5動(dòng)物細(xì)胞制藥

1、第五章第五章 動(dòng)物細(xì)胞工程制藥動(dòng)物細(xì)胞工程制藥 了解動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)及生理特點(diǎn)，了解動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)及生理特點(diǎn)，熟悉生產(chǎn)常用的幾種動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)和熟悉生產(chǎn)常用的幾種動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)和培養(yǎng)條件及大規(guī)模培養(yǎng)方法，熟悉動(dòng)物培養(yǎng)條件及大規(guī)模培養(yǎng)方法，熟悉動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器類型及其操作原理，掌細(xì)胞生物反應(yīng)器類型及其操作原理，掌握組織工程概念。握組織工程概念。 細(xì)胞是生物體的基本結(jié)構(gòu)單位和功細(xì)胞是生物體的基本結(jié)構(gòu)單位和功能單位，單細(xì)胞生物，一個(gè)細(xì)胞就是一能單位，單細(xì)胞生物，一個(gè)細(xì)胞就是一個(gè)個(gè)體，而多細(xì)胞生物則由許多細(xì)胞組個(gè)個(gè)體，而多細(xì)胞生物則由許多細(xì)胞組成一個(gè)個(gè)體。我們所看到的生物體都是成一個(gè)個(gè)體。我們所看到的

2、生物體都是由多細(xì)胞所組成。在多細(xì)胞生物體中，由多細(xì)胞所組成。在多細(xì)胞生物體中，由形態(tài)結(jié)構(gòu)相似的細(xì)胞再組成組織，執(zhí)由形態(tài)結(jié)構(gòu)相似的細(xì)胞再組成組織，執(zhí)行著生物體中的部分功能。行著生物體中的部分功能。 細(xì)胞工程（細(xì)胞工程（cell engineering） 應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法，借助應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法，借助工程學(xué)的試驗(yàn)方法或技術(shù)，在細(xì)胞水平上研究工程學(xué)的試驗(yàn)方法或技術(shù)，在細(xì)胞水平上研究改造生物遺傳特性和生物學(xué)特性，以獲得特定改造生物遺傳特性和生物學(xué)特性，以獲得特定的細(xì)胞、細(xì)胞產(chǎn)品或新生物體的有關(guān)理論和技的細(xì)胞、細(xì)胞產(chǎn)品或新生物體的有關(guān)理論和技術(shù)方法的學(xué)科。術(shù)方法的學(xué)科。 廣義的

3、細(xì)胞工程包括所有的生物組織、器廣義的細(xì)胞工程包括所有的生物組織、器官及細(xì)胞離體操作和培養(yǎng)技術(shù)，狹義的細(xì)胞工官及細(xì)胞離體操作和培養(yǎng)技術(shù)，狹義的細(xì)胞工程則是指細(xì)胞融合和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。程則是指細(xì)胞融合和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。 根據(jù)研究對(duì)象不同，細(xì)胞工程可分為動(dòng)物根據(jù)研究對(duì)象不同，細(xì)胞工程可分為動(dòng)物細(xì)胞工程和植物細(xì)胞工程。細(xì)胞工程和植物細(xì)胞工程。動(dòng)物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程單克隆抗體單克隆抗體細(xì)胞融合細(xì)胞融合細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)胚胎移植胚胎移植核核 移移 植植 動(dòng)動(dòng) 物物 細(xì)細(xì) 胞胞 培培 養(yǎng)養(yǎng)胚胎或幼齡動(dòng)物的組織器官（細(xì)胞來源）胚胎或幼齡動(dòng)物的組織器官（細(xì)胞來源）剪碎、胰蛋白酶剪碎、胰蛋白酶分離細(xì)胞分離細(xì)胞單單 個(gè)

4、個(gè) 細(xì)細(xì) 胞胞洗滌、稀釋、分離洗滌、稀釋、分離原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)原原 代代 細(xì)細(xì) 胞胞細(xì)細(xì) 胞胞 株株傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)遺傳物質(zhì)沒有發(fā)生改變遺傳物質(zhì)沒有發(fā)生改變細(xì)細(xì) 胞胞 系系遺傳物質(zhì)發(fā)生改變遺傳物質(zhì)發(fā)生改變應(yīng)用1 1、生產(chǎn)有價(jià)值的蛋白質(zhì)制品，（如病、生產(chǎn)有價(jià)值的蛋白質(zhì)制品，（如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體、動(dòng)毒疫苗、干擾素、單克隆抗體、動(dòng)物激素物激素）2 2、檢測(cè)有毒物質(zhì)、檢測(cè)有毒物質(zhì)3 3、用于某些器官移植、用于某些器官移植細(xì)胞分化細(xì)胞分化 多細(xì)胞生物體是由各種各樣形態(tài)和功能多細(xì)胞生物體是由各種各樣形態(tài)和功能都不同的細(xì)胞群所組成。高等動(dòng)、植物由受都不同的細(xì)胞群所組成。高等動(dòng)、植物由受精卵細(xì)胞開

5、始的胚胎發(fā)生過程隨著細(xì)胞分裂精卵細(xì)胞開始的胚胎發(fā)生過程隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加而使得早期胚胎的細(xì)胞數(shù)量也增次數(shù)的增加而使得早期胚胎的細(xì)胞數(shù)量也增加許多。其中有些細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能加許多。其中有些細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上逐漸發(fā)生了差異，這種細(xì)胞之間差異的發(fā)上逐漸發(fā)生了差異，這種細(xì)胞之間差異的發(fā)生過程就是細(xì)胞分化。個(gè)體發(fā)育的過程就是生過程就是細(xì)胞分化。個(gè)體發(fā)育的過程就是細(xì)胞分化的過程，個(gè)體的各種器官和組織都細(xì)胞分化的過程，個(gè)體的各種器官和組織都是通過細(xì)胞分化形成的。是通過細(xì)胞分化形成的。 離體細(xì)胞的形態(tài)離體細(xì)胞的形態(tài)貼壁細(xì)胞：貼壁細(xì)胞：來自動(dòng)物實(shí)體組織的大多數(shù)細(xì)胞需要來自動(dòng)物實(shí)體組織的大多數(shù)細(xì)胞

6、需要貼壁單層生長(zhǎng)。貼壁單層生長(zhǎng)。一般成纖維樣或上皮樣細(xì)胞型。一般成纖維樣或上皮樣細(xì)胞型。懸浮細(xì)胞：懸浮細(xì)胞：細(xì)胞無(wú)需貼附到固體介質(zhì)上就能生存細(xì)胞無(wú)需貼附到固體介質(zhì)上就能生存和生長(zhǎng)的細(xì)胞。來自血液、淋巴系統(tǒng)的細(xì)胞和大和生長(zhǎng)的細(xì)胞。來自血液、淋巴系統(tǒng)的細(xì)胞和大多數(shù)腫瘤細(xì)胞常為非貼壁依賴性的，它們多數(shù)腫瘤細(xì)胞常為非貼壁依賴性的，它們形態(tài)呈形態(tài)呈圓形。圓形。兼性兼性貼壁細(xì)胞：貼壁細(xì)胞：不嚴(yán)格依賴支持物。不嚴(yán)格依賴支持物。 動(dòng)物細(xì)胞的化學(xué)組成動(dòng)物細(xì)胞的化學(xué)組成 水分水分85%，無(wú)機(jī)鹽，無(wú)機(jī)鹽1-1. 5%，蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)7-10%，脂，脂質(zhì)質(zhì)1-2%，其他有機(jī)物，其他有機(jī)物1.5%。 動(dòng)物細(xì)胞的代謝動(dòng)物

7、細(xì)胞的代謝 糖、脂肪、蛋白質(zhì)的降解代謝分三階段：第一階糖、脂肪、蛋白質(zhì)的降解代謝分三階段：第一階段是大分子降解為小分子；第二階段是小分子代謝段是大分子降解為小分子；第二階段是小分子代謝產(chǎn)生乙酰輔酶產(chǎn)生乙酰輔酶a、- -酮戊二酸和草酰乙酸；酮戊二酸和草酰乙酸；第三階第三階段是三羧酸循環(huán)。段是三羧酸循環(huán)。 動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)1、動(dòng)物細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng)、動(dòng)物細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng)(12-48hr)各類細(xì)胞分裂周期時(shí)間表各類細(xì)胞分裂周期時(shí)間表2、細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附于基質(zhì)，并有接、細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象觸抑制現(xiàn)象3、正常二倍體細(xì)胞的壽命有限、正常二倍體細(xì)胞的壽命有限4、動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周

