鏈霉菌操作手冊

1、鏈霉菌室實(shí)驗(yàn)操作手冊（2003年）第一章 培養(yǎng)基 抗生素 生長因子3常用抗生素及其使用濃度3LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基3LA3基本培養(yǎng)基（MM）3R5（1L）鏈霉菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化時(shí)用4YEME(酵母膏-麥芽膏培養(yǎng)基) 1L（液體培養(yǎng)鏈霉菌）4TSBY （1L）（液體培養(yǎng)鏈霉菌）4MS培養(yǎng)基52CMY培養(yǎng)基（用于井崗的接合轉(zhuǎn)移）5YMS培養(yǎng)基（阿維，井崗產(chǎn)孢）5YD培養(yǎng)基5生長因子補(bǔ)充物的使用濃度5第二章 DNA基本操作7大腸桿菌質(zhì)粒的抽提7酶連反應(yīng)7DNA片段凝膠回收7DNA純化9E.coil總DNA的提取9鏈霉菌質(zhì)粒DNA的小量提取（還需改進(jìn)）10去磷酸化處理（詳見分子克隆實(shí)驗(yàn)指

2、南以及Takara的CIAP使用說明）10AT克?。ㄔ斠娬f明書）10Southern Blot11第三章 PCR及相關(guān)技術(shù)13PCR13PCR重組（詳見PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南p429 重疊延伸技術(shù)）14PCR定點(diǎn)誘變（DpnI法）14第四章 基因片段轉(zhuǎn)移技術(shù)15大腸桿菌CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞及DNA轉(zhuǎn)化15DNA轉(zhuǎn)化15大腸桿菌質(zhì)粒的快速檢測15接合轉(zhuǎn)移（詳見英文手冊249頁）16鏈霉菌原生質(zhì)體的制備16鏈霉菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化17PCR-Targeting技術(shù)中E.coli電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備及電轉(zhuǎn)化17第五章 RNA操作技術(shù)19鏈霉菌總RNA的抽提19鏈霉菌的RT-PCR（promega RT

3、kit）19第六章 蛋白質(zhì)基本操作技術(shù)21SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色21大腸桿菌可溶性蛋白表達(dá)及抽提（用于由IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)體系）：21鏈霉菌總蛋白抽提：22大腸桿菌目標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)及總蛋白檢測（含T7表達(dá)系統(tǒng)如BL21菌株中的pET系列表達(dá)體系）：22Western Blot23第七章 遺傳作圖相關(guān)技術(shù)25鏈霉菌孢子懸液的制備25鏈霉菌中NF的證明25孢子雜交25在遺傳圖譜上兩個(gè)標(biāo)記基因之間定位新的基因25第八章 其他技術(shù)27鏈霉菌菌種保藏27檢測鏈霉菌淀粉酶的活性27第一章 培養(yǎng)基 抗生素 生長因子常用抗生素及其使用濃度 抗生素英文名稱及縮寫抗性基因貯藏液濃度(mg/ml)使用終濃度

4、（g/ml）鏈霉菌大腸桿菌MM2CMYEMELA或LB氨芐青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壯觀霉素鏈霉素硫鏈絲菌素紅霉素阿泊拉霉素Ampicillin, Amp Chloramphenicol, CmlHygromycin, HygKanamycin, KmSpectinomycin, SpcStreptomycin, StrThiostrepton, ThioErythomycin, EryApramycin, Amblacathygaac或aphaadAstrtsrermEaac(3)IV10025(無水乙醇配)5025505025(DMSO配)10050R10102?5010510010R25

5、5050251050R502.55050-1002550505025不敏感2030-50* 表示無記錄或不能使用，貯存液除特別說明外均用無菌水配制*此表僅供參考！*R表示不敏感*Km 和Am有交叉抗性，所以同時(shí)具有這兩種抗性基因時(shí)應(yīng)適當(dāng)提高抗生素的量，并作好對照。*Hyg易見光分解，應(yīng)用錫箔紙包好。*有些抗生素需要在低鹽的環(huán)境（如DNA培養(yǎng)基）下篩選效率較高，如Hyg, Km, VioLB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基胰蛋白胨 10g，酵母抽提物 5g，NaCl 5g，葡萄糖 1g，蒸餾水加至 1000ml，pH7.3左右（滅菌后第一次用時(shí)還要調(diào)一次）LALB中加入終濃度為1.5-2%的

6、瓊脂粉(不同的瓊脂加的量不同，如青島瓊脂大概需1.5%，而華美的需要2%)。做藍(lán)白斑篩選時(shí)不加葡萄糖基本培養(yǎng)基（MM）溶液：L-天冬酰胺 0.5g，K2HPO4 0.5g,MgSO4·7H2O 0.2g,FeSO4·7H2O 0.01g, 蒸餾水至 1000ml 將每250ml溶液分裝到裝有2.5g瓊脂的500ml三角瓶中，滅菌，使用時(shí)每瓶加入50葡萄糖（8磅滅菌）5ml，調(diào)pH7.0。配置MM的瓊脂有l(wèi)ab agar、Ice agar(IA)R5（1L）鏈霉菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化時(shí)用 蔗糖 103g K2SO4 0.25g MgCl2·6H2O 10.12g 葡萄糖 1

