研究生創(chuàng)新基金資助項目申請書

1、研究生創(chuàng)新基金資助項目申請書項目類別：優(yōu)秀博士學(xué)位論文培育 創(chuàng)業(yè)種子項目名稱 葉酸缺乏導(dǎo)致心血管系統(tǒng)發(fā)育異常的機制研究申請人姓名 孫淑娜 所在院系 復(fù)旦大學(xué)兒科醫(yī)院 填表日期 2004年4月23日 復(fù)旦大學(xué)研究生院一、基本情況姓名孫淑娜學(xué)號041107210院系復(fù)旦大學(xué)兒科醫(yī)院專業(yè)兒科學(xué)專業(yè)層次博士導(dǎo)師桂永浩電話（辦）54237092電話（家子信箱041107210題目葉酸缺乏導(dǎo)致心血管系統(tǒng)發(fā)育異常的機制研究申請資助金額（元）3萬元預(yù)計完成時間2007年 2 月 31 日二、近期已取得的與本項目有關(guān)的主要研究成果（含論文、專著、專利等）1Shuna Sun, Yuex

2、iang Wang, Tao Zhong, Houyan Song, Yonghao Gui. Malformation of Zebrafish Cardiovascular System Caused by Inhibiting the Function of Folic Acid. 投稿于2006 .6于美國舉行的“The 7th International meeting on Zebrafish Development & Genetics”，并已被大會接收。 此文章近日投稿SCI收錄期刊：Development Dynamics2孫淑娜，桂永浩 葉酸拮抗劑MTX干擾斑馬魚胚

3、胎發(fā)育及外源性FTHFA的拮抗作用 藥學(xué)學(xué)報（已投稿）3孫淑娜，桂永浩 葉酸生物學(xué)活性受抑制后下調(diào)斑馬魚MEF2A、MEF2C的表達 （已完成）4“葉酸拮抗劑MTX對斑馬魚心血管系統(tǒng)發(fā)育影響的實驗研究” 第二屆江浙滬兒科學(xué)會議優(yōu)秀論文獎5“葉酸缺乏對斑馬魚心血管系統(tǒng)發(fā)育影響的實驗研究”2005年度復(fù)旦大學(xué)兒科醫(yī)院論文比賽一等獎三、項目論證1.對項目的論證：基本內(nèi)容、重點和難點、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析、本項目的理論意義和實踐意義，并附列主要參考文獻及出處；2.對項目實施和完成條件的論證：研究生的研究水平和時間保證、資料設(shè)備、科研手段；3.研究方案的論證；4.對市場產(chǎn)業(yè)化前景的論證（僅對“創(chuàng)業(yè)種子資助

4、項目”）。1. 對項目的論證：基本內(nèi)容和重點:本研究從葉酸缺乏導(dǎo)致先天性心臟病的機制探討入手，用化學(xué)遺傳學(xué)和基因阻抑兩種手段構(gòu)建葉酸缺乏斑馬魚生物模型，觀察葉酸缺乏導(dǎo)致斑馬魚心血管發(fā)育異常的表型,并以此為平臺，開展后續(xù)葉酸缺乏對斑馬魚心臟發(fā)育相關(guān)基因表達影響的研究。同時對兒童體內(nèi)葉酸生物學(xué)作用發(fā)揮的關(guān)鍵酶基因（DHFR基因）突變與先天性心臟病發(fā)病之間的關(guān)系進行了初步探討。從實驗室研究和臨床研究兩方面入手探尋葉酸缺乏導(dǎo)致先心病的機理。國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析：先天性心臟?。–HD）是嚴(yán)重危害兒童生命和健康的疾病，發(fā)病率為810活產(chǎn)嬰兒。在其致病的諸多因素中，環(huán)境因素中維生素的缺乏不容忽視。近年來，人群

5、中大量的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示人類葉酸缺乏可導(dǎo)致許多先天性異常的發(fā)生率明顯上升，如：先天性心臟病、神經(jīng)管發(fā)育缺陷、頜面部畸形等異常1。且母親孕期適當(dāng)補充葉酸可以有效的預(yù)防這些先天性畸形的發(fā)生2。以這些調(diào)查研究的結(jié)果為依據(jù)，利用模式生物開展葉酸缺乏導(dǎo)致先天性心臟病發(fā)病機制的研究目前已成為國內(nèi)外熱點。目前大鼠中構(gòu)建的葉酸缺乏模型主要有兩種方法，一是將與葉酸生物學(xué)作用發(fā)揮有關(guān)的基因剔除，造成葉酸缺乏的模式34，二是利用公認(rèn)的葉酸拮抗劑阻斷葉酸生物學(xué)作用的發(fā)揮。葉酸在進入體內(nèi)后發(fā)揮生物學(xué)作用時，有賴于其向細(xì)胞內(nèi)運輸或代謝中許多因子的共同作用，如葉酸受體（FR）、還原葉酸載體（RFC）、二氫葉酸還原酶（D

