模板制備PPT課件

1、PCR模板制備1 PCR的模板與制備PCR模板的使用粗樣品中的PCR抑制劑中山大學(xué)藥學(xué)院第1頁/共46頁PCR模板制備與純化 DNA和RNA均可作為PCR擴增反應(yīng)的模板，但一般情況下，mRNA先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進行擴增。 PCR模板的來源主要有兩大類：純凈物 如重組質(zhì)粒、制備的染色體DNA、回收的DNA片段粗樣品 如糞便、腦脊髓液、血液、食物、動物貝殼、土壤、尿液、唾液、福爾馬林固定劑、組織切片、膿汁、噴嚏液、痰液等 第2頁/共46頁PCR模板的使用PCR模板的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍：102 - 105 拷貝 特異性的改進：增加模板DNA的量、降低引物與模板的分子比 有效性的改進：增加引物與模板的分子

2、比 模板濃度的變化很大程度上取決于待擴增的堿基序列，但一般而言，模板DNA長度小，PCR擴增產(chǎn)物的量就大，因此對于大分子量的模板DNA（尤其是真核生物基因組DNA），在擴增之前最好先用超聲波處理或限制性酶消化。第3頁/共46頁2 PCR的模板純化核酸提取第一部分：DNA提取方法簡介第二部分：DNA提取常見問題及其對策第三部分：RNA提取方法簡介第四部分：RNA提取常見問題及對策中山大學(xué)藥學(xué)院第4頁/共46頁基因組DNA的提取第一部分：DNA提取方法簡介中山大學(xué)藥學(xué)院第5頁/共46頁 CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法） CTAB（十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并

3、與核酸形成復(fù)合物。 該復(fù)合物在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。中山大學(xué)藥學(xué)院第6頁/共46頁qCTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方 組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0） NaCl CTAB-巰基乙醇 終濃度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl （pH8.0）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl 提供一個高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細(xì)胞膜，

4、并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除第7頁/共46頁qCTAB提取緩沖液的改進配方 組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0）NaCl CTAB PVP40-巰基乙醇 終濃度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入vPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。中山大學(xué)藥學(xué)院第8頁/共46頁qCTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細(xì)胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DN

5、A溶液第9頁/共46頁第10頁/共46頁q SDS法原理 SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（5565）條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸； 提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰浴），使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。中山大學(xué)藥學(xué)院第11頁/共46頁q SDS法DNA提取緩沖液組份Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH 8.0 ）NaCl SDS終濃度 10 mM 20 mM 0.4M 2%中山大學(xué)藥學(xué)院第12頁/共46頁q SDS法流程圖 （以動物組織為例） 動物組織細(xì)胞裂解上層溶

6、液組織勻漿抽提干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液第13頁/共46頁 吸附材料結(jié)合法：q根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：硅質(zhì)材料陰離子交換樹脂磁珠高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫。快捷高效。低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實驗。磁性微粒掛上不同基團可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的。中山大學(xué)藥學(xué)院第14頁/共46頁濃鹽法：有機溶劑抽提法：密度梯度離心法：利用RNP和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物中山大學(xué)藥學(xué)院第15頁/共46頁q 非基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取

7、堿裂解法 煮沸法線粒體、葉綠體DNA的提取 差速離心結(jié)合SDS裂解法中山大學(xué)藥學(xué)院第16頁/共46頁q堿裂解法原理 染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子； 當(dāng)用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時即恢復(fù)其天然構(gòu)象； 變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。中山大學(xué)藥學(xué)院第17頁/共46頁q堿裂解法流程圖對數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提離心洗滌酒精沉淀干燥溶解沉淀質(zhì)粒DN

8、A溶液第18頁/共46頁q煮沸法原理 染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子； 當(dāng)加熱處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時即恢復(fù)其天然構(gòu)象； 變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。中山大學(xué)藥學(xué)院第19頁/共46頁第20頁/共46頁q差速離心法原理 是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。 將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。線粒

9、體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細(xì)胞器，自身可編碼蛋白，它們的比重和大小一定，因而在同一離心場內(nèi)的沉降速度也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級分離出來中山大學(xué)藥學(xué)院第21頁/共46頁I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)V.核酸溶解在適量緩沖液或水中中山大學(xué)藥學(xué)院第22頁/共46頁最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）組培細(xì)胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取使用處于對數(shù)期的