7、0g Difco酪蛋白氨基酸 0.1g 微量元素溶液 2ml Oxoid酵母提取物 5g TES 5.73g 加蒸餾水至 1000ml稱取5.5g Difco瓊脂放入500ml三角瓶中，倒入250ml上述溶液，然后塞上塞子后8磅滅菌（114度15分種）。使用時(shí)，將培養(yǎng)基融化，每瓶中加入： KH2PO4(0.5%) 2.5ml CaCl2·2H2O(5M) 1ml L-脯氨酸(20%) 3.75ml NaOH(1M)調(diào)pH至7.3 對營養(yǎng)缺陷型菌株加入適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)因子（請參考手冊）YEME(酵母膏-麥芽膏培養(yǎng)基) 1L（液體培養(yǎng)鏈霉菌） Oxoid酵母提取物 3g Oxoid蛋白胨Try

8、ptone 5g 麥芽提取物（BD公司原Difco公司218630） 3g 葡萄糖 10g 蔗糖 340g 蒸餾水 至1000ml高壓滅菌后加入：（8磅滅菌，113114C，15min，自動(dòng)滅菌鍋一次不能滅過多東西，否則會滅不徹底。） MgCl2·6H2O(2.5M) 2ml/L制備原生質(zhì)體時(shí)，還要加入： 甘氨酸（20%） 25ml/L 蔗糖的主要作用是維持鏈霉菌生長時(shí)的滲透壓。 甘氨酸被認(rèn)為能干擾鏈霉菌細(xì)胞壁的形成，使菌絲體片段更短，利于溶菌，有利于外源DNA的導(dǎo)入。TSBY （1L）（液體培養(yǎng)鏈霉菌） Oxoid胰胨豆湯粉（TSB） 30g 蔗糖 340g Oxoid酵母抽提物

9、5g 蒸餾水 至1000ml*不同菌株培養(yǎng)需要不同濃度的蔗糖，蔗糖的主要作用是維持鏈霉菌生長時(shí)的滲透壓。MS培養(yǎng)基將黃豆餅粉加蒸餾水煮2到3小時(shí)，用紗布過濾得到濾液，將每250ml濾液分裝到裝有5g瓊脂，5g 甘露醇的500ml三角瓶中，10磅滅菌，使用時(shí)調(diào)pH7.2-7.3。2CMY培養(yǎng)基（用于井崗的接合轉(zhuǎn)移）可溶性淀粉 10g 胰蛋白胨 2gNaCl 1g(NH4 )2SO4 2gK2 HPO4 1gCaCO3 2g無機(jī)鹽溶液* 1 ml瓊脂 20g蒸鎦水 1000 mlPH7.2無機(jī)鹽溶液(每升)FeSO4 .7H2 O 1gMgCl.6 H2 O 1gZnSO4. 7H2 O 1gYM

10、S培養(yǎng)基（阿維，井崗產(chǎn)孢）酵母抽提物 4g可溶性淀粉 4g麥芽糖 10gCoCl. .6 H2 O 5mg瓊脂 20g蒸鎦水 1000 mlPH7.2YD培養(yǎng)基酵母抽提物 4g麥芽糖 10g葡萄糖 4gMgCl 2gCaCl 1.5g瓊脂 15g蒸鎦水 1000 mlPH7.2生長因子補(bǔ)充物的使用濃度 天藍(lán)色鏈霉菌1258 、J1501等都是營養(yǎng)缺陷型菌株，培養(yǎng)這些菌株時(shí)一般需向培養(yǎng)基中補(bǔ)加營養(yǎng)因子，使用濃度如表生長因子補(bǔ)充物的使用濃度表化合物儲存液（mg/ml）1終作用濃度（g/ml）組氨酸（Histidine）1050其它氨基酸27.537腺嘌呤，鳥嘌呤，胸腺嘧啶，尿嘧啶1.57.5維生素

11、0.10.51. 儲存液用無菌去離子水配置，8磅滅菌后4oC保存。2. 對于半胱氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，補(bǔ)充光氨酸。第二章 DNA基本操作大腸桿菌質(zhì)粒的抽提苯酚/氯仿溶液抽提法1. 接種5ml LB，37搖床過夜培養(yǎng)（12小時(shí)）2. 離心，3000rpm，5min去上清3. 振蕩混勻沉淀，分裝在2個(gè)離心管中，spin一下，吸去上清，加入150l的溶液I （50mmol/L葡萄糖, 25mmol/L Tris·Cl(PH8.0), 10mmol/L EDTA(PH8.0) 在10lbf/in2（6.895×104Pa）高壓蒸氣下滅菌15min（8磅），貯存于4），劇烈振蕩5分鐘打

12、散菌體（菌體不打散容易在產(chǎn)物中出現(xiàn)較多蛋白）。4. 加入300l溶液II（0.2mol/LnaOH, 1%SDS, 用2倍的溶液現(xiàn)配現(xiàn)用）后立即振蕩混合均勻，處理2分鐘后加入225l溶液III（5mol/L乙酸鉀 60ml，冰乙酸 11.5ml，水 28.5ml）混合均勻，12000rpm離心5min，取上清液中于新的離心管。5. 加120l酸性苯酚/氯仿溶液，振蕩混勻，12000rpm離心5min，再取上清液中于新的離心管中。6. 用120ul氯仿重復(fù)操作5。7. 加等體積的異丙醇或2倍體積的乙醇，混勻，12000rpm離心7min。8. 沉淀用70%乙醇洗滌兩次,每次10min。50烘干后