6、HFR）5，10 -亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）等。目前在人群中開展的基因多態(tài)性研究及利用動物模型實驗都已發(fā)現(xiàn)上述一些因子相關(guān)基因的功能紊亂可導(dǎo)致葉酸正常生物學(xué)作用的發(fā)揮受抑制，繼而發(fā)生先心病等先天性發(fā)育異常34。但目前對其確切的機理仍不明確。人類的HAND2基因定位于5q33染色體，對于心臟、咽弓和肢體發(fā)育有重要作用，其對于心肌前體細(xì)胞的分化和心肌分化時細(xì)胞的定位十分關(guān)鍵5。在人類心肌病中發(fā)現(xiàn)有HAND2基因的表達下調(diào)5 6。HAND2對人類UFD1L基因的表達有調(diào)節(jié)作用，UFD1L基因又與人類22q11缺失綜合征有很大關(guān)系7。另外，HAND2與人類DGS的發(fā)病也相關(guān)8。HAND2還通

7、過和其他心臟特異性轉(zhuǎn)錄因子，如 GATA4、NKX2.5、MEF2A、MEF2C、TBX5、TBX1、END-1、TBX20、PHOX2A等的相互作用來調(diào)節(jié)心臟的發(fā)育9。在斑馬魚中，HAND2突變可導(dǎo)致心臟發(fā)育明顯缺陷10。葉酸缺乏是否干擾了上述心臟發(fā)育關(guān)鍵因子的功能而導(dǎo)致先天性心臟病的發(fā)生尚未有明確的結(jié)論。斑馬魚是今年來新興的一種模式生物，其心血管系統(tǒng)透明、便于觀察，且繁殖量大、發(fā)育周期短，是心臟發(fā)育生物學(xué)研究的理想動物模型。在國內(nèi)外其它利用葉酸缺乏動物模型進行的研究中，葉酸缺乏小鼠11和葉酸生物學(xué)活性受阻小鼠12、13有胚胎多系統(tǒng)的發(fā)育障礙，胚胎未發(fā)育至成熟即死亡；而斑馬魚的胚胎在發(fā)育嚴(yán)重

8、異常時仍能依賴周圍水環(huán)境中的氧氣存活一段時間，這就避免了由于胚胎死亡而導(dǎo)致的實驗觀察的終止，我們利用斑馬魚這一特點，開展葉酸缺乏研究。 本研究的理論意義和現(xiàn)實意義：在近年國內(nèi)外流行病學(xué)調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)人群中各種原因?qū)е碌娜~酸缺乏與先心病發(fā)生率升高有關(guān)。國外學(xué)者有報道，母親長期或在孕期服用DHFR抑制劑(氨甲蝶呤、乙胺嘧啶、氨苯蝶啶及甲氧芐啶)可以導(dǎo)致后代發(fā)生先天性心臟病等異常14。本研究以此為切入點，通過阻斷DHFR的功能構(gòu)建斑馬魚葉酸缺乏模型，并探討葉酸缺乏后對心臟發(fā)育相關(guān)基因功能上的影響，以探尋葉酸缺乏導(dǎo)致先心病的機制，有重要的理論和現(xiàn)實意義。2. 對項目實施和完成條件的論證：本課題組申請人

9、所在單位是復(fù)旦大學(xué)兒科醫(yī)院，我院配有國內(nèi)領(lǐng)先水平的實驗儀器和較高的實驗技術(shù)。本課題將與復(fù)旦大學(xué)分子醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室協(xié)作完成，該實驗室有符合國際標(biāo)準(zhǔn)的斑馬魚實驗室，并有成熟的實驗技術(shù)和配備齊全的實驗設(shè)備，可以保證本課題的順利完成。在本課題已進行的6個月時間內(nèi)，我們已熟悉了斑馬魚的飼養(yǎng)和繁殖技術(shù)、斑馬魚的發(fā)育規(guī)律，并對基因探針的制備、原位雜交的操作等關(guān)鍵技術(shù)有較完全的掌握，有利于開展后續(xù)的研究。3.研究方案的論證： 本課題挑選目前備受關(guān)注的先心病致病環(huán)境因素為研究點之一，應(yīng)用新興模式生物斑馬魚開展葉酸缺乏導(dǎo)致先心病的基因水平機理研究，有完整的理論基礎(chǔ)和周密的實驗設(shè)計。顯微注射嗎啡啉修飾的反義核