8、圍環(huán)境敏感、動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境敏感5、動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基要求高、動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基要求高6、動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成途徑和修、動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同飾功能與細(xì)菌不同動(dòng)物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的總體差異動(dòng)物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的總體差異內(nèi)容內(nèi)容微生物細(xì)胞微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞壁細(xì)胞壁普遍存在普遍存在不存在不存在生長(zhǎng)速率生長(zhǎng)速率0.10.5h-10.010.05h-1需氧量需氧量高高低低營(yíng)養(yǎng)要求營(yíng)養(yǎng)要求普遍簡(jiǎn)單普遍簡(jiǎn)單復(fù)雜復(fù)雜co2需求需求一些微生物需一些微生物需co2許多需要許多需要co2形成緩沖液形成緩沖液環(huán)境影響環(huán)境影響小小大大大小范圍大小范圍1002000nm100001000

9、00nm接種濃度接種濃度低低高（高（105.ml-1）生長(zhǎng)濃度生長(zhǎng)濃度高（高（1091010.ml-1）低（低（106.ml-1）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特性動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特性 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是指在合適的培動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是指在合適的培養(yǎng)條件下，動(dòng)物細(xì)胞離體生長(zhǎng)和增養(yǎng)條件下，動(dòng)物細(xì)胞離體生長(zhǎng)和增殖，并保持其特性和功能的技術(shù)，殖，并保持其特性和功能的技術(shù)，這些細(xì)胞不再形成組織。這些細(xì)胞不再形成組織。l細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素l細(xì)胞大，無(wú)細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，環(huán)境適細(xì)胞大，無(wú)細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，環(huán)境適應(yīng)性差應(yīng)性差l需氧少，不耐受強(qiáng)力通風(fēng)與攪拌需氧少，不耐受強(qiáng)力通風(fēng)與攪

10、拌l群體生長(zhǎng)效應(yīng)，貼壁生長(zhǎng)（錨地依賴性）群體生長(zhǎng)效應(yīng)，貼壁生長(zhǎng)（錨地依賴性）l培養(yǎng)過程產(chǎn)品分布細(xì)胞內(nèi)外，成本高培養(yǎng)過程產(chǎn)品分布細(xì)胞內(nèi)外，成本高l 原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡代即退化死亡 細(xì)胞生長(zhǎng)的類型細(xì)胞生長(zhǎng)的類型 貼壁依賴性貼壁依賴性 來自動(dòng)物實(shí)體組織的大多數(shù)細(xì)胞來自動(dòng)物實(shí)體組織的大多數(shù)細(xì)胞需要貼壁單層生長(zhǎng)。只要它們沒有轉(zhuǎn)化為非貼需要貼壁單層生長(zhǎng)。只要它們沒有轉(zhuǎn)化為非貼壁依賴性的必須貼伏在合適的固體介質(zhì)上并鋪壁依賴性的必須貼伏在合適的固體介質(zhì)上并鋪展，才能生長(zhǎng)。展，才能生長(zhǎng)。 非貼壁依賴性非貼壁依賴性 細(xì)胞無(wú)需貼附到固體介質(zhì)上就細(xì)胞無(wú)需貼附到固體介質(zhì)上就能生存和

11、生長(zhǎng)的細(xì)胞。來自血液、淋巴系統(tǒng)的能生存和生長(zhǎng)的細(xì)胞。來自血液、淋巴系統(tǒng)的細(xì)胞和大多數(shù)腫瘤細(xì)胞常為非貼壁依賴性的，細(xì)胞和大多數(shù)腫瘤細(xì)胞常為非貼壁依賴性的，它們形態(tài)呈圓形。它們形態(tài)呈圓形。生長(zhǎng)特性生長(zhǎng)特性 貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)要貼附于貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細(xì)胞一經(jīng)貼壁就培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。一般數(shù)天后就鋪滿培進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細(xì)胞單層。養(yǎng)表面，并形成致密的細(xì)胞單層。 貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)容易更換培養(yǎng)液；細(xì)胞緊密黏附于固相表面，可容

12、易更換培養(yǎng)液；細(xì)胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。容易采用灌注培養(yǎng)，從而達(dá)到提高細(xì)胞密度的目容易采用灌注培養(yǎng)，從而達(dá)到提高細(xì)胞密度的目的；因細(xì)胞固定表面，不需過濾系統(tǒng)。的；因細(xì)胞固定表面，不需過濾系統(tǒng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁于生長(zhǎng)基質(zhì)時(shí)，很多細(xì)胞將更有效的當(dāng)細(xì)胞貼壁于生長(zhǎng)基質(zhì)時(shí)，很多細(xì)胞將更有效的表達(dá)一種產(chǎn)品。表達(dá)一種產(chǎn)品。同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液/細(xì)胞的比例。細(xì)胞的比例。適用于所有類型細(xì)胞。適用于所有類型細(xì)胞。 貼壁培養(yǎng)的缺點(diǎn)貼壁培養(yǎng)的缺點(diǎn)與懸浮培養(yǎng)法相比與懸浮培養(yǎng)法相比擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難，投資大；擴(kuò)大培

13、養(yǎng)比較困難，投資大； 占地面積大；占地面積大； 不能有效監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)。不能有效監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)。 細(xì)胞培養(yǎng)物的獲得細(xì)胞培養(yǎng)物的獲得原代培養(yǎng)物原代培養(yǎng)物 在無(wú)菌條件下，用鑷子和剪刀將切下的組織在無(wú)菌條件下，用鑷子和剪刀將切下的組織剪剪碎成小塊，再用胰蛋白酶等蛋白水解酶處理，碎成小塊，再用胰蛋白酶等蛋白水解酶處理，使組織解離成單個(gè)細(xì)胞，放入培養(yǎng)容器中無(wú)菌培使組織解離成單個(gè)細(xì)胞，放入培養(yǎng)容器中無(wú)菌培養(yǎng)。這種原代培養(yǎng)物中含有各種不同分化的細(xì)胞養(yǎng)。這種原代培養(yǎng)物中含有各種不同分化的細(xì)胞類型，它們的生長(zhǎng)速率不同，成纖維細(xì)胞最易生類型，它們的生長(zhǎng)速率不同，成纖維細(xì)胞最易生長(zhǎng)，常會(huì)在此后的傳代培養(yǎng)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)。

14、仔細(xì)控長(zhǎng)，常會(huì)在此后的傳代培養(yǎng)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)。仔細(xì)控制培養(yǎng)基的成分，可以選擇性地支持某些細(xì)胞類制培養(yǎng)基的成分，可以選擇性地支持某些細(xì)胞類型的生長(zhǎng)。型的生長(zhǎng)。 兩個(gè)專業(yè)術(shù)語(yǔ)兩個(gè)專業(yè)術(shù)語(yǔ) 細(xì)胞系：細(xì)胞系：首次分離組織的培養(yǎng)稱之首次分離組織的培養(yǎng)稱之為原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)物經(jīng)傳代成功為原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)物經(jīng)傳代成功后即成細(xì)胞系。后即成細(xì)胞系。 細(xì)胞株：細(xì)胞株：通過選擇法或克隆形成法通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)記的培養(yǎng)物稱為細(xì)胞株。特殊性質(zhì)或標(biāo)記的培養(yǎng)物稱為細(xì)胞株。轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞 正常細(xì)胞經(jīng)過某個(gè)轉(zhuǎn)化過程，喪失了對(duì)生長(zhǎng)正常細(xì)胞經(jīng)過某個(gè)轉(zhuǎn)

15、化過程，喪失了對(duì)生長(zhǎng)控制的敏感性。轉(zhuǎn)化伴隨著染色體模式的改變，控制的敏感性。轉(zhuǎn)化伴隨著染色體模式的改變，二倍體變成異倍體。更典型的表現(xiàn)是，貼壁依賴二倍體變成異倍體。更典型的表現(xiàn)是，貼壁依賴性細(xì)胞對(duì)貼壁的依賴及細(xì)胞密度的抑制發(fā)生改變，性細(xì)胞對(duì)貼壁的依賴及細(xì)胞密度的抑制發(fā)生改變，雖然也許細(xì)胞仍需貼壁生長(zhǎng)，但可能生長(zhǎng)到不止雖然也許細(xì)胞仍需貼壁生長(zhǎng)，但可能生長(zhǎng)到不止單層。單層。 細(xì)胞轉(zhuǎn)化有四種主要途徑：細(xì)胞轉(zhuǎn)化有四種主要途徑：有些細(xì)胞在培有些細(xì)胞在培養(yǎng)中自發(fā)轉(zhuǎn)化。養(yǎng)中自發(fā)轉(zhuǎn)化?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化，某些化學(xué)致癌物會(huì)化學(xué)轉(zhuǎn)化，某些化學(xué)致癌物會(huì)增加轉(zhuǎn)化頻率。增加轉(zhuǎn)化頻率。病毒轉(zhuǎn)化。病毒轉(zhuǎn)化。致瘤因子轉(zhuǎn)化。致瘤因子轉(zhuǎn)化