13、加適量無菌去離子水（ddH2O）溶解，-20保存。氯化鋰抽提法1. 前四部同苯酚/氯仿溶液抽提法（用Solution I II III處理）2. 加等體積的異丙醇，混勻，沉淀DNA，12000rpm離心7min。去上清，盡量去干凈。3. 用少量70乙醇洗一下（洗去異丙醇），離心去盡酒精，50烘干沉淀，用適量ddH2O（100ul）充分溶解（可在50度水浴中助溶）后加入4/5體積的氯化鋰溶液（濃度約10mol/L）處理1min沉淀RNA和蛋白。4. 12000rpm離心5min，取上清液于新的離心管中，用等體積的異丙醇混勻，12000rpm離心8min，去上清。5. 將沉淀用70%乙醇洗滌兩次,

14、每次10min。50烘干后加一定量的無菌去離子水（ddH2O）溶解，-20保存。酶連反應(yīng)一般采用10l反應(yīng)體系：T4連接酶 1l ，連接酶緩沖液1l ，外源片段與載體按DNA 摩爾含量3:1加入即可。如果是粘端連接，則需把外源片段和載體的混合物在50度處理10分鐘使粘端變性，然后立即放入冰中5分鐘。平端連接采用14度，粘端連接采用16度，連接4小時(shí)以上（一般可過夜）。外源片段與載體按DNA 摩爾含量為3:1或外源更多。DNA片段凝膠回收1試劑盒回收 (離心法)（詳見說明書）(1) 在長波紫外燈下切下含有目標(biāo)DNA的瓊脂糖凝膠,用紙巾吸干凝膠表面的液體并切小.計(jì)算凝膠的重量,該重量作為一個(gè)凝膠體

15、積(如1oomg=1ooul)(2) 根據(jù)凝膠的濃度,加DE-A 液凝膠濃度 DE-A溶液體積1.0% 3個(gè)凝膠體積1.5% 4 個(gè)凝膠體積2.0% 5 個(gè)凝膠體積混勻后于75oC加熱,(低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠于45oC加熱),間斷混合,直到凝膠熔化(6-8分鐘).(3) 加0.5個(gè)DE-A體積的DE-B溶液,混勻(是否需調(diào)整PH值,見注意事項(xiàng)1);當(dāng)分離的DNA片段小與400bp 時(shí),加入異丙醇至終濃度為20%;(4) 吸3中的混合液,轉(zhuǎn)移到DNA制備管,3600rpm離心1分鐘.如制備管中有殘留,適當(dāng)提高速度,再離心1分鐘,去濾液;(5) 將制備管置回離心管,加0.5ml W1溶液,3600rp

16、m離心30,棄濾液;(6) 將制備管置回離心管,加0.7ml W2溶液,3600rpm離心30,棄濾液,重復(fù)一次; （W2中含有酒精，應(yīng)保證瓶子密封。）(7) 將制備管置回離心管,最高速度離心1分鐘;(8) 將制備管置潔凈的1.5 ml 離心管中,在DNA制備膜正中央加25ul水或洗脫液,室溫靜置1分鐘.最高速度離心1分鐘洗脫DNA.注意事項(xiàng);1. 此法適合從TAE或TBE瓊脂糖凝膠中回收DNA,用其他緩沖液時(shí),加DE-B溶液后,溶液的PH要調(diào)整到6.5以下.2. 勿將DNA長時(shí)間暴露在高溫下,線型DNA于高溫條件下易水解.勿將凝膠長時(shí)間暴露在紫外燈,減少紫外燈對DNA的損傷.3. 2步驟中的

17、凝膠必須完全熔化,否則將嚴(yán)重影響DNA的回收效率.4. 步驟4中吸回濾液到DNA制備管中再吸附一次,可提高回收效率.將洗脫液或水加熱到60C,可提高回收效率。（重要）5. DNA分子呈酸性,建議在洗脫液中保存。（試劑盒中提供的洗脫液好像對PCR有某種抑制作用。）2 silica回收1 在長波紫外燈下切下含有目標(biāo)DNA的瓊脂糖凝膠, 用紙巾吸干凝膠表面的液體并切小.計(jì)算凝膠的重量;2. 加入2-3倍體積的6M KI或NaI（避光4度保存）;1. 65 oC溫浴, 間斷混合,直到凝膠熔化;2. 加適量的振勻的silica懸液（10ul）充分混勻, 冰上放置15分鐘（或更長）,間斷混合;3. 500

18、0rpm離心3分鐘, 棄上清;4. 加1ml預(yù)冷的NEW buffer（先用100ul打散沉淀，再用900ul混勻），冰上 洗鹽2 分鐘，間斷混合;5. 12000 rpm離心10s, 棄上清;6. 重復(fù)6,7步驟1次;7. 于50 oC烘箱烘干;8. 加10ul的去離子水用槍頭打勻,65 oC水浴15分鐘,間斷混勻;9. 12000 rpm離心10 s，把上清轉(zhuǎn)移到另外潔凈的離心管中;10. 跑膠檢測回收效率.注意事項(xiàng) 4-8步均在冰上操作，防止解吸附，silica只在低溫下對DNA有吸附作用。 NEW Buffer：（100ml）1ml 5M Nacl, 1ml 1M pH7.5 This

