原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法探討[1] 3

1、心肌細(xì)胞的分離及培養(yǎng)器械：飯盒、燒杯、彎頭解剖剪（2）、小鑷子（2）、平皿（4）、毛玻片、濾網(wǎng)、離心管（15ml）、移液管、培養(yǎng)瓶、廢液缸、PE手套、橡膠手套、冰盒溶液：PBS、DMEM（含血清）、DMEM（free）、胰酶動(dòng)物：小鼠準(zhǔn)備：用酒精棉球擦拭臺(tái)面后把物品擺放好，開紫外線燈照30分鐘后開鼓風(fēng)機(jī)吹至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，提前半小時(shí)將培養(yǎng)液、胰酶37溫浴。培養(yǎng)過程：1、 兩個(gè)圓皿中加入5ml的PBS培養(yǎng)液，將小鼠浸入70酒精<5min，用小剪子及小鑷子開胸取心。2、取出的心放在一個(gè)裝有PBS的平皿中，剔除心臟周邊的血凝及纖維組織。3、PBS再?zèng)_洗后，轉(zhuǎn)移至另一個(gè)預(yù)先裝好5ml胰酶的平皿中，用剪

2、子將平皿中的心臟剪成1mm3的碎塊，倒入15ml離心管中，加入3-5ml胰酶沖洗平皿轉(zhuǎn)移到離心管中。4、放入水浴鍋中，溫和搖動(dòng)，10min，自然沉淀，小心吸取上清，上清中主要是血紅細(xì)胞、細(xì)胞碎屑和死細(xì)胞。5、再將8-10ml胰酶加入盛有組織的離心管，吸管輕輕吹打1min，消化10min，小心轉(zhuǎn)移上清+2ml DMEM至另一離心管中，細(xì)胞懸液離心，1000轉(zhuǎn)×10min，棄上清，加培養(yǎng)基為管1。6、重復(fù)第5步，3-8次，直至至組織塊消化為止。7、將多次細(xì)胞懸液經(jīng)100目濾網(wǎng)過濾，混合。8、加入1ml DMEM重懸，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。9、培養(yǎng)1-1.5小時(shí)，收集培養(yǎng)液中的非貼壁細(xì)胞，小

3、心不要晃動(dòng)。10、顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)，細(xì)胞密度調(diào)至5×105-6×105細(xì)胞/ml。11、4-6小時(shí)后，用培養(yǎng)基輕輕沖洗2次，加入培養(yǎng)基繼續(xù)孵育過夜。或從第5步起，加胰酶10-15ml，30min 37水浴，每5min用吸管吹打5ml完全培養(yǎng)基終止。原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法探討山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.Q99C03）邵偉 （山東省千佛山醫(yī)院 山東濟(jì)南250014）周蘇寧 邵建華 （山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院 山東省立醫(yī)院 山東濟(jì)南250021）摘要 探討培養(yǎng)Wister新生大鼠心肌細(xì)胞的可靠方法。采用心肌組織塊差別消化結(jié)合化學(xué)純化的培養(yǎng)方法，通過倒置顯微鏡、HE染色、透射電鏡、臺(tái)盼籃

4、、免疫細(xì)胞化學(xué)，鑒定心肌細(xì)胞生長(zhǎng)情況及純度。結(jié)果細(xì)胞生長(zhǎng)迅速、自行搏動(dòng)，細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞內(nèi)肌絲、線粒體清晰；細(xì)胞成活率達(dá)94.6；肌動(dòng)蛋白（HHF35）經(jīng)S-P法胞漿呈現(xiàn)棕褐色陽(yáng)性表達(dá)，純度達(dá)96.4。表明該方法培養(yǎng)的心肌細(xì)胞生長(zhǎng)迅速、活性好、純度高。關(guān)鍵詞 心肌細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；大鼠Explore a method of neonatal rat myocardial cells in cultureZHOU Suning, SHAO Jianhua. Medical college of Shandong university, the peoples hospital of Shando

5、ng province, Jinan 250021, ChinaAbstract To explore a reliable method of neonatal rat myocardial cells in culture. The plots of myocardial tissue from neonatal Wister rat were cultured and purified with the method of differential enzyme and 5-Bromodeoxyuridine-treatment. Microscope, transmission ele

6、ctron microscope, HE stains, Trypan blue stains, immunohistochemical test were determined to identification the cell. The results of myocardial cells grow rapidity, automaticity, shape intact, the cell of filament and mitochondria clearly. The cell viability was up to 94.6% by Trypan blue stains. Th