10、苷酸是一種新興的能夠特異下調(diào)基因表達的技術(shù)15，在斑馬魚中此技術(shù)操作相對簡便，有利于開展基因水平的研究；且斑馬魚是化學(xué)遺傳學(xué)研究的理想研究生物模型16。在構(gòu)建斑馬魚葉酸缺乏模型時，針對DHFR分別采用化學(xué)遺傳學(xué)方法和基因阻抑方法阻斷葉酸生物學(xué)活性的發(fā)揮，在探討葉酸缺乏后對心血管發(fā)育相關(guān)基因功能的干擾時，同時采用原位雜交和Realtime PCR 的方法論證。在前階段實驗中，我們已用化學(xué)遺傳學(xué)方法在近2.5萬枚胚胎中成功篩選出心血管發(fā)育異常表型，探尋到觀察心血管系統(tǒng)發(fā)育干擾的MTX最適宜處理時段和濃度；并發(fā)現(xiàn)葉酸生物學(xué)活性受抑制后心血管發(fā)育相關(guān)基因HAND2、MEF2A、MEF2C、FLK-1的

11、表達不同程度下調(diào)。以此我們選擇圍繞HAND2進行后續(xù)實驗，在闡明HAND2表達阻抑和過表達時對MEF2A、MEF2C、TBX1、TBX5、PHOX2A、GATA4、TWIST1等心臟發(fā)育相關(guān)因子表達的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控后，我們加入葉酸干擾因素，探討上述因子表達的差異，從而初步探索葉酸導(dǎo)致先心病發(fā)生的機理。在臨床部分研究中，仍以DHFR為切入點，探討其基因突變與先心病的關(guān)聯(lián)性；有利于指導(dǎo)臨床診斷，有十分重要的臨床意義，并為前部分的實驗研究提供更充足的理論依據(jù)。（詳見下表）(參考文獻)1.McDonald SD, Ferguson S, Tam L，et al. The prevention of co

12、ngenital anomalies with periconceptional folic acid supplementation. J Obstet Gynaecol Can. 2003 Feb;25(2):115-21.2.Botto LD, Mulinare J, Erickson JD. Do multivitamin or folic acid supplements reduce the risk for congenital heart defects? Evidence and gaps. Am J Med Genet A. 2003 Aug 30;121(2):95-10

13、1.3.Pei LJ, Ren AG, Hao L，et al. Study on the association between reduced folate carrier gene polymorphism and congenital heart defects and cleft lip with or without cleft palate. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 2004 Dec;25(12):1063-7.4.Li D, Pickell L, Liu Y,et al. Maternal methylenetetrahydrofo

14、late reductase deficiency and low dietary folate lead to adverse reproductive outcomes and congenital heart defects in mice.  Am J Clin Nutr. 2005 Jul;82(1):188-95.5. Hand2 regulates epithelial formation during myocardial diferentiation.Trinh le A, Yelon D, Stainier DY Curr Biol. 2005 Mar 8;15(

15、5):441-6.6. HAND1 and HAND2 are expressed in the adult-rodent heart and are modulated during cardiac hypertrophy.Thattaliyath BD, Livi CB, Steinhelper ME, Toney GM, Firulli AB.Biochem Biophys Res Commun. 2002 Oct 4;297(4):870-5.7. Absence of mutations in human ubiquitin fusion-degradation protein ge

16、ne in tetralogy of Fallot.Chung MY, Lu JH, Weng YY, Hwang B J Mol Med. 2001 Jun;79(5-6):338-42.8.The zebrafish van gogh mutation disrupts tbx1, which is involved in the DiGeorge deletion syndrome in humans.Piotrowski T, Ahn DG, Schilling TF Development. 2003 Oct;130(20):5043-52.9. Cooperative activa

17、tion of atrial naturetic peptide promoter by dHAND and MEF2C.Zang MX, Li Y, Xue LX, J Cell Biochem. 2004 Dec 15;93(6):1255-66.10. The bHLH transcription factor hand2 plays parallel roles in zebrafish heart and pectoral fin development.Yelon D, Ticho B, Halpern ME, Development. 2000 Jun;127(12):2573-

18、82.11. Kimmel C B，Ballard W W，Kimmel S R，et al.Stages of embryonic development of the zebrafish.Dev Dyn,1995,203:253-31012Maternal methylenetetrahydrofolate reductase deficiency and low dietary folate lead to adverse reproductive outcomes and congenital heart defects in mice. Li D. Pickell L. Liu Y.