19、-HCl, 0.5ml 0.5M EDTA, 50ml 100% ETOH, 去離子水加至100ml。（-20度保存） Silica配法見：TIG January 1995 Vol.11 No. 1. An inexpensive alternative to glassmilk for DNA purifyication.DNA純化用苯酚:氯仿抽提1. 把樣品至置于離心管中,加入等體積的苯酚:氯仿,2. 混勻,使之成為乳濁狀;3. 12000rpm離心, 5 分鐘:4. 用槍頭把水相移到另一離心管中.5. 加入等體積氯仿并重復(fù)246. 用2/3體積的異丙醇（或2倍無水乙醇）,1/10體積的3

20、M醋酸鈉,沉淀10分鐘（-20度長時(shí)間沉淀可提高產(chǎn)量）7. 12000rpm離心5分鐘,棄液體8. 70%的乙醇洗鹽10分鐘，去上清，9. 重復(fù)8一次，再12000rpm離心棄液體.10. 50度烘干.11. 去離子水溶解。LiCl 抽提1把樣品至置于離心管中,加4/5體積10M LiCl2 室溫下靜置1分鐘3 12000rpm離心5分鐘4把液體轉(zhuǎn)移到另一離心管中5.加2/3體積的異丙醇沉淀10分鐘往下的步驟同于上面的8-12E.coil總DNA的提取 1 將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌離心去上清。 2 加500l水重懸浮，加入500l 2% SDS, 混合振蕩約1min，55溫育15min，直到溶液的

21、粘度顯著下降。 3 加入0.1倍體積的3mol/L醋酸鈉（自然pH）。 4 加入150l中性苯酚，混合振蕩均勻后，12000rpm離心5min，移取上清液，棄去白色中間層。 5 用中性苯酚/氯仿重復(fù)抽提直至看不見（或非常少）中間層為止， 6 加入1倍體積的異丙醇（或2倍體積的無水乙醇），上下顛倒混合直至出現(xiàn)白色絮狀DNA 沉淀團(tuán)，用吸頭挑出DNA沉淀團(tuán)。 7 用70%乙醇洗滌DNA沉淀團(tuán)兩次。 8 烘干，溶解DNA沉淀。鏈霉菌質(zhì)粒DNA的小量提取（還需改進(jìn)） 1 將適量的菌體懸浮于500l溶菌酶溶液（2）中，37溫育1hr 左右至完全溶菌， 2 加入500l堿性SDS溶液（0.3mol/L N

22、aOH, 2%SDS），立即振蕩混合完全， 3 打開管蓋，在70放置15min（對大于20kb的質(zhì)粒則最好放在55, 30min），然后于水浴中冷卻至室溫， 4 加入100l酸性苯酚/氯仿溶液，用混合器振蕩至液體徹底混合均勻，12000rpm離心5min，移取上清液，棄去白色中間層。 5 用中性苯酚/氯仿重復(fù)抽提直至看不見（或非常少）中間層為止。 6 在上清液中加入1/10體積的3M NaAc溶液和1倍體積的異丙醇沉淀5分鐘（或2.2倍體積的無水乙醇沉淀1h），12000rpm離心8min， 7用70%乙醇洗滌沉淀兩次, 8干燥后加一定量的TE（d2H2O）緩沖液溶解。另：可使用抽提總DNA的

23、試劑盒，將總DNA與質(zhì)粒DNA一起抽提。去磷酸化處理（詳見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南以及Takara的CIAP使用說明） 注：CIAP一般為原酶，酶量過大會失去粘性末端，因此應(yīng)適當(dāng)減小酶的用量，一般0.5 ul即可。也可減少溫浴時(shí)間，如37,1020min即可。 AT克?。ㄔ斠娬f明書）所用的載體:pGEM-T , pGEM-T Easy Vetor System1. 酶連(1) 體系 10ul standard Reation Positive control Background control 2X Rapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligation 5ul 5ul 5ul

24、pGEM-T , pGEM-T Easy Vetor(50ng) 1ul 1ul 1ulPCR product Xul - -Control insert DNA - 2ul -T4 DNA Ligase(3 weiss untis/ul) 1ul Deionized water to a final volume of 10ul 10ul 10ul(2).反應(yīng) 4oC過夜注 :PCR產(chǎn)物和載體的摩爾比為:(ng of vector x kb size of insert)/(kb size of vector)*(insert: vector ration)=ng of insert 一般外

25、源和載體的摩爾比例為3:1T載體大小為 3bkb 50ng2. 轉(zhuǎn)化(1) 取大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞100ul, 連接產(chǎn)物2-5 ul 加入1.5ml的離心管中,混勻.冰上放置20分鐘.(2) 42oC熱激90秒.(不要搖動(dòng))(3) 立即置冰上3-5分鐘.(4) 加1ml SOC培養(yǎng)基(室溫)(5) 37oC培養(yǎng)1.5小時(shí)(約150rpm搖動(dòng)).(6) 離心,去上清,余下的混勻涂皿(LB/抗生素/IPTG/X-Gal).(7) 37oC培養(yǎng)1624小時(shí),挑白斑. 所用的培養(yǎng)基:SOC培養(yǎng)基胰蛋白胨 2g酵母抽提物 0.5g1M NaCl 1ml1M KCl 0.25ml2M Mg2+儲液 1ml2

