實(shí)驗(yàn)一、質(zhì)粒DNA的提取及檢測實(shí)驗(yàn)報告(共3頁)

1、實(shí)驗(yàn)一、質(zhì)粒DNA的提取及檢測【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的原理和步驟2、掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術(shù)3、學(xué)會PCR操作的基本技術(shù)第一部分 質(zhì)粒DNA的提取一、實(shí)驗(yàn)原理：堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們。在pH值介于12.012.5這個狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互盤繞，仍會緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH至中性時，共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體

2、DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開，復(fù)性就不會那么迅速而準(zhǔn)確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。二、儀器與試劑1、儀器 恒溫?fù)u床、臺式離心機(jī)2、試劑 溶液I、溶液、溶液、無水乙醇、TE緩沖液、胰RNA酶、酚、氯仿三、實(shí)驗(yàn)步驟1、 將2mL含相應(yīng)抗生素（Amp:50g/mL）的LB液體培養(yǎng)基加入到試管中，接入含pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌，37振蕩培養(yǎng)過夜。2、 取1.5mL培養(yǎng)物倒入微量離心管中，4000r/min離心2min。3、 吸去培養(yǎng)液，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥。4、 將細(xì)菌沉淀懸浮于100L溶液I中，充分混勻，室溫放

3、置10 min。5、 加200L溶液（新鮮配制），蓋緊管皿，混勻內(nèi)容物，將離心管放冰上5min。6、 加入150L溶液（冰上預(yù)冷），蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻。冰上放置15min。7、 12000r/min，離心15min，將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中。8、 向上清中加入等體積酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反復(fù)混勻，12000r/min，離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。9、 向上清加入2倍體積無水乙醇，混勻后，室溫放置510min。12000r/min，離心5min。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。10、用1mL70乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，振蕩并離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中

4、干燥。11、加20LTE緩沖液，其中含有20g/mL的胰RNA酶，使DNA完全溶解，-20保存。第二部分 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA一、實(shí)驗(yàn)原理：DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣，可進(jìn)行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離

5、不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。如實(shí)驗(yàn)提取的pUC19質(zhì)粒，有3種構(gòu)型：超螺旋的共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA，開環(huán)質(zhì)粒DNA，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA1條鏈斷裂，線狀質(zhì)粒DNA，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA2條鏈發(fā)生斷裂。這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移率不同。因此電泳后呈3條帶，超螺旋質(zhì)粒DNA泳動最快，其次為線狀DNA，最慢的為開環(huán)質(zhì)粒DNA。二、儀器與試劑1、儀器 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、紫外線透射儀、電爐子2、試劑 5×TBE、凝膠加樣緩沖液（6×）、瓊脂糖、溴化乙錠溶液（EB）三、實(shí)驗(yàn)步驟（一） 制備瓊脂糖凝膠稱取0.1

6、g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入10mL 0.5×TBE 緩沖液，加熱至完全溶化（加EB），搖勻，則為1瓊脂糖凝膠液。（二） 膠板的制備1、 取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干。2、 將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。3、 將冷到60左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）。4、 待膠凝固后，取出梳子，放在電泳槽內(nèi)。5、 加入電泳緩沖液至電泳槽中。（三） 加樣用移液槍將已加入上樣緩沖液的DNA樣品加入加樣孔（記錄點(diǎn)樣順序及點(diǎn)樣量）。（四） 電泳1、 接通電泳槽與電泳儀的電源（注意正負(fù)極，DNA片段從負(fù)極向正極移動）。2、 當(dāng)溴

7、酚藍(lán)染料移動到距凝膠前沿12cm處，停止電泳。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果在紫外燈（254nm）下觀察染色后的電泳凝膠。DNA存在處應(yīng)顯出桔紅色熒光條帶。第三部分 PCR擴(kuò)增制備目的基因 一、實(shí)驗(yàn)原理： 是將待擴(kuò)增的DNA模板加熱變性，與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡聚核苷酸引物復(fù)性，然后經(jīng)過耐熱的DNA聚合酶延伸。經(jīng)過變性復(fù)性延伸的n次循環(huán)后，DNA可被擴(kuò)增2n倍。二、儀器與試劑1、儀器 PCR儀2、試劑 模板DNA、Taq DNA聚合酶、引物、10×Buffer、DNA Marker三、實(shí)驗(yàn)步驟（1）加樣：在0.2ml PCR 微量離心管中配制25l反應(yīng)體系。 ddH2O 15.25l 10×PCR buffer 2.5l dNTP（2.5mM） 3.0l 10mol/L Primer1（2M） 1.0l 10mol/L primer2（2M） 1.0l 模板DNA（含質(zhì)粒) 2.0l Taq酶（5U/l ） 0.25l 總體積 25l（2）將PCR反應(yīng)