7、e cell purity was up to 96.4% by Actin （HHF35）of Streptavidin peroxidase conjunction method. This method of myocardial cells in culture was grown up rapidity, lively well, high purity. Key words Myocardial Cells; Culture; Rat隨著心臟病發(fā)病率逐年升高， 有關(guān)心肌疾病的研究越來越受到重視，快速、理想的心肌細(xì)胞培養(yǎng)是深入研究的前提，為此我們進(jìn)行了原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法的探討，并對(duì)

8、其進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)報(bào)道如下。1材料與方法1.1 心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 取24h內(nèi)Wister大鼠，在其心臟跳動(dòng)時(shí)將心臟取下，小心剪取心室組織，用冰PBS液清洗干凈后，將組織反復(fù)剪成0.51mm3的小塊，加23滴細(xì)胞培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打后分次吸取組織塊懸液，將其均勻排在75ml培養(yǎng)瓶底壁上，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入含150ml/L胎牛血清、0.1mmol/L 5-溴脫氧核苷 (5-Bromodeoxyuridine；Brdu)的高糖DMEM 3ml培養(yǎng)液，做好標(biāo)記置于37恒溫培養(yǎng)箱中3040min后，待組織塊略干能貼于瓶壁上，再緩慢、輕輕地將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)液浸泡組織塊，繼續(xù)靜止培養(yǎng)。每天小心

9、取出培養(yǎng)瓶置于相差顯微鏡下進(jìn)行觀察，2h后就可見組織塊周邊有細(xì)胞伸出，1天后周圍爬滿細(xì)胞，34天后多數(shù)連接成片，可進(jìn)行傳代，用吸管輕吹組織塊使其脫落移出，加入0.1胰蛋白酶1ml，放置倒置顯微鏡下觀察，約35min后部分細(xì)胞呈圓形，在瓶上做好標(biāo)記，棄去胰蛋白酶液加入含有0.1mmol/L Brdu培養(yǎng)液510ml在標(biāo)記處反復(fù)吹打，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞5×105/ml，根據(jù)需要傳至培養(yǎng)瓶（板）中培養(yǎng)，多數(shù)34天后長(zhǎng)成致密單層可用于實(shí)驗(yàn)。1.2 培養(yǎng)心肌細(xì)胞的鑒定1.2.1 心肌細(xì)胞形態(tài)觀察 常規(guī)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化、心肌細(xì)胞搏動(dòng)情況，并隨時(shí)用Leica DMIRB Microsyste

10、ms記錄（Leica, 德國(guó)）；取培養(yǎng)心肌細(xì)胞單層飛片行蘇木素伊紅染色（HE染色）后，光學(xué)顯微鏡下觀察并照片。培養(yǎng)細(xì)胞用0.1胰蛋白酶消化后，離心，沉淀固定，送電鏡室制片，透射電鏡觀察并攝片。1.2.2 細(xì)胞成活率的測(cè)定 取細(xì)胞懸液，并作適當(dāng)稀釋106/ml，按9:1加入0.4臺(tái)盼籃溶液混勻，顯微鏡下用計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。1.2.3 鼠抗人肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（HHF35）的檢測(cè) 采用鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶連接法（Streptavidin peroxidase conjunction method, 簡(jiǎn)稱S-P法）。具體步驟如下：?jiǎn)螌蛹?xì)胞飛片清洗后95酒精固定30min；PBS洗5m

11、in×3，滴加3H2O2室溫孵育10min；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min，正常山羊血清工作液封閉，室溫孵育10min；滴加適當(dāng)比例的一抗工作液，37孵育4過夜；PBS沖洗，5min×3，滴加生物素標(biāo)記二抗工作液，室溫孵育20min；PBS沖洗，5min×3，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育20min；PBS沖洗，5min×3，滴加新鮮配制的DAB顯色液顯色510min；蘇木素復(fù)染57min，1%稀鹽酸分化1min，自來水返藍(lán)；酒精剃度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并攝片。2 結(jié)果2.1 心肌細(xì)胞形態(tài) 倒置顯微鏡下可見傳代細(xì)胞未貼壁