26、M 葡萄糖 1ml* Mg2+儲液 MgCl.6H2 O 20.33 gMgSO4.7 H2 O 24.65g加雙蒸水到100ml,過濾滅菌* 葡萄糖過濾滅菌Southern Blot轉(zhuǎn)膜1. DNA經(jīng)酶切后，用Agarose凝膠電泳分離，切去多余的膠塊并在右下角切去一角以便于識別方向，接著EB染色并拍照。（注意：TAE需新配，凝膠濃度視片段大小而定，一般為0.8%1.0%，電壓150v/cm）2. 拍照后的凝膠先用無菌的去離子水輕輕搖晃，洗2次，5min/次。3. 去嘌呤：在室溫下，把凝膠置于盛有0.25M HCl的大平皿中輕輕搖動(dòng)，直到溴酚藍(lán)由藍(lán)變黃（如果雜交的目標(biāo)片段小于5kb，此步可省

27、略），再用無菌水搖動(dòng)洗5min 。4. DNA變性：把凝膠放入盛有變性液的平皿中，輕輕搖動(dòng)，洗2次，15min/次，再用無菌水洗5min。5. 中和：把凝膠放入盛有中和緩沖液的平皿中，輕輕搖動(dòng)，洗2次，15min/次。6. 把凝膠放入盛有20x SSC的平皿中，平衡10min。7. 印跡：用一玻璃板橫放于盛有20x SSC的搪瓷盤上作為橋，把一張用20x SSC浸潤的3MM 的Whatman濾紙鋪在玻璃板上，其兩端放入瓷盤的20x SSC液體中，用玻璃棒趕盡氣泡。把凝膠（點(diǎn)樣孔面朝下）放在濾紙上，避免氣泡產(chǎn)生，凝膠周圍用膠板封住。剪一張比凝膠略大的帶正電的尼龍膜平鋪在凝膠上，避免氣泡產(chǎn)生，（使

28、凝膠濕潤再放膜）。再在尼龍膜上放兩張與尼龍膜大小一致的3MM濾紙，然后放一疊吸水紙?jiān)跒V紙上，再在吸水紙上一平板，平板上放一500g的重物，印跡時(shí)間大于2h。8. 紫外交聯(lián)：取下重物及吸水紙拿出尼龍膜放在一濾紙上，與膠接觸面朝上，放入紫外膠膜儀中膠聯(lián)。9. 用無菌水洗膜10min，如不立即雜交，自然烘干保存。預(yù)雜交及雜交1. 裁剪一張比尼龍膜稍大的雜交袋，把尼龍膜放入袋中，用封口機(jī)先封住三邊，放入10ml預(yù)雜交液，趕盡氣泡，封口。把雜交袋放入雜交筒中，預(yù)雜交時(shí)間大于4h,溫度65C 。 2. 加探針：把探針先煮沸15min后立即放入冰中，至少10min ，然后把探針加入1ml預(yù)雜交液中，剪去雜交

29、袋一角，除去絕大部分預(yù)雜交液，加入雜交液，除盡氣泡封口，放入雜交筒中65C 雜交620h。洗膜1. 用2 x SSC, 0.1%SDS室溫下輕輕搖動(dòng)洗2 次，5min/次2. 用0.5 x SSC, 0.1%SDS在 68C條件下洗膜 2 次，5min/次，輕輕搖動(dòng)（可在雜交筒中進(jìn)行）Dig檢測1. 洗膜后，用washing buffer 搖動(dòng)潤洗 5min。2. 用100ml Blocking solution 溫育30min，輕輕搖動(dòng)。3. 用20ml Antibody solution 溫育30min，輕輕搖動(dòng)。4. 用washing buffer 輕輕搖動(dòng)洗2 次，每次15min。5.

30、 在20ml Detection buffer 中平衡 5min。6. 把膜轉(zhuǎn)到用鉑紙包裹的盛有新配置的Colorsubtrate solution的平皿中顯色。7. 用PH 8.0 TE終止反應(yīng)。第三章 PCR及相關(guān)技術(shù)PCR不同公司不同的酶要求的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件會有不同，PCR反應(yīng)可參考該酶的產(chǎn)品說明上的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。一般的反應(yīng)體系如：引物(50pmol/l)各1l 反應(yīng)終濃度:各1pmol/l模板(約30ng/l)1l約30ngBuffer(10´, 含Mg2+)5l1´dNTPs(10mM)1l0.2M高溫聚合酶(5U/l)0.21l15UddH2O總體積5

31、0lPCR反應(yīng)參考程序：時(shí)間Step 1 預(yù)變性 95-96 3-8min Step2 變性 94 50secStep3 復(fù)性 50secStep4 延伸 72 Step5 2、3、4步驟循環(huán)（25次左右）；Step6 延伸 72 10 min4結(jié)束反應(yīng)（4度長時(shí)間保溫對PCR儀有較大損傷，一般不超過1小時(shí)便及時(shí)取出，絕對不允許過夜保溫）。注：  引物應(yīng)該用專門的軟件（如Primer Premier）認(rèn)真設(shè)計(jì)，注意兩條引物的Tm值大致相等，GC含量較均一，引物自身以及之間不形成強(qiáng)的二級結(jié)構(gòu)，特別是引物的3 端，引物不和模板其他位置形成強(qiáng)的配對（主要看引物3端）。  MgCl