16、。 轉(zhuǎn)化細(xì)胞由于有無(wú)限壽命，在培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞由于有無(wú)限壽命，在培養(yǎng)中更易生長(zhǎng)，被廣泛用于生產(chǎn)生物制品，中更易生長(zhǎng)，被廣泛用于生產(chǎn)生物制品，如重組蛋白藥物、病毒疫苗等。但是，如重組蛋白藥物、病毒疫苗等。但是，人們對(duì)它們的安全性仍然非常關(guān)心，對(duì)人們對(duì)它們的安全性仍然非常關(guān)心，對(duì)可能造成的生物危害性進(jìn)行嚴(yán)格的檢測(cè)可能造成的生物危害性進(jìn)行嚴(yán)格的檢測(cè)和控制。和控制。 腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞 腫瘤細(xì)胞是來自于腫瘤組織的細(xì)胞腫瘤細(xì)胞是來自于腫瘤組織的細(xì)胞或經(jīng)腫瘤細(xì)胞與其它細(xì)胞融合產(chǎn)生的細(xì)或經(jīng)腫瘤細(xì)胞與其它細(xì)胞融合產(chǎn)生的細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞。胞，如雜交瘤細(xì)胞。 與轉(zhuǎn)化細(xì)胞相比，它們是惡性的，與轉(zhuǎn)化細(xì)胞相比，它們是惡性的

17、，基本上是非貼壁依賴性的。腫瘤細(xì)胞有基本上是非貼壁依賴性的。腫瘤細(xì)胞有很好的增殖特性，生長(zhǎng)速率高。對(duì)生長(zhǎng)很好的增殖特性，生長(zhǎng)速率高。對(duì)生長(zhǎng)因子的依賴程度低，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的要求因子的依賴程度低，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的要求也不那么苛刻。也不那么苛刻。體外培養(yǎng)所需的一般條件體外培養(yǎng)所需的一般條件 適宜的培養(yǎng)皿、血清成分、適宜的培養(yǎng)皿、血清成分、370c 、co25、95100濕度濕度 、 抗生素。抗生素。 腫瘤細(xì)胞的致癌性是造成其難以用于體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的致癌性是造成其難以用于體內(nèi)治療產(chǎn)品生產(chǎn)的主要原因。由于近年來分離純治療產(chǎn)品生產(chǎn)的主要原因。由于近年來分離純化技術(shù)的進(jìn)步和對(duì)這些細(xì)胞致瘤性的深刻認(rèn)識(shí)，化技術(shù)的進(jìn)步和

18、對(duì)這些細(xì)胞致瘤性的深刻認(rèn)識(shí)，對(duì)其在生產(chǎn)中的應(yīng)用有所松動(dòng)，如雜交瘤細(xì)胞對(duì)其在生產(chǎn)中的應(yīng)用有所松動(dòng)，如雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體已用于體內(nèi)治療，生產(chǎn)的單克隆抗體已用于體內(nèi)治療，c127細(xì)胞細(xì)胞生成重組蛋白的研究也形成了規(guī)模。生成重組蛋白的研究也形成了規(guī)模。培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件培養(yǎng)基配制時(shí)考慮的因素培養(yǎng)基配制時(shí)考慮的因素ph 多數(shù)細(xì)胞系在多數(shù)細(xì)胞系在ph7.4下生長(zhǎng)得很好。一些下生長(zhǎng)得很好。一些正常的成纖維細(xì)胞系以正常的成纖維細(xì)胞系以7.47.7最好，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系最好，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系以以ph7.07.4更合適。更合適。緩沖緩沖 在高細(xì)胞密度下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系產(chǎn)生大量二在高細(xì)胞密度下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系產(chǎn)生

19、大量二氧化碳和乳酸，引起氧化碳和乳酸，引起ph下降，需要在培養(yǎng)基中加下降，需要在培養(yǎng)基中加入緩沖作用的試劑，如碳酸氫鈉、入緩沖作用的試劑，如碳酸氫鈉、hepes(n-2-羥羥乙基哌嗪乙基哌嗪-n-2-乙磺酸乙磺酸) )。溫度溫度 低溫下低溫下co2溶解度增加，引起溶解度增加，引起ph變化。變化。黏度黏度 培養(yǎng)基的黏度主要受血清含量的培養(yǎng)基的黏度主要受血清含量的影響。在攪拌條件下黏度大則細(xì)胞受損影響。在攪拌條件下黏度大則細(xì)胞受損傷小。加入羧甲基纖維素或聚乙烯基吡傷小。加入羧甲基纖維素或聚乙烯基吡咯烷增加培養(yǎng)基黏度咯烷增加培養(yǎng)基黏度細(xì)胞培養(yǎng)基的基本組成細(xì)胞培養(yǎng)基的基本組成（1）水）水 細(xì)胞培養(yǎng)用的

20、各種液體都要用水來配細(xì)胞培養(yǎng)用的各種液體都要用水來配置，對(duì)水的純度要求很高。通常細(xì)胞培養(yǎng)置，對(duì)水的純度要求很高。通常細(xì)胞培養(yǎng)用水的污染物標(biāo)準(zhǔn)可參考醫(yī)藥上注射用水用水的污染物標(biāo)準(zhǔn)可參考醫(yī)藥上注射用水標(biāo)準(zhǔn)，但原則上應(yīng)高于注射用水標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)，但原則上應(yīng)高于注射用水標(biāo)準(zhǔn)。（2）能源和碳源）能源和碳源 主要是糖和糖酵解的產(chǎn)物和谷氨酰胺。主要是糖和糖酵解的產(chǎn)物和谷氨酰胺。細(xì)胞能用的糖主要是六碳糖，特別是葡萄細(xì)胞能用的糖主要是六碳糖，特別是葡萄糖。葡萄糖很容易被大多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為乳糖。葡萄糖很容易被大多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為乳酸。昆蟲細(xì)胞更偏愛蔗糖。在多數(shù)培養(yǎng)基酸。昆蟲細(xì)胞更偏愛蔗糖。在多數(shù)培養(yǎng)基中谷氨酰胺作為主要的能

21、源和碳源。使用中谷氨酰胺作為主要的能源和碳源。使用谷氨酰胺最大的問題是它的自發(fā)降解，降谷氨酰胺最大的問題是它的自發(fā)降解，降解量與時(shí)間、溫度、血清和磷酸濃度有關(guān)，解量與時(shí)間、溫度、血清和磷酸濃度有關(guān)，降解產(chǎn)物為氨，對(duì)細(xì)胞有毒性。降解產(chǎn)物為氨，對(duì)細(xì)胞有毒性。（3）氮源）氮源 氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，也是細(xì)胞氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，也是細(xì)胞合成復(fù)雜含氮化合物的前體，還作為必不可少的合成復(fù)雜含氮化合物的前體，還作為必不可少的能源物質(zhì)。不同種類的細(xì)胞對(duì)氨基酸的種類和濃能源物質(zhì)。不同種類的細(xì)胞對(duì)氨基酸的種類和濃度有不同的要求，但除了谷氨酰胺外，還有度有不同的要求，但除了谷氨酰胺外，還有12種種

22、氨基酸不能在細(xì)胞內(nèi)合成，必須依靠從培養(yǎng)基中氨基酸不能在細(xì)胞內(nèi)合成，必須依靠從培養(yǎng)基中攝取。幾乎所有培養(yǎng)基中都含有全部必須氨基酸，攝取。幾乎所有培養(yǎng)基中都含有全部必須氨基酸，根據(jù)需要補(bǔ)充適量非必需氨基酸。非必須氨基酸根據(jù)需要補(bǔ)充適量非必需氨基酸。非必須氨基酸含量低時(shí)常會(huì)增加必須氨基酸的消耗量。增加氨含量低時(shí)常會(huì)增加必須氨基酸的消耗量。增加氨基酸的濃度可以提高培養(yǎng)的細(xì)胞密度和產(chǎn)物產(chǎn)率?；岬臐舛瓤梢蕴岣吲囵B(yǎng)的細(xì)胞密度和產(chǎn)物產(chǎn)率。（4）維生素）維生素 維生素是維持細(xì)胞正常生理狀態(tài)的一種維生素是維持細(xì)胞正常生理狀態(tài)的一種重要生物活性化合物，在細(xì)胞中多形成酶的重要生物活性化合物，在細(xì)胞中多形成酶的輔基或

