l 勻漿（破碎細(xì)胞）要充分，需剪成小塊。勻漿（破碎細(xì)胞）要充分，需剪成小塊。l固體固體NaCl應(yīng)磨碎，加入應(yīng)分批緩慢加入，邊加邊搖，應(yīng)磨碎，加入應(yīng)分批緩慢加入，邊加邊搖，避免局部濃度過(guò)大或者未及溶解而沉入氯仿層