32、2濃度依不同的模板和引物而定。MgCl2的濃度對PCR結(jié)果影響很大。  鏈霉菌的PCR因模板的GC含量高，可加DMSO（能降低復(fù)性溫度）其濃度可在010%之間變化。  模板為環(huán)形質(zhì)粒時(shí)若一次沒有擴(kuò)增出來，可以考慮先用酶將其切成線性再作。  對高GC含量的模板，預(yù)變性的時(shí)間也可適當(dāng)延長，甚至先在沸水中煮5分種，然后迅速放入冰中。如果使用預(yù)變性溫度高或時(shí)間長，一般要使用“熱啟動(dòng)”，即在預(yù)變性后再加入酶，這樣一是可以保護(hù)酶，二是可以避免低溫時(shí)酶的非特異性擴(kuò)增。  現(xiàn)在的PCR儀一般都有“熱蓋”裝置，可以代替原來使用的礦物油，避免PCR過程中水份蒸發(fā)到管蓋上。&

33、#160; 復(fù)性溫度依引物Tm值及引物與模板的匹配程度而定，提高復(fù)性溫度可提高擴(kuò)增的特異性，而當(dāng)無擴(kuò)增條帶時(shí)，可適當(dāng)降低復(fù)性溫度。  延伸時(shí)間可根據(jù)擴(kuò)增區(qū)域的長度確定，擴(kuò)增區(qū)域越長，延伸時(shí)間越長。不同的聚合酶的延伸速度不一樣，具體看說明書，一般高保真聚合酶平均每分鐘延伸600bp，普通Taq酶每分鐘延伸1kb。  根據(jù)不同需要使用不同的聚合酶，尤其當(dāng)用于擴(kuò)增表達(dá)的基因序列時(shí)，一定要使用高保真的酶，作普通的PCR驗(yàn)證時(shí)就可用普通Taq酶。以鏈霉菌或其他高GC含量的DNA作模板時(shí)，由于GC含量越高，模板和引物的二級結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，延伸和配對越難，PCR反應(yīng)不好做，可以暫時(shí)（2003

34、年7月）用TaKaRa的La Taq酶作普通的PCR，保真度不敢保證，但擴(kuò)增效果很好。酶的用量可參考說明書，并不是越多越好。  LA Taq酶的GC buffer往往能用于別的酶(如普通Taq酶或高保真酶probest)，使它們也能很容易地?cái)U(kuò)出高G+C的模板來。PCR重組（詳見PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南p429 重疊延伸技術(shù)）注：1. 兩條模板的量無需太大，因盡量保證1:1。 2. 保證引物之間不會有干擾 3. 四條引物的PCR重組比三條引物的 PCR橋重組容易操作。即分別設(shè)計(jì)引物對兩個(gè)模板進(jìn)行擴(kuò)增，使擴(kuò)增后兩個(gè)模板有35-40bp的重疊序列，分別回收兩個(gè)模板在只有兩條外引物的條件下進(jìn)行常規(guī)

35、PCR.PCR定點(diǎn)誘變（DpnI法）1. 引物設(shè)計(jì)：每條引物都要攜帶有所需的突變位點(diǎn)，引物一般長2545bp，設(shè)計(jì)的突變位點(diǎn)需位于引物中部。2. PCR反應(yīng)：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶 ；循環(huán)次數(shù)少，一般為12個(gè)循環(huán)。 反應(yīng)體系：10x pyrobest Buffer 5 uldNTP Mixture(10mM) 1ul 模板DNA(550ng) 1ulprimer 1 (125ng) 1ulprimer 2 (125ng) 1ulpyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5U/ul) 0.25ul加無菌蒸餾水至 50ul 3. PCR產(chǎn)物沉淀純化：加1/

36、10 體積的醋酸鈉，1倍體積的異丙醇，混勻置冰上（或-20C冰箱）5min，離心棄上清，7075%乙醇洗鹽兩次，烘干后溶于無菌水中。（此步可省略，直接用 DpnI酶切）4. DpnI酶切： Buffer 2ul BSA（100） 0.2ul DNA x ul DpnI 0.5ul 加無菌去離子水至 20ul 30C酶切 14 h ；65C 水浴15min 終止反應(yīng)。5. 將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株，利用抗生素篩選突變子。6. 測序驗(yàn)證第四章 基因片段轉(zhuǎn)移技術(shù)大腸桿菌CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞及DNA轉(zhuǎn)化1. 挑取保存的感受態(tài)細(xì)胞在LA平板上劃單菌落。2. 挑取長好的單菌落接入到裝有5m

37、l LB的universal瓶中，搖床過夜培養(yǎng)。3. 從universal中取1ml過夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)接于裝有20ml LB（用SOC或SOB可提高感受態(tài)效率）的250ml三角瓶中，培養(yǎng)2.53小時(shí)至OD6000.64. 將培養(yǎng)物倒入50ml已預(yù)冷的大離心管中，置于冰上待冷卻5. 離心，4.5000rpm.3分鐘6. 倒去上清液，先加少量0.1M CaCl2 ，打散沉淀，再加10ml，混勻，于冰上放置至少30分或過夜。7. 離心，4.5000rpm.3分鐘8. 棄上清，加1ml 0.1M CaCl2，在冰上輕輕打散沉淀，即可使用。以上步驟均需注意無菌和低溫操作。DNA轉(zhuǎn)化1. 取100l感受態(tài)細(xì)胞