19、 Wu Q. Cohn JS. Rozen R.American Journal of Clinical Nutrition. 82(1):188-95, 2005 Jul.13 . Mice lacking the folic acid-binding protein Folbp1are defective in early embryonic development. Jorge A. Piedrahita, Betty Oetama, Gregory D.1999 Nature America Inc.14. Hernandez-Diaz S, Werler MM, Walker AM,

20、et al. Folic acid antagonists during pregnancy and the risk of birth defects. N Engl J Med. 2000 Nov 30;343(22):1608-14.15. Nasevicius A, Ekker SC.Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat Genet. 2000 Oct;26(2):216-2016Zebrafish as a novel experimental model for developmental tox

21、icology.Congenit Anom (Kyoto). Teraoka H, Dong W, Hiraga T.2003 Jun;43(2):123-32. （附表：實驗設(shè)計方案）一、實驗研究部分斑馬魚葉酸缺乏模式的構(gòu)建采用DHFR基因表達阻抑方法，在胚胎受精后單細(xì)胞期顯微注射嗎啡啉修飾的反義RNA采用化學(xué)遺傳學(xué)方法，在胚胎受精后610h用葉酸拮抗劑MTX（抑制葉酸發(fā)揮生物學(xué)活性通路中關(guān)鍵酶DHFR的活性）處理胚胎觀察心臟發(fā)育異常表型，并通過原位雜交和Real-time PCR的方法檢測胚胎整體及心臟中心血管發(fā)育相關(guān)基因HAND2、MEF2A、MEF2C、TBX1及HAS2整體表達水平的

22、差異前期實驗結(jié)果已表明葉酸生物學(xué)活性受抑制后，對斑馬魚心血管發(fā)育產(chǎn)生干擾，且HAND2、MEF2A、MEF2C、FLK-1的表達不同程度的下調(diào)挑選HAND2基因進行深入探討葉酸缺乏對HAND2及其靶基因表達的影響：闡明HAND2基因表達阻抑和使其過表達后,部分心臟發(fā)育相關(guān)基因在時相和空間上的表達變化探討HAND2基因過表達的同時阻抑DHFR表達與只HAND2基因過表達這兩種情況下，心臟發(fā)育的表型變化及心血管發(fā)育相關(guān)基因在時相和空間上的表達變化探討HAND2基因表達阻抑并給予葉酸與只HAND2基因表達阻抑這兩種情況下，心臟發(fā)育的表型變化及心血管發(fā)育相關(guān)基因在時相和空間上的表達變化二、臨床研究部分

23、采集臨床先心病患兒血標(biāo)本，并按先心病種類分組采集與先心病患兒匹配的正常對照組患兒血標(biāo)本抽提DNA，經(jīng)PCR擴增DHFR基因全長序列后進行對比尋找先心病患兒及正常對照組患兒DHFR基因序列上的差異，并探討此差異與先心病發(fā)生的關(guān)系，從臨床角度提供DHFR基因異常而導(dǎo)致的葉酸生物學(xué)活性受抑與先天性心臟病的發(fā)生有關(guān)，進一步為上述的實驗室研究部分提供理論依據(jù)四、預(yù)期研究成果研究階段（起止時間）階段成果名稱成果形式2005.92005.10通過化學(xué)遺傳學(xué)的方法觀察葉酸拮抗劑MTX對斑馬魚心血管發(fā)育的影響及外源性FTHFA的拮抗作用，篩選出適合后續(xù)分子生物學(xué)實驗的合適處理時段及濃度權(quán)威期刊文章2篇2005.112006.5探討HAND2、MEF2A、MEF2C、TBX1、HAS2及 FLK-1等心血管發(fā)育相關(guān)基因在正常斑馬魚中的時空表達規(guī)律及應(yīng)用葉酸拮抗劑后其基因表達水平的變化1200662006.8明確用下調(diào)DHFR基因的方法阻斷葉酸生物學(xué)活性發(fā)揮后, HAND2、MEF2A、MEF2C、TBX1、HAS2及 FLK-1等心血管發(fā)育相關(guān)基因表達水平的變化SCI文章1篇200692006.11闡明下調(diào)HAND2基因和使其過表達后,部分心臟發(fā)育相關(guān)基因在時相和空間上的表達變化權(quán)威期刊1篇2006.12-2007.1探討在下調(diào)HAND2基因并給予