23、輔酶，對(duì)細(xì)胞的代謝過程有重要影響。輔基或輔酶，對(duì)細(xì)胞的代謝過程有重要影響。（5）無(wú)機(jī)離子）無(wú)機(jī)離子 無(wú)機(jī)離子分為兩組，一種是含量較高的，無(wú)機(jī)離子分為兩組，一種是含量較高的，包括維持膜電勢(shì)的（包括維持膜電勢(shì)的（na+，k+），維持滲透壓），維持滲透壓平衡（平衡（na+，cl），作為酶的輔因子），作為酶的輔因子（mg2+），促進(jìn)細(xì)胞貼附（），促進(jìn)細(xì)胞貼附（mg2+ca2+），起），起緩沖作用（緩沖作用（hpo42-，hco3-）；另一種勢(shì)微量）；另一種勢(shì)微量元素，如鐵、錳、鋅、鉬、硒、釩、銅。元素，如鐵、錳、鋅、鉬、硒、釩、銅。（6）脂類和磷脂前體）脂類和磷脂前體 在使用血清的細(xì)胞培養(yǎng)中，脂類來自

24、在使用血清的細(xì)胞培養(yǎng)中，脂類來自血清，在無(wú)血清培養(yǎng)中，有些細(xì)胞需要添血清，在無(wú)血清培養(yǎng)中，有些細(xì)胞需要添加脂類，如膽固醇、脂肪酸、磷脂。特別加脂類，如膽固醇、脂肪酸、磷脂。特別是缺陷型細(xì)胞，對(duì)某種脂類有很高的依賴是缺陷型細(xì)胞，對(duì)某種脂類有很高的依賴性。性。非營(yíng)養(yǎng)性物質(zhì)非營(yíng)養(yǎng)性物質(zhì)（1）抗生素）抗生素 細(xì)胞培養(yǎng)中，特別是原代細(xì)胞培養(yǎng)中，常使細(xì)胞培養(yǎng)中，特別是原代細(xì)胞培養(yǎng)中，常使用抗生素抑制微生物的污染。用抗生素抑制微生物的污染。（2）ph緩沖劑緩沖劑 最常用的緩沖劑是碳酸氫鈉，常用濃度最常用的緩沖劑是碳酸氫鈉，常用濃度26mmol/l，接近血中濃度，必須與，接近血中濃度，必須與510co2平衡，

25、否則培養(yǎng)基迅速變堿。平衡，否則培養(yǎng)基迅速變堿。hepes是緩沖是緩沖能力很強(qiáng)的化合物，但由于它相當(dāng)昂貴，細(xì)胞大能力很強(qiáng)的化合物，但由于它相當(dāng)昂貴，細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中很少使用。規(guī)模培養(yǎng)中很少使用。（3）酚紅）酚紅 酚紅普遍作為培養(yǎng)基的酚紅普遍作為培養(yǎng)基的ph指示劑指示劑（4）保護(hù)劑）保護(hù)劑 細(xì)胞保護(hù)劑指保護(hù)細(xì)胞免受由滲透壓變細(xì)胞保護(hù)劑指保護(hù)細(xì)胞免受由滲透壓變化、剪切、毒性金屬和氧化劑所引起的損傷化、剪切、毒性金屬和氧化劑所引起的損傷的物質(zhì)。在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的細(xì)胞會(huì)受到的物質(zhì)。在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的細(xì)胞會(huì)受到機(jī)械攪拌和氣泡運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的剪切損傷，某機(jī)械攪拌和氣泡運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的剪切損傷，某些大分子化合物，

26、如甲基纖維素、葡聚糖、些大分子化合物，如甲基纖維素、葡聚糖、peg、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、pluronic f68、血、血清白蛋白，能夠減輕這種損傷。清白蛋白，能夠減輕這種損傷。（5）還原劑）還原劑 某些還原劑在細(xì)胞培養(yǎng)中有特殊作用。某些還原劑在細(xì)胞培養(yǎng)中有特殊作用。巰基乙醇在雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)中能刺激抗巰基乙醇在雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)中能刺激抗體分泌，并促進(jìn)半胱氨酸利用。體分泌，并促進(jìn)半胱氨酸利用。（6）血清）血清 常用的血清是小牛血清、胎牛血清、馬常用的血清是小牛血清、胎牛血清、馬血清和人血清。最常用的是小牛血清。血清和人血清。最常用的是小牛血清。 血清是極其復(fù)雜的混合物，含有食物物血清是極

27、其復(fù)雜的混合物，含有食物物質(zhì)、代謝物、激素、血漿蛋白、破碎細(xì)胞釋質(zhì)、代謝物、激素、血漿蛋白、破碎細(xì)胞釋放物質(zhì)、采血中引入的污染物。由于歷史原放物質(zhì)、采血中引入的污染物。由于歷史原因，商業(yè)培養(yǎng)基大都是按添加血清來設(shè)計(jì)的，因，商業(yè)培養(yǎng)基大都是按添加血清來設(shè)計(jì)的，使用血清技術(shù)也很成熟，盡管使用血清有許使用血清技術(shù)也很成熟，盡管使用血清有許多缺點(diǎn)，仍將其作為細(xì)胞培養(yǎng)最重要的添加多缺點(diǎn)，仍將其作為細(xì)胞培養(yǎng)最重要的添加劑普遍采用。劑普遍采用。培養(yǎng)物的污染及防止培養(yǎng)物的污染及防止1、污染途徑、污染途徑 （1） 空氣：空氣流動(dòng)性大，如果培養(yǎng)操空氣：空氣流動(dòng)性大，如果培養(yǎng)操作場(chǎng)地于外界隔離不嚴(yán)格或消毒不充分，作

28、場(chǎng)地于外界隔離不嚴(yán)格或消毒不充分，外界不潔空氣很容易進(jìn)入造成污染。因此，外界不潔空氣很容易進(jìn)入造成污染。因此，培養(yǎng)設(shè)施不能設(shè)在通風(fēng)場(chǎng)所。無(wú)菌操作應(yīng)培養(yǎng)設(shè)施不能設(shè)在通風(fēng)場(chǎng)所。無(wú)菌操作應(yīng)在凈化臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，工作時(shí)要帶口罩在凈化臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，工作時(shí)要帶口罩2、 器材：各種培養(yǎng)器皿器材：各種培養(yǎng)器皿3、 操作：實(shí)驗(yàn)操作無(wú)菌觀念不強(qiáng)，技術(shù)不熟操作：實(shí)驗(yàn)操作無(wú)菌觀念不強(qiáng)，技術(shù)不熟練，使用污染的器皿或封瓶不嚴(yán)等，都可以造練，使用污染的器皿或封瓶不嚴(yán)等，都可以造成污染。成污染。4、 血清：有些血清在生產(chǎn)時(shí)就已經(jīng)被支原體血清：有些血清在生產(chǎn)時(shí)就已經(jīng)被支原體或病毒等污染，變成了污染?；虿《镜任廴?，變成了污染。5、 組織樣

29、本：原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組組織樣本：原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣本；取材時(shí)碘酒消毒后脫碘不徹底，可造織樣本；取材時(shí)碘酒消毒后脫碘不徹底，可造成碘混入組織，細(xì)胞或培養(yǎng)液中，影響細(xì)胞細(xì)成碘混入組織，細(xì)胞或培養(yǎng)液中，影響細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)。胞生長(zhǎng)。動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)（一）培養(yǎng)環(huán)境（一）培養(yǎng)環(huán)境1、溫度、溫度 溫度是細(xì)胞在體外生存的基溫度是細(xì)胞在體外生存的基本條件之一，來源不同的動(dòng)物細(xì)胞，其本條件之一，來源不同的動(dòng)物細(xì)胞，其最適的生長(zhǎng)溫度不同。例如昆蟲細(xì)胞的最適的生長(zhǎng)溫度不同。例如昆蟲細(xì)胞的 最適溫度是最適溫度是25280c，人和哺乳動(dòng)物細(xì)，人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的最適溫度是胞的最適溫

30、度是370c，細(xì)胞代謝強(qiáng)度與，細(xì)胞代謝強(qiáng)度與溫度成正比，超出最適溫度范圍，細(xì)胞溫度成正比，超出最適溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝和生長(zhǎng)將會(huì)受到影響，甚至的正常代謝和生長(zhǎng)將會(huì)受到影響，甚至導(dǎo)致死亡。導(dǎo)致死亡。2、ph 大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)影響培養(yǎng)液的大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)影響培養(yǎng)液的ph穩(wěn)定性的主要穩(wěn)定性的主要因素有三種：（因素有三種：（1）緩沖液的緩沖能力及種類；）緩沖液的緩沖能力及種類；（2）對(duì)流空間大小；（）對(duì)流空間大?。唬?）葡萄糖濃度。）葡萄糖濃度。 培養(yǎng)液中正常的緩沖系統(tǒng)是培養(yǎng)液中正常的緩沖系統(tǒng)是nahco3/co2系系統(tǒng)，它是一種弱緩沖系統(tǒng)，其統(tǒng)，它是一種弱緩沖系統(tǒng)，其pk為為6.1，低于生理，低于生理學(xué)