38、和5l的酶連產(chǎn)物或1-2ul質(zhì)粒混合2. 冰上靜置30分鐘3. 42熱激90秒，然后在冰上放置5min4. 加0.75ml LB培養(yǎng)基，在37度搖床上培養(yǎng)45分鐘。然后3600轉(zhuǎn)離心2分鐘，去掉大部分上清。（此步不作為快轉(zhuǎn)，作為慢轉(zhuǎn)，慢轉(zhuǎn)可提高效率，有些抗生素如Kan篩選時(shí)用慢轉(zhuǎn)較好）5. 涂布于有抗生素的篩選平板，一般12小時(shí)可有轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。大腸桿菌質(zhì)粒的快速檢測1. 從轉(zhuǎn)化子平板上挑取單菌落，在另一平板上劃小方塊，37擴(kuò)大培養(yǎng)12小時(shí)2. 刮取適量（偏少）的菌體懸浮于30l快檢液I溶液中振蕩均勻3. 加入15l堿性SDS溶液（0.3mol/L NaOH, 2%SDS）（天冷時(shí)先使該溶液預(yù)熱

39、），立即振蕩混合完全。4. 在70放置15min（對大于20kb的質(zhì)粒則最好放在55, 30min）水浴時(shí)間不宜過長。5. 冷卻至室溫，直接上樣跑瓊脂糖凝膠電泳檢測（如果菌體過多，則點(diǎn)樣時(shí)會發(fā)現(xiàn)樣品很粘，所以掌握不好時(shí)可以在第4步之后加上一部5ul苯酚抽提，離心的步驟。） 如果沒有用苯酚處理，看膠時(shí)會發(fā)現(xiàn)很明顯的總DNA的條帶，但不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察。 點(diǎn)樣時(shí)注意點(diǎn)上質(zhì)粒載體質(zhì)粒對照，一般在快檢時(shí)會出現(xiàn)質(zhì)粒CCC構(gòu)型的條帶，有時(shí)也會出現(xiàn)OC構(gòu)型的。 快檢液I：0.3M蔗糖，25mM pH8.0 Tris-HCl，0.5mM EDTA，0.02溴甲酚綠接合轉(zhuǎn)移（詳見英文手冊249頁）1.帶有or

40、iT的目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌ET12567( pUZ8002),得到轉(zhuǎn)化子;2. 將轉(zhuǎn)化子的過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接在LB中，在合適抗生素下,37 oC培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子,到合適濃度(OD600:0.4-0.6)收集菌體;3. 用等體積新鮮的LB洗滌菌體兩次(洗掉抗生素), 0.1倍體積的LB懸浮.備用;4. 鏈霉菌孢子的熱激和預(yù)萌發(fā)（一般的接合轉(zhuǎn)移只須做熱激） (1)新鮮孢子懸浮于5ml 0.05M PH8.0 的TES; (2)50ºC水浴熱激10分鐘; (3)冷卻到室溫后加入等體積2X孢子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基; (4)37ºC搖床分別培養(yǎng)2-小時(shí); （5）離心收集孢子并重新懸浮于適量的水或T

41、ES中; （6）在振蕩器上打散孢子或只作熱激按下面步驟：將適量的孢子加入1ml SOC或2倍YT培養(yǎng)基，50度處理10分鐘，離心，去大部分上清。5. 按(1*e-8)：(1*e-9)與3中的大腸桿菌混勻(不一定)6. 30ºC培養(yǎng)13-20小時(shí)左右用適當(dāng)濃度的抗生素和萘啶酮酸（抑制大腸桿菌）覆蓋6. 30ºC培養(yǎng)數(shù)天（一般2天）可得到接合轉(zhuǎn)移子.7. 挑選接合轉(zhuǎn)移子到含適當(dāng)抗生素和萘啶酮酸的平板上, 驗(yàn)證;（作篩選雙交換菌株時(shí)繼續(xù)作下面步驟）8. 直接將得到的接合轉(zhuǎn)移子作影印，尋找單抗的菌株即為雙交換菌株。如果得不到，就要通過單交換菌株的松弛培養(yǎng)來得到雙交換菌株。得到的單交

42、換接合轉(zhuǎn)移子劃線于合適的培養(yǎng)基(含萘啶酮酸，不含別的抗生素)松弛培養(yǎng);9. 得到的孢子或菌體稀釋涂皿或劃單菌落（for Bld菌株）, 影印篩選雙交換.注意事項(xiàng):1 不同的孢子熱激的溫度和時(shí)間不同,預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間不同.2 不同的鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移所用的培養(yǎng)基不同預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基Difco 酵母膏 1% Difco 酪蛋白氨基酸 1% CaCl2 0.1M(需配制5M的原液,分開滅菌后加到酵母膏/酪蛋白氨基酸溶液中去)鏈霉菌原生質(zhì)體的制備 1. 在裝有不銹鋼彈簧的三角瓶中加入250ml的YEME+TSBY(1:1)(一定要加Glycine)，接種100ul的孢子懸液，于30度搖床中培養(yǎng)3640 hr（視具