10、新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加）培養(yǎng)時應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）中山大學(xué)藥學(xué)院第23頁/共46頁材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料液氮研磨動物組織勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞蛋白酶K細(xì)菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時，定時輕柔振蕩基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取菌體量適當(dāng)培養(yǎng)基去除干凈，同時保證菌體在懸浮液中充分懸浮變性的時間不要過長（5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷復(fù)性時間也不宜過長，否則會有基因組DNA的污染G菌、酵母質(zhì)粒的

11、提取，應(yīng)先用酶法或機械法處理，以破壁第24頁/共46頁 采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系 采用有機（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔 離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間 針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取中山大學(xué)藥學(xué)院第25頁/共46頁q 蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理中山大學(xué)藥學(xué)院第26頁/共46頁q 多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5M NaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1

12、/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。中山大學(xué)藥學(xué)院第27頁/共46頁q 多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等 加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合q 鹽離子的去除： 70的乙醇洗滌中山大學(xué)藥學(xué)院第28頁/共46頁第29頁/共46頁第30頁/共46頁q異硫氰酸胍/苯酚法 原理： 細(xì)胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，

13、同時核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放； 釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位于整個體系中的中間相和水相，從而得以分離； 有機溶劑抽提，沉淀，得到純凈RNA。 中山大學(xué)藥學(xué)院第31頁/共46頁 步驟:材料準(zhǔn)備：盡量新鮮。裂解變性：異硫氰酸胍（亞硫氫胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。 使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸酶。純化分離：苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除雜物。洗滌：70乙醇。沉淀：異丙醇、無水乙醇。 乙酸鈉（pH4.0）：維持變性的細(xì)胞裂解液的pH值，沉淀RNA。 此外還常用氯化鋰選擇沉淀RNA。中山大學(xué)藥學(xué)院第32頁/共46頁RNA操作中的

14、要求 抑制RNase活性是提取RNA的關(guān)鍵 在實驗中，嚴(yán)格控制內(nèi)源性和外源性RNase的污染。RNase可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。外源性RNase存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在其它分子生物學(xué)實驗中使用的RNase也會造成污染。這些外源性的RNase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳 槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細(xì)胞中則含有大量內(nèi)源性的RNase 。 中山大學(xué)藥學(xué)院第33頁/共46頁 一、 防止RNA酶污染的措施 1. 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180的高溫下干烤6hr或更長時間2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：

15、有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）3. 有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。4. 配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC，在37處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22m濾膜過濾除菌5. 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。6. 設(shè)置RNA操作專用實驗室，所有器械等應(yīng)為專用。第34頁/共46頁二、常用的RNA酶抑制劑1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它

16、通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。高溫條件下分解。2.異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。3.氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。4.RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。5.其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。 第35

17、頁/共46頁RNA的分離和純化- TRIzol試劑法原理： 首先用含有異硫氰酸胍和酚的一種單相液來裂解細(xì)胞，加入氯仿產(chǎn)生第二相，離心后，RNA存在于水相，經(jīng)異丙醇沉淀水相中的RNA可用于Northern雜交分析、RT-PCR等；存在于有機相的DNA和蛋白質(zhì)用乙醇和異丙醇連續(xù)沉淀而分別分離，得到的DNA大小約20Kb，適用于PCR的模板；回收的蛋白質(zhì)主要用于免疫印跡分析。中山大學(xué)藥學(xué)院第36頁/共46頁RNA的鑒定紫外法 260nm下OD值為1時相當(dāng)于40g/mlRNA。取5lRNA樣品于1ml雙蒸水中，分別于260、280、230nm處比色并記錄。定量分析： RNAA260核酸稀釋倍數(shù)40/1

18、000（g/ml）純度分析：A260讀數(shù)在0.15-1.0之間才可靠。 RNA A260/A280=1.9-2.1 A260/A2801.9,有雜蛋白，用酚/氯仿抽提; A260/A2302.0，可能有鹽未除盡。做RT前必需測RNA濃度，常用500ng或1ug 中山大學(xué)藥學(xué)院第37頁/共46頁q 材料：新鮮，切忌使用反復(fù)凍融的材料如若材料來源困難，且實驗需要一定的時間間隔。可以先將材料貯存在TRIzol或樣品貯存液中，于70或20保存如要多次提取，請分成多份保存液氮長期保存，70短期保存中山大學(xué)藥學(xué)院第38頁/共46頁q 純化：在使用氯仿抽提純化時，一定要充分混勻，且動作快速；經(jīng)典的純化方法，如 LiCl 沉淀等，雖然經(jīng)濟，但操作時間長，易造成 RNA 降解；柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響