31、最佳要求。這種緩沖系統(tǒng)要求在培養(yǎng)液上面的學(xué)最佳要求。這種緩沖系統(tǒng)要求在培養(yǎng)液上面的對(duì)流空間加入對(duì)流空間加入co2以防止它的丟失及增加羥基離以防止它的丟失及增加羥基離子。子。 也可使用磷酸緩沖液，但磷酸對(duì)動(dòng)物細(xì)胞也可使用磷酸緩沖液，但磷酸對(duì)動(dòng)物細(xì)胞有毒害作用。有毒害作用。hepes生物緩沖劑也曾被加入生物緩沖劑也曾被加入nahco3/co2緩沖系統(tǒng)中，這是由于緩沖系統(tǒng)中，這是由于hepes的的pk為為7.0，hepes被加入后，其緩沖能力為被加入后，其緩沖能力為ph6.87.2。但是當(dāng)。但是當(dāng)hepes濃度高于濃度高于25mm時(shí)，它對(duì)大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞都有毒害作用。時(shí)，它對(duì)大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞都有毒害作用

32、。 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)常有幾種方法來動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)常有幾種方法來調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中的調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中的ph：（1）在培養(yǎng)基中添加）在培養(yǎng)基中添加nahco3作為緩沖劑及作為緩沖劑及通入含通入含co2的空氣進(jìn)行調(diào)節(jié)的空氣進(jìn)行調(diào)節(jié)（2）用）用0.1mol/lnaon或或0.1mol/l hcl進(jìn)進(jìn)行調(diào)節(jié)。由于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)要求低攪拌和行調(diào)節(jié)。由于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)要求低攪拌和弱混合，利用弱混合，利用naoh或或hcl進(jìn)行調(diào)節(jié)時(shí)會(huì)發(fā)進(jìn)行調(diào)節(jié)時(shí)會(huì)發(fā)生局部過酸或過堿的現(xiàn)象，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生生局部過酸或過堿的現(xiàn)象，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，因此這種調(diào)節(jié)方法在動(dòng)物細(xì)胞培毒性作用，因此這種調(diào)節(jié)方法在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)不太合

33、適。養(yǎng)時(shí)不太合適。通常通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中通常通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中nahco3用量及通氣中用量及通氣中co2濃度來控制發(fā)酵濃度來控制發(fā)酵過程的過程的ph。3、溶解氧、溶解氧 大規(guī)模培養(yǎng)中如何提供足夠的氧是大規(guī)模培養(yǎng)中如何提供足夠的氧是非常重要的。通氣的目的有兩個(gè)：一是非常重要的。通氣的目的有兩個(gè)：一是提供細(xì)胞代謝所需的足夠的氧；二是使提供細(xì)胞代謝所需的足夠的氧；二是使發(fā)酵液處于均勻懸浮狀態(tài)，有利于傳質(zhì)發(fā)酵液處于均勻懸浮狀態(tài)，有利于傳質(zhì)過程。過程。（二）培養(yǎng)容器（二）培養(yǎng)容器1、多孔板、多孔板、petri培養(yǎng)皿和組織培養(yǎng)方瓶培養(yǎng)皿和組織培養(yǎng)方瓶都是常都是常用的靜止培養(yǎng)容器，體積小，操作方便，很容易用的靜

34、止培養(yǎng)容器，體積小，操作方便，很容易放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2、滾瓶、滾瓶 也是一種重要的培養(yǎng)容器，培養(yǎng)時(shí)放在也是一種重要的培養(yǎng)容器，培養(yǎng)時(shí)放在滾瓶機(jī)上緩慢滾動(dòng)，但培養(yǎng)條件很接近于靜止培滾瓶機(jī)上緩慢滾動(dòng)，但培養(yǎng)條件很接近于靜止培養(yǎng)。它體積較大，接種后放入溫室或?qū)ｉT的培養(yǎng)養(yǎng)。它體積較大，接種后放入溫室或?qū)ｉT的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)依賴性貼壁培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需加入箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)依賴性貼壁培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需加入微載體以增加培養(yǎng)表面積。微載體以增加培養(yǎng)表面積。3、生物反應(yīng)器、生物反應(yīng)器是大規(guī)模培養(yǎng)中最重要的培養(yǎng)設(shè)是大規(guī)模培養(yǎng)中最重要的培養(yǎng)設(shè)備。它有各種不同形式，容積可以從備。它有各種不同形式，容積可以

35、從1升到幾十升到幾十立方米。立方米。微載體微載體 微載體是指直徑在微載體是指直徑在60250m、適合于動(dòng)物、適合于動(dòng)物細(xì)胞貼附和生長(zhǎng)的微珠。微載體法培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞有細(xì)胞貼附和生長(zhǎng)的微珠。微載體法培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞有很多好處：很多好處：可在反應(yīng)器中提供大的比表面積可在反應(yīng)器中提供大的比表面積可可采用均勻懸浮培養(yǎng)，簡(jiǎn)化了各種環(huán)境因素的檢測(cè)和采用均勻懸浮培養(yǎng)，簡(jiǎn)化了各種環(huán)境因素的檢測(cè)和控制，提高了培養(yǎng)系統(tǒng)的重演性控制，提高了培養(yǎng)系統(tǒng)的重演性可用普通顯微鏡可用普通顯微鏡觀察細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)情況觀察細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)情況容易放大容易放大適合適合于多種貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)于多種貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)容易收獲細(xì)胞。

36、容易收獲細(xì)胞。 微載體培養(yǎng)系統(tǒng)的缺點(diǎn)是：微載體培養(yǎng)系統(tǒng)的缺點(diǎn)是：細(xì)胞生長(zhǎng)在微載細(xì)胞生長(zhǎng)在微載體表面，易受到剪切損傷，不適合貼壁不牢的細(xì)胞體表面，易受到剪切損傷，不適合貼壁不牢的細(xì)胞生長(zhǎng)生長(zhǎng)微載體價(jià)格較貴，一般不能重復(fù)使用微載體價(jià)格較貴，一般不能重復(fù)使用需要需要較高的細(xì)胞接種量。較高的細(xì)胞接種量。懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng)指細(xì)胞在培養(yǎng)容器中自由懸浮生長(zhǎng)的懸浮培養(yǎng)指細(xì)胞在培養(yǎng)容器中自由懸浮生長(zhǎng)的過程，主要用于非貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)，如雜交過程，主要用于非貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)，如雜交瘤細(xì)胞等。瘤細(xì)胞等。 動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)與微生物過程比較接近，但動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)與微生物過程比較接近，但由于動(dòng)物細(xì)胞對(duì)攪

37、拌和通氣造成的流體剪切很敏感，由于動(dòng)物細(xì)胞對(duì)攪拌和通氣造成的流體剪切很敏感，在反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和操作上又有特殊要求，如利用螺在反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和操作上又有特殊要求，如利用螺旋帶葉輪減小生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程中的剪切作用，旋帶葉輪減小生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程中的剪切作用，并通過表面充氣及誘導(dǎo)表面氣泡產(chǎn)生具有雙層濾網(wǎng)并通過表面充氣及誘導(dǎo)表面氣泡產(chǎn)生具有雙層濾網(wǎng)的新型攪拌器，它提高了氧傳遞速率。的新型攪拌器，它提高了氧傳遞速率。 目前，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器目前，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器主要包括：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器、塑料袋增殖器、主要包括：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器、塑料袋增殖器、填充床反應(yīng)器、多層板反應(yīng)器、螺旋膜填充床反應(yīng)器、多層板反應(yīng)

38、器、螺旋膜反應(yīng)器、管式螺旋反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通反應(yīng)器、管式螺旋反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器、中空道蜂窩狀反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器、中空纖維及其它膜式反應(yīng)器、攪拌反應(yīng)器、纖維及其它膜式反應(yīng)器、攪拌反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器等。氣升式反應(yīng)器等。4、細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生物反應(yīng)器、細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生物反應(yīng)器氣升式生物反應(yīng)器氣升式生物反應(yīng)器 氣升式生物反應(yīng)器與其它反應(yīng)器相比，結(jié)構(gòu)氣升式生物反應(yīng)器與其它反應(yīng)器相比，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，無(wú)轉(zhuǎn)動(dòng)部件，細(xì)胞損傷率低，減少了污染簡(jiǎn)單，無(wú)轉(zhuǎn)動(dòng)部件，細(xì)胞損傷率低，減少了污染的機(jī)會(huì)；產(chǎn)生的湍流溫和而均勻，剪切力相當(dāng)?。坏臋C(jī)會(huì)；產(chǎn)生的湍流溫和而均勻，剪切力相當(dāng)??；直接通氣供氧，氧傳