43、體情況，有時(shí)培養(yǎng)24h已足夠。）。2. 將培養(yǎng)物倒入universal中，用無菌水涮洗三角瓶，收集洗液于同一universal中，然后3000 rpm離心10 min。3. 棄上清，將菌絲體懸浮于15 ml的10.3%的蔗糖溶液中，3000 rpm離心10 min，棄上清。同此法洗兩次。4. 取1 ml菌絲體，加入4 ml的溶菌酶溶液（溶菌酶母液為50mg/ml P Buffer，終濃度為2 mg/ml，用P Buffer稀釋），于30度水浴3060 min（間隔七八分種輕輕搖動(dòng)）至上清呈乳狀。5. 加入5 ml的P Buffer并用5 ml的吸管吹吸幾次，繼續(xù)溫浴10 min。（使大量的原生

44、質(zhì)體釋放出來。）6. 用裝有脫脂棉的試管過濾，濾液轉(zhuǎn)入無菌干凈的universal中，3000 rpm離心7 min（不用brake檔防止其破裂）。原生質(zhì)體沉淀呈黃色。7. 棄上清 ，輕柔打散原生質(zhì)體，用P Buffer洗兩次（洗去溶菌酶）。每次仍使用3000 rpm離心7 min。（此步可省略）8. 棄上清，用槍將原生質(zhì)體打散，分裝，于-70度保存。注：1. P緩沖液（原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化用）（Okanishi, 1974） 蔗糖103g，K2SO4 0.25g, MgCl2·6H2O 2.02g, 微量元素溶液 2ml，蒸餾水 800ml 滅菌后每80ml上述溶液中加入：0.5% KH2

45、PO4 1ml, 3.68% CaCl2·2H2O 10ml, 5.73% TES 緩沖液(pH7.2) 10ml 2溶菌時(shí)間不能過長，否則會使原生質(zhì)體破裂。離心后若看到很粘的絮狀物，則說明原生質(zhì)體破裂。鏈霉菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 1. 將最多5 ul的DNA（質(zhì)?；蛎高B產(chǎn)物）加于已經(jīng)裝有50 ul原生質(zhì)體的指型管（1.5 ml）的管壁上（不與原生質(zhì)體接觸）。2. 吸取200ul的25% PEG4000（PEG應(yīng)先滅菌，再用P Buffer配置），將DNA沖入原生質(zhì)體中，小心抽吸幾次使之混勻。3. 將混合物涂布于R5平板上（不含任何抗生素）。4. 30度培養(yǎng)1420 hr后（待原生質(zhì)體再生

46、后，即平板呈霧狀），用含有適當(dāng)抗生素的1 ml無菌水溶液覆蓋。5. 再培養(yǎng)12 d后，可以看到小的轉(zhuǎn)化子菌落長出。PCR-Targeting技術(shù)中E.coli電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備及電轉(zhuǎn)化1. 將天藍(lán)色鏈霉菌庫斯質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BW25113/pIJ790*菌株中，此步可用常規(guī)的CaCl2 法。（pIJ790帶有cat基因和對溫度敏感的復(fù)制區(qū)，培養(yǎng)時(shí)溫度要嚴(yán)格控制在30C以下）2. 培養(yǎng)含庫斯質(zhì)粒的BW25113/pIJ790菌株：從平板上挑取大腸桿菌單菌落接入5ml 含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp的SOB-MgSO4 （不加MgCl2 的SOB中加入MgSO4至20mM

47、）中，30C搖床培養(yǎng)過夜。3. 取一部分過夜培養(yǎng)物至25ml新鮮的SOB-MgSO4 培養(yǎng)基（含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp）中，菌體終濃度為1% ，添加250ul 1M L-阿拉伯糖誘導(dǎo)/red 重組系統(tǒng)。4. 30C ，200rpm搖床培養(yǎng)3-5h 至OD6000.6 。5. 將培養(yǎng)物倒入預(yù)冷的30ml離心管中，冰上置10min(從此細(xì)胞溫度要保持在04C)。4000rpm 4C離心 5min。6. 棄掉上清，加1ml預(yù)冷的10%甘油，在冰上打散沉淀，再加9ml 10%甘油,搖勻。7. 4000rpm 4C離心 5min，棄掉上清，用10%甘油洗滌。重復(fù)上面操作：4000rpm 4C離心5min，盡量棄去上清，用殘留液將細(xì)胞打散。（感受態(tài)細(xì)胞濃度越高電轉(zhuǎn)效果越好）8. 在預(yù)冷的0.2cm的電轉(zhuǎn)化杯中混合50ul感受態(tài)細(xì)胞與1-2ul PCR產(chǎn)物（經(jīng)純化，可盡量濃，但不能加得過多），混勻后立即電擊，電擊條件：200,25uF,2.5kv, 電擊結(jié)果為4.54.9ms 較理想。（電轉(zhuǎn)化杯在70乙醇中保存，用前先在無菌環(huán)境下用無水乙醇洗一下，再吹干，放冰上預(yù)冷，無水乙醇能加快吹干的速度。也可以選擇0.1cm的電轉(zhuǎn)化杯，但電擊的參數(shù)就得變?yōu)椋?.8 kV，？,?uF）9. 立即加1ml預(yù)冷的SOC，37C誘導(dǎo)培養(yǎng)40min（如需在同一庫斯質(zhì)粒上中斷基因，