12、呈圓形，貼壁后生長(zhǎng)逐漸呈梭形、多角形，胞核12個(gè)、呈圓形、具有12清晰的核仁，細(xì)胞大小均勻，生長(zhǎng)迅速，單個(gè)細(xì)胞自行蠕動(dòng)，當(dāng)生長(zhǎng)成片后可見呈島嶼狀搏動(dòng)，搏動(dòng)頻率130150次/分。培養(yǎng)心肌細(xì)胞HE染色細(xì)胞形態(tài)飽滿、細(xì)胞膜完整；透射電鏡觀察細(xì)胞完整，胞膜皺褶整齊，細(xì)胞中肌絲、線粒體清晰、分布均勻，細(xì)胞核完整。（圖13）2.2 心肌細(xì)胞成活率測(cè)定 計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，27個(gè)染色陽(yáng)性，成活率94.6。2.3 肌動(dòng)蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)鏡下觀察 肌動(dòng)蛋白HHF35經(jīng)S-P法培養(yǎng)的心肌細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)深淺不一的棕褐色陽(yáng)性表達(dá)，任選5張飛片，分別計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)96.4（圖4）；而用PBS代替一抗其結(jié)果

13、均為陰性。3 討論構(gòu)成心臟的細(xì)胞中約有80為心肌細(xì)胞外，還有主要為成纖維細(xì)胞等非心肌細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)所取組織塊盡量細(xì)小外，并一定要沖洗干凈，放入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)時(shí)培養(yǎng)液不要過多易于貼壁，翻轉(zhuǎn)瓶時(shí)間不要過長(zhǎng)避免干涸，采用此種方法主要是便于心肌細(xì)胞迅速貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)液中加入Brdu抑制成纖維細(xì)胞DNA合成達(dá)到抑制增生的目的1；傳代時(shí)先吹去組織塊，然后依據(jù)心肌細(xì)胞的特性，快消化、輕消化，可看到細(xì)胞形態(tài)小的心肌細(xì)胞變圓，而細(xì)胞形態(tài)大的成纖維細(xì)胞仍伸展，立即中止消化迅速傳代，仍用含有Brdu的培養(yǎng)液培養(yǎng)，34天后細(xì)胞形成致密單層即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。此種方法培養(yǎng)的細(xì)胞可能與含有少量成纖維細(xì)胞促進(jìn)心肌細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)，有研究報(bào)

14、道2成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液有提高心肌細(xì)胞貼壁率及搏動(dòng)率的作用，表明有促進(jìn)心肌細(xì)胞搏動(dòng)和生長(zhǎng)的因子，也提示成纖維細(xì)胞與心肌細(xì)胞間可能存在著某種信號(hào)聯(lián)系。我們也觀察到培養(yǎng)的心肌細(xì)胞成片搏動(dòng)長(zhǎng)達(dá)20多天。心肌細(xì)胞搏動(dòng)表明具有自律性的心肌細(xì)胞活性和狀態(tài)良好；心肌細(xì)胞HE染色觀察形態(tài)和貼壁情況；透射電鏡觀察可觀察心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)肌絲和線粒體活性等3；對(duì)臺(tái)盼藍(lán)攝取反映細(xì)胞膜損傷和細(xì)胞死亡；肌動(dòng)蛋白HHF35免疫細(xì)胞化學(xué)反映在細(xì)胞漿中陽(yáng)性表達(dá)，可間接反映心肌細(xì)胞純度。通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)我們體會(huì)到：要選擇24h內(nèi)的新生鼠，而以12h內(nèi)培養(yǎng)效果最佳。嚴(yán)格無(wú)菌操作，打開胸腔后迅速摘取跳動(dòng)的心臟，操作要熟練快捷。細(xì)胞貼壁

15、生長(zhǎng)成致密單層后盡早進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，否則會(huì)降低心肌細(xì)胞的純度，不利于對(duì)單純心肌細(xì)胞的研究。傳代消化時(shí)胰蛋白酶濃度不要過高，時(shí)間不要過長(zhǎng)，最好在顯微鏡下觀察，以免較牢貼壁的非心肌細(xì)胞浮起。選用飛片要薄，要緊貼培養(yǎng)瓶（板）不要留有氣泡，可滴加少許培養(yǎng)液后再放置飛片。要注意培養(yǎng)液的穩(wěn)定性，適量的血清濃度，適宜的pH。只有這樣才能培養(yǎng)出生長(zhǎng)迅速、純度高、活性好的心肌細(xì)胞。4 參考文獻(xiàn)1. Karliner JS, Honbo N, Epstein CJ, et al. Neonatal mouse cardiac myocytes exhibit cardioprotection induced by hy

16、poxic and pharmacologic preconditioning and by transgenic overexpression of human Cu/Zn superoxide dismutase. J Mol Cell Cardiol, 2000 Oct; 32(10):1779-86. 2. Suzuki T, Tsuruda A, Katoh S, et al. Purification of endothelin from a conditioned medium of cardiac fibroblastic cells using beating rate assay of myocytes cultured in a serum-free medium. J Mol Cell Cardiol. 1997 Aug; 29(8):2087-93. 3. Rohr S, Scholl