39、遞速率高，供氧充分；液體直接通氣供氧，氧傳遞速率高，供氧充分；液體循環(huán)量大，細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)成分混合均勻。循環(huán)量大，細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)成分混合均勻。 存在問題：由于液體混合的能量唯一來自通存在問題：由于液體混合的能量唯一來自通入的氣體，因而通氣量大，泡沫多，而且氣泡破入的氣體，因而通氣量大，泡沫多，而且氣泡破碎造成嚴(yán)重的細(xì)胞機(jī)械損傷。碎造成嚴(yán)重的細(xì)胞機(jī)械損傷。通氣攪拌生物反應(yīng)器通氣攪拌生物反應(yīng)器 根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)，要根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)，要求攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)混合性能好，產(chǎn)生求攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)混合性能好，產(chǎn)生的剪切力小，氣泡產(chǎn)生的不利影響的剪切力小，氣泡產(chǎn)生的不利影響小。設(shè)計(jì)有多種形式的攪拌器，應(yīng)小。設(shè)計(jì)有多

40、種形式的攪拌器，應(yīng)用最多的是籠式攪拌器。用最多的是籠式攪拌器。 籠式攪拌器有兩個(gè)由籠式攪拌器有兩個(gè)由200目不銹鋼絲網(wǎng)圍目不銹鋼絲網(wǎng)圍成的籠式腔。下部是通氣腔，上部的是消泡腔，成的籠式腔。下部是通氣腔，上部的是消泡腔，之間有細(xì)管相通。氣體交換在通氣腔內(nèi)進(jìn)行，之間有細(xì)管相通。氣體交換在通氣腔內(nèi)進(jìn)行，其中的液體通過絲網(wǎng)與腔外的液體進(jìn)行交換。其中的液體通過絲網(wǎng)與腔外的液體進(jìn)行交換。在氣體鼓泡中形成的泡沫經(jīng)細(xì)管進(jìn)入消泡腔，在氣體鼓泡中形成的泡沫經(jīng)細(xì)管進(jìn)入消泡腔，經(jīng)絲網(wǎng)破碎分成氣液兩部分，既做到深層通氣，經(jīng)絲網(wǎng)破碎分成氣液兩部分，既做到深層通氣，又避免泡沫在反應(yīng)器中積累。又避免泡沫在反應(yīng)器中積累。 攪拌

41、器有三個(gè)導(dǎo)流筒，與攪拌器中心的垂攪拌器有三個(gè)導(dǎo)流筒，與攪拌器中心的垂直空腔相通，當(dāng)導(dǎo)流筒隨攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，由于直空腔相通，當(dāng)導(dǎo)流筒隨攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，由于離心力的作用，攪拌器中心的空腔產(chǎn)生負(fù)壓，離心力的作用，攪拌器中心的空腔產(chǎn)生負(fù)壓，使培養(yǎng)基從底部吸入，沿空腔螺旋式上升，再使培養(yǎng)基從底部吸入，沿空腔螺旋式上升，再?gòu)娜齻€(gè)導(dǎo)流筒排出，繞攪拌器外緣螺旋式下降。從三個(gè)導(dǎo)流筒排出，繞攪拌器外緣螺旋式下降。懸浮細(xì)胞或貼附有細(xì)胞的微載體的密度接近于懸浮細(xì)胞或貼附有細(xì)胞的微載體的密度接近于培養(yǎng)基，被培養(yǎng)基所裹脅，反復(fù)循環(huán)，充分混培養(yǎng)基，被培養(yǎng)基所裹脅，反復(fù)循環(huán)，充分混合。合。 在微載體法培養(yǎng)貼壁動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，一般攪在

42、微載體法培養(yǎng)貼壁動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，一般攪拌轉(zhuǎn)速在拌轉(zhuǎn)速在3060r/min范圍內(nèi)。范圍內(nèi)。中空纖維生物反應(yīng)器中空纖維生物反應(yīng)器 用途較廣，既可用于懸浮細(xì)用途較廣，既可用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。胞的培養(yǎng)，又可用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。 其原理是：模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的三維狀態(tài)，其原理是：模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的三維狀態(tài)，利用反應(yīng)器內(nèi)數(shù)千根中空纖維的縱向布置，提供細(xì)利用反應(yīng)器內(nèi)數(shù)千根中空纖維的縱向布置，提供細(xì)胞近似生理?xiàng)l件的體外生長(zhǎng)微環(huán)境，使細(xì)胞不斷生胞近似生理?xiàng)l件的體外生長(zhǎng)微環(huán)境，使細(xì)胞不斷生長(zhǎng)。中空纖維是一種細(xì)微的管狀結(jié)構(gòu)，管壁為極薄長(zhǎng)。中空纖維是一種細(xì)微的管狀結(jié)構(gòu)，管壁為極薄的半透膜，富含毛

43、細(xì)管，培養(yǎng)時(shí)纖維管內(nèi)灌流充以的半透膜，富含毛細(xì)管，培養(yǎng)時(shí)纖維管內(nèi)灌流充以氧氣的無(wú)血清培養(yǎng)液，管外壁則供細(xì)胞黏附生長(zhǎng)，氧氣的無(wú)血清培養(yǎng)液，管外壁則供細(xì)胞黏附生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過半透膜從管內(nèi)滲透出來供細(xì)胞生長(zhǎng)；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過半透膜從管內(nèi)滲透出來供細(xì)胞生長(zhǎng)；對(duì)于血清等大分子營(yíng)養(yǎng)物，劃必須從管外灌入，否對(duì)于血清等大分子營(yíng)養(yǎng)物，劃必須從管外灌入，否則會(huì)被半透膜阻隔不能被細(xì)胞利用；細(xì)胞的代謝廢則會(huì)被半透膜阻隔不能被細(xì)胞利用；細(xì)胞的代謝廢物也可通過半透膜滲入管內(nèi)，避免了過量代謝物對(duì)物也可通過半透膜滲入管內(nèi)，避免了過量代謝物對(duì)細(xì)胞的毒害作用。細(xì)胞的毒害作用。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)占地空間少；占地空間少； 細(xì)胞產(chǎn)量高，細(xì)胞密度可

44、達(dá)細(xì)胞產(chǎn)量高，細(xì)胞密度可達(dá)109數(shù)量級(jí)；數(shù)量級(jí)；生產(chǎn)成本低，且細(xì)胞培養(yǎng)維持時(shí)間長(zhǎng)，適生產(chǎn)成本低，且細(xì)胞培養(yǎng)維持時(shí)間長(zhǎng)，適用于長(zhǎng)期分泌的細(xì)胞。用于長(zhǎng)期分泌的細(xì)胞。5、細(xì)胞生物反應(yīng)器的控制系統(tǒng)、細(xì)胞生物反應(yīng)器的控制系統(tǒng) 由動(dòng)物細(xì)胞的特性所決定，細(xì)胞培養(yǎng)由動(dòng)物細(xì)胞的特性所決定，細(xì)胞培養(yǎng)不能沿用微生物發(fā)酵過程中常用的手段，不能沿用微生物發(fā)酵過程中常用的手段，安全而有效地方法是靠通入培養(yǎng)罐內(nèi)氣體安全而有效地方法是靠通入培養(yǎng)罐內(nèi)氣體中的氧氣和氮?dú)獾谋壤齺韺?shí)現(xiàn)控制溶氧值中的氧氣和氮?dú)獾谋壤齺韺?shí)現(xiàn)控制溶氧值的目的；的目的； 采用二氧化碳采用二氧化碳/碳酸氫鈉緩沖液系統(tǒng)來碳酸氫鈉緩沖液系統(tǒng)來控制培養(yǎng)液的控制培養(yǎng)

45、液的ph值，它主要是靠預(yù)先加入值，它主要是靠預(yù)先加入培養(yǎng)液中適量的碳酸氫鈉和通過改變氣體培養(yǎng)液中適量的碳酸氫鈉和通過改變氣體流量中的二氧化碳含量來實(shí)現(xiàn)。流量中的二氧化碳含量來實(shí)現(xiàn)。6、生物反應(yīng)器中的細(xì)胞培養(yǎng)模式、生物反應(yīng)器中的細(xì)胞培養(yǎng)模式分批培養(yǎng)分批培養(yǎng) 分批培養(yǎng)是指將細(xì)胞和培養(yǎng)基一次分批培養(yǎng)是指將細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)，進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不性裝入反應(yīng)器內(nèi)，進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不斷生長(zhǎng)，產(chǎn)物也不斷形成，經(jīng)過一定斷生長(zhǎng)，產(chǎn)物也不斷形成，經(jīng)過一定時(shí)間反應(yīng)后，將整個(gè)反應(yīng)系取出。時(shí)間反應(yīng)后，將整個(gè)反應(yīng)系取出。流加培養(yǎng)流加培養(yǎng) 流加培養(yǎng)是指先將一定量的培養(yǎng)液裝流加培養(yǎng)是指先將一定量的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，在適

46、宜條件下接種細(xì)胞，進(jìn)行入反應(yīng)器，在適宜條件下接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不斷生長(zhǎng)，產(chǎn)物也不斷形成。培養(yǎng)，細(xì)胞不斷生長(zhǎng)，產(chǎn)物也不斷形成。隨著細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，新的營(yíng)隨著細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，新的營(yíng)養(yǎng)成分不斷補(bǔ)充至反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞進(jìn)一養(yǎng)成分不斷補(bǔ)充至反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞進(jìn)一步生長(zhǎng)代謝。到反應(yīng)終止時(shí)，取出整個(gè)反步生長(zhǎng)代謝。到反應(yīng)終止時(shí)，取出整個(gè)反應(yīng)系。應(yīng)系。半連續(xù)培養(yǎng)半連續(xù)培養(yǎng) 半連續(xù)培養(yǎng)又稱為反復(fù)分批培養(yǎng)或換液半連續(xù)培養(yǎng)又稱為反復(fù)分批培養(yǎng)或換液培養(yǎng)，是指在分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上不全部取出培養(yǎng)，是指在分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上不全部取出反應(yīng)系，剩余部分重新補(bǔ)充新的營(yíng)養(yǎng)成分，反應(yīng)系，剩余部分重新補(bǔ)充新的營(yíng)養(yǎng)成分，

47、在按分批培養(yǎng)的方式進(jìn)操作。這是反應(yīng)器內(nèi)在按分批培養(yǎng)的方式進(jìn)操作。這是反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液體積保持不變的操作方式。培養(yǎng)液體積保持不變的操作方式。連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng)是指將細(xì)胞種子和培養(yǎng)液一起加連續(xù)培養(yǎng)是指將細(xì)胞種子和培養(yǎng)液一起加入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，一方面新鮮培養(yǎng)液不斷入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，一方面新鮮培養(yǎng)液不斷加入反應(yīng)器內(nèi)，另一方面又將反應(yīng)液連續(xù)不斷加入反應(yīng)器內(nèi)，另一方面又將反應(yīng)液連續(xù)不斷地取出，反應(yīng)條件處于一種恒定狀態(tài)。與分批地取出，反應(yīng)條件處于一種恒定狀態(tài)。與分批培養(yǎng)和半連續(xù)培養(yǎng)不同，連續(xù)培養(yǎng)可以控制細(xì)培養(yǎng)和半連續(xù)培養(yǎng)不同，連續(xù)培養(yǎng)可以控制細(xì)胞所處的環(huán)境條件長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定。因此，可以胞所處的環(huán)境條

48、件長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定。因此，可以使細(xì)胞維持在優(yōu)化狀態(tài)下，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)使細(xì)胞維持在優(yōu)化狀態(tài)下，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成。物形成。灌注培養(yǎng)灌注培養(yǎng) 灌注培養(yǎng)是指細(xì)胞接種后進(jìn)行培養(yǎng)，一方面灌注培養(yǎng)是指細(xì)胞接種后進(jìn)行培養(yǎng)，一方面新鮮培養(yǎng)基不斷加入反應(yīng)器，另一方面又將反應(yīng)新鮮培養(yǎng)基不斷加入反應(yīng)器，另一方面又將反應(yīng)液連續(xù)不斷地取出，但細(xì)胞留在反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)液連續(xù)不斷地取出，但細(xì)胞留在反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞處于一種不斷的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。胞處于一種不斷的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。 當(dāng)高密度培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)必需保持給細(xì)胞補(bǔ)當(dāng)高密度培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)必需保持給細(xì)胞補(bǔ)充足夠的營(yíng)養(yǎng)以及去除有毒的代謝廢物。通過調(diào)充足夠的營(yíng)養(yǎng)以及去除有毒的代謝廢物。通過調(diào)節(jié)

49、灌注速率可以把培養(yǎng)過程保持在穩(wěn)定的、廢物節(jié)灌注速率可以把培養(yǎng)過程保持在穩(wěn)定的、廢物代謝低于抑制水平的狀態(tài)下。一般在分批培養(yǎng)中代謝低于抑制水平的狀態(tài)下。一般在分批培養(yǎng)中細(xì)胞密度為（細(xì)胞密度為（2 4）106cell/ml，在灌注系統(tǒng)，在灌注系統(tǒng)中可達(dá)到（中可達(dá)到（25）107cell/ml。灌注培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)灌注培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)1 1、細(xì)胞所處環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)條件較好，有、細(xì)胞所處環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)條件較好，有害代謝廢物濃度低；害代謝廢物濃度低；2 2、明顯提高細(xì)胞密度，從而提高產(chǎn)物、明顯提高細(xì)胞密度，從而提高產(chǎn)物表達(dá)量；表達(dá)量；3 3、產(chǎn)物在反應(yīng)器中停留時(shí)間短，防止、產(chǎn)物在反應(yīng)器中停留時(shí)間短，防止變性損失；變性損失；4

50、4、培養(yǎng)基的比消耗率降低，生產(chǎn)成本、培養(yǎng)基的比消耗率降低，生產(chǎn)成本明顯降低。明顯降低。7、培養(yǎng)基研究進(jìn)展、培養(yǎng)基研究進(jìn)展無(wú)血清培養(yǎng)無(wú)血清培養(yǎng)基基 通常動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)均有賴于血清的存在，通常動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)均有賴于血清的存在，在普通培養(yǎng)基中，如不加血清，絕大部分細(xì)胞將在普通培養(yǎng)基中，如不加血清，絕大部分細(xì)胞將不能增殖。但使用血清的主要弊端是存在潛在的不能增殖。但使用血清的主要弊端是存在潛在的污染源、不同批號(hào)蛋白含量差異大及價(jià)格高等，污染源、不同批號(hào)蛋白含量差異大及價(jià)格高等，給生物制品的生產(chǎn)造成了不利。這就引發(fā)了人們給生物制品的生產(chǎn)造成了不利。這就引發(fā)了人們對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只要在培養(yǎng)

51、對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只要在培養(yǎng)基中增加某些適于細(xì)胞生長(zhǎng)的成分，如基中增加某些適于細(xì)胞生長(zhǎng)的成分，如纖連蛋白纖連蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和表皮生長(zhǎng)因子胰島素和表皮生長(zhǎng)因子等，不少細(xì)胞等，不少細(xì)胞即能在無(wú)血清供應(yīng)的情況下生長(zhǎng)，尤其是即能在無(wú)血清供應(yīng)的情況下生長(zhǎng)，尤其是cho、雜交瘤及重組骨髓瘤細(xì)胞等。雜交瘤及重組骨髓瘤細(xì)胞等。 其中其中胰島素胰島素是無(wú)血清培養(yǎng)基中促進(jìn)動(dòng)物細(xì)是無(wú)血清培養(yǎng)基中促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)的最重要的多肽。胞生長(zhǎng)的最重要的多肽。cho細(xì)胞能在僅含重細(xì)胞能在僅含重組人胰島素一種蛋白成分的無(wú)血清培養(yǎng)基中連組人胰島素一種蛋白成分的無(wú)血清培養(yǎng)基中連續(xù)傳代。在人類細(xì)胞培養(yǎng)中，

52、應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)續(xù)傳代。在人類細(xì)胞培養(yǎng)中，應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基還能有選擇性地控制及避免成纖維細(xì)胞的過基還能有選擇性地控制及避免成纖維細(xì)胞的過度生長(zhǎng)。某些細(xì)胞在無(wú)血清的條件下，其生長(zhǎng)度生長(zhǎng)。某些細(xì)胞在無(wú)血清的條件下，其生長(zhǎng)和抗體的產(chǎn)量甚至較有血清培養(yǎng)時(shí)高出數(shù)倍。和抗體的產(chǎn)量甚至較有血清培養(yǎng)時(shí)高出數(shù)倍。另外，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基的成功，另外，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基的成功，還將為某些疫苗的生產(chǎn)降低成本。還將為某些疫苗的生產(chǎn)降低成本。高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)特性高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)特性正常的哺乳類動(dòng)物細(xì)胞具有下列四大生物學(xué)特征：正常的哺乳類動(dòng)物細(xì)胞具有下列四大生物學(xué)特征： 錨地依賴性：細(xì)胞必須

53、附在固體上或固定的表面才能生長(zhǎng)分裂細(xì)胞必須附在固體上或固定的表面才能生長(zhǎng)分裂 血清依賴性：血清依賴性：細(xì)胞必須具有生長(zhǎng)因子才能生長(zhǎng)細(xì)胞必須具有生長(zhǎng)因子才能生長(zhǎng) 接觸抑制性：接觸抑制性：細(xì)胞與細(xì)胞接觸后，生長(zhǎng)便受到抑制細(xì)胞與細(xì)胞接觸后，生長(zhǎng)便受到抑制 形態(tài)依賴性：形態(tài)依賴性：細(xì)胞稱扁平狀，并有長(zhǎng)纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)細(xì)胞稱扁平狀，并有長(zhǎng)纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 上述特征使得正常的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體外培養(yǎng)中，一般上述特征使得正常的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體外培養(yǎng)中，一般只能存活只能存活5050代且在培養(yǎng)皿上以平面的形式生長(zhǎng)，即單層細(xì)胞代且在培養(yǎng)皿上以平面的形式生長(zhǎng)，即單層細(xì)胞生長(zhǎng)。有時(shí)，正常細(xì)胞會(huì)改變某些特征而越過生理臨界點(diǎn)，生長(zhǎng)

54、。有時(shí)，正常細(xì)胞會(huì)改變某些特征而越過生理臨界點(diǎn)，繼續(xù)增殖并無(wú)限制分裂，這種狀態(tài)稱為細(xì)胞系形成，此時(shí)的繼續(xù)增殖并無(wú)限制分裂，這種狀態(tài)稱為細(xì)胞系形成，此時(shí)的細(xì)胞成為細(xì)胞系。細(xì)胞成為細(xì)胞系。高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的條件高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的條件細(xì)胞系特征細(xì)胞系特征 喪失細(xì)胞接觸抑制性和錨地依賴性特征，喪失細(xì)胞接觸抑制性和錨地依賴性特征，遺傳穩(wěn)定性遺傳穩(wěn)定性 外源基因多次傳代后不至于丟失，易于長(zhǎng)期保存外源基因多次傳代后不至于丟失，易于長(zhǎng)期保存合適的標(biāo)記合適的標(biāo)記 便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持生長(zhǎng)快且齊生長(zhǎng)快且齊 分裂周期短，生長(zhǎng)均一，便于控制分裂周期短，生長(zhǎng)均一，便于控制 便于大便于大規(guī)

55、模培養(yǎng)規(guī)模培養(yǎng) 大多數(shù)正常的高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞并不能同時(shí)具備上述條件，大多數(shù)正常的高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞并不能同時(shí)具備上述條件，癌細(xì)胞能癌細(xì)胞能滿足上述前四項(xiàng)要求，但在安全性能上有欠缺。滿足上述前四項(xiàng)要求，但在安全性能上有欠缺。安全性能好安全性能好 不合成分泌致病物質(zhì)，不致癌不合成分泌致病物質(zhì)，不致癌高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型的哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺陷型的哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞5-5-磷酸核糖磷酸核糖-1-1-焦磷酸（焦磷酸（prppprpp）次黃嘌呤核苷一磷酸（次黃嘌呤核苷一磷酸（hmphmp）次黃嘌呤核苷（次黃嘌呤核苷（hrhr）gmpamp尿嘧啶核苷一磷酸（

56、尿嘧啶核苷一磷酸（umpump）胸腺嘧啶核苷一磷酸（胸腺嘧啶核苷一磷酸（tmptmp）胸腺嘧啶核苷（胸腺嘧啶核苷（trtr）嘌呤核苷酸生物合成途徑嘌呤核苷酸生物合成途徑嘧啶核苷酸生物合成途徑嘧啶核苷酸生物合成途徑次黃嘌呤磷酸次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶核糖轉(zhuǎn)移酶（hprt）（tktk）胸腺嘧啶胸腺嘧啶核苷激酶核苷激酶氨基喋呤（氨基喋呤（apap）氨基喋呤（氨基喋呤（apap）從頭合成途徑從頭合成途徑補(bǔ)救合成途徑補(bǔ)救合成途徑重重新新合合成成途途徑徑補(bǔ)救途徑補(bǔ)救途徑高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型的哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺陷型的哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞 含有胸腺嘧啶核苷激酶（

57、含有胸腺嘧啶核苷激酶（tktk）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞（tktk - -）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（苷的培養(yǎng)基上（hathat培養(yǎng)基）生長(zhǎng)，載體上的標(biāo)記基因培養(yǎng)基）生長(zhǎng)，載體上的標(biāo)記基因tktk能與能與之遺傳互補(bǔ)。之遺傳互補(bǔ)。 含有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（含有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hprthprt）編碼基因缺陷的）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞受體細(xì)胞（hprthprt - -）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（hat

58、hat培養(yǎng)基）生長(zhǎng)，載體上的標(biāo)培養(yǎng)基）生長(zhǎng)，載體上的標(biāo)記基因記基因hprthprt與之遺傳互補(bǔ)。與之遺傳互補(bǔ)。常用的高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞常用的高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞 迄今為止，用于醫(yī)療用品（藥物、抗體、診斷迄今為止，用于醫(yī)療用品（藥物、抗體、診斷試劑）大規(guī)模生產(chǎn)試劑）大規(guī)模生產(chǎn)的高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞主要還的高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞主要還是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（chocho/dhfr- ），其優(yōu)勢(shì)有如），其優(yōu)勢(shì)有如下幾個(gè)方面：下幾個(gè)方面：遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定與人的親緣關(guān)系接近，外源蛋白修飾準(zhǔn)確與人的親緣關(guān)系接近，外源蛋白修飾準(zhǔn)確基因轉(zhuǎn)移和載體表達(dá)系統(tǒng)完善

59、基因轉(zhuǎn)移和載體表達(dá)系統(tǒng)完善耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng)耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng)被美國(guó)被美國(guó)fdafda確認(rèn)為安全的基因工程受體細(xì)胞確認(rèn)為安全的基因工程受體細(xì)胞磷酸鈣共沉淀法磷酸鈣共沉淀法 將待轉(zhuǎn)化的將待轉(zhuǎn)化的dnadna溶解在磷酸緩沖液中，溶解在磷酸緩沖液中，加入加入cacl2cacl2溶液混勻，此時(shí)溶液混勻，此時(shí)dnadna被包裹在磷被包裹在磷酸鈣晶體顆粒內(nèi)；將上述制備的顆粒懸浮酸鈣晶體顆粒內(nèi)；將上述制備的顆粒懸浮液滴入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，液滴入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，3737保溫保溫4-164-16小時(shí)小時(shí)此時(shí)細(xì)胞膜形成吞噬泡，磷酸鈣晶體局部此時(shí)細(xì)胞膜形成吞噬泡，磷酸鈣晶體局部溶解膜結(jié)構(gòu)，溶解膜結(jié)構(gòu)，dn

60、adna便進(jìn)入受體細(xì)胞；便進(jìn)入受體細(xì)胞； 棄去棄去dnadna溶液，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)溶液，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)7 7天即可篩選轉(zhuǎn)化株。如果在外源天即可篩選轉(zhuǎn)化株。如果在外源dnadna中摻入少量的受體細(xì)胞內(nèi)源性中摻入少量的受體細(xì)胞內(nèi)源性dnadna可以提高可以提高轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化效率。電擊轉(zhuǎn)化法電擊轉(zhuǎn)化法 將待轉(zhuǎn)化的將待轉(zhuǎn)化的dnadna溶解在受體細(xì)胞溶解在受體細(xì)胞懸浮液懸浮液中，然后加入電擊轉(zhuǎn)化儀的中，然后加入電擊轉(zhuǎn)化儀的樣品槽內(nèi)，兩端施加瞬時(shí)高壓電場(chǎng)，樣品槽內(nèi)，兩端施加瞬時(shí)高壓電場(chǎng)，使細(xì)胞膜產(chǎn)生細(xì)小的縫隙，此時(shí)使細(xì)胞膜產(chǎn)生細(xì)小的縫隙，此時(shí)dnadna片段便可不經(jīng)過胞飲作用直接進(jìn)入