CRISPR基因編輯技術(shù)學(xué)習(xí)課程

1、 自從證明DNA是遺傳物質(zhì)以后，人類就開始了通過改變DNA來改造生物體生理機理和功能的嘗試。 1973 1973年，斯坦利年，斯坦利NN科恩科恩(Stanley N. Cohen)(Stanley N. Cohen)和赫伯特和赫伯特WW博耶博耶(Herbert W. Boyer)(Herbert W. Boyer) 成功將蛙的成功將蛙的DNADNA插入到細菌中。插入到細菌中。 20 20世紀世紀7070年代，基因泰克年代，基因泰克(Genetech)(Genetech)公司對大腸桿菌進行基因改造，使其帶有一公司對大腸桿菌進行基因改造，使其帶有一個人源基因個人源基因( (這個基因是人工合成的這個

2、基因是人工合成的) )，最后生產(chǎn)出治療糖尿病的胰島素。，最后生產(chǎn)出治療糖尿病的胰島素。 19741974年，加利福尼亞州索克生物研究所年，加利福尼亞州索克生物研究所(Salk Institute for Biological Studies)(Salk Institute for Biological Studies)的的Rudolf JaenischRudolf Jaenisch通過將通過將SV40 SV40 病毒的病毒的DNADNA注射到小鼠的囊胚中注射到小鼠的囊胚中, ,培育出了第一只轉(zhuǎn)基培育出了第一只轉(zhuǎn)基因小鼠。因小鼠。第一頁，編輯于星期五：十五點 十分?；蛲蛔兗夹g(shù)：物理誘變、化學(xué)誘

3、變基因突變技術(shù)：物理誘變、化學(xué)誘變轉(zhuǎn)基因技術(shù)：轉(zhuǎn)基因技術(shù)：T-DNAT-DNA插入插入RNARNA干擾技術(shù)：干擾技術(shù)：dsRNAdsRNA、Artificial miRNAArtificial miRNA核外遺傳技術(shù)：質(zhì)粒、人工染色體核外遺傳技術(shù)：質(zhì)粒、人工染色體同源重組技術(shù)：同源重組技術(shù)：e.g. e.g. 傳統(tǒng)的基因敲除小鼠傳統(tǒng)的基因敲除小鼠1.1. 無法控制突變位點2.2. 不能精確控制外源基因插入位點3.3. 對靶基因抑制不徹底、不特異4.4. 難以穩(wěn)定的遺傳5.5. 費時費力費錢，難以大量應(yīng)用并引起一系列生物倫理的問題現(xiàn) 狀第二頁，編輯于星期五：十五點 十分。第三頁，編輯于星期五：十

4、五點 十分。基因組編輯技術(shù) 基因組編輯技術(shù)（genome editing）是一種可以在基因組水平上對DNA序列進行改造的遺傳操作技術(shù)。也稱為基因打靶（Gene targeting）。 技術(shù)的原理是構(gòu)建一個人工內(nèi)切酶，在預(yù)定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細胞內(nèi)的DNA修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)過程中會產(chǎn)生突變，從而達到定點改造基因組的目的。第四頁，編輯于星期五：十五點 十分。歷史p 1993年前ZFN就已開始出現(xiàn)，迄今已發(fā)展了20多年才有今天的成就；p 2009年底出現(xiàn)的TALEN似乎一夜之間呈現(xiàn)出取代ZFN的架勢；p 2012年底CRISPR/Cas已顯現(xiàn)出取代TALEN的巨大潛力，在2013年成

5、為現(xiàn)實。榮譽1. 2011年：ZFN， TALEN和Meganuclease2011年度方法（Nature Methods）2. 2012年：TALEN 2012年十大突破（Science）3. 2013年：CRISPR/Cas被認為是諾貝爾獎級別的成果，華人科學(xué)家張峰已因此獲得生物醫(yī)學(xué)大獎?；蚪M編輯技術(shù)應(yīng)用p 基因組巡航導(dǎo)彈，分子剪刀，DNA外科醫(yī)生p 定點突變，定點修飾（包括得到轉(zhuǎn)基因），轉(zhuǎn)錄調(diào)控p 基因治療（如遺傳?。┑谖屙摚庉嬘谛瞧谖澹菏妩c 十分?；蚓庉嫷娜罄?ZFN (Zinc-finger nucleases, ZFN) TALEN（transcription acti

6、vator-like effector nucleases) CRISPR/Cas (clustered regulatory interspaced short palindromic repeat /Cas-based RNA-guided DNA endonucleases）特異性DNA識別域非特異性核酸內(nèi)切酶+第六頁，編輯于星期五：十五點 十分。7ZFN原理ZFN=蛋白的DNA識別域+核酸內(nèi)切酶DNA識別域： 由一系列 Cys2-His2鋅指蛋白（zinc-fingers）串聯(lián)組成（一般34個），每個鋅指蛋白識別并結(jié)合一個特異的三聯(lián)體堿基。第七頁，編輯于星期五：十五點 十分。8核酸內(nèi)切

7、酶： 非特異性核酸內(nèi)切酶FokI，形成二聚體時切割雙鏈DNA 兩條ZFN之間具有被稱為“間隔區(qū)”的spacer結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的長度以56bp為宜，7bp也能正常工作，合理的“間隔區(qū)”設(shè)計才能保證ZFN二聚體擁有最佳的工作空間。第八頁，編輯于星期五：十五點 十分。ZFN技術(shù)的缺陷 DNADNA識別域雖然具有較強的特異性識別能力，但是其識別域雖然具有較強的特異性識別能力，但是其識別的序列長度比識別的序列長度比較有限較有限。 因為因為ZFNZFN剪切的過程剪切的過程不完全依賴同源二聚體的形成不完全依賴同源二聚體的形成，所以一旦形成異源，所以一旦形成異源二聚體，就很可能造成二聚體，就很可能造成脫靶效應(yīng)脫

8、靶效應(yīng)； 如果出現(xiàn)脫靶，可能導(dǎo)致如果出現(xiàn)脫靶，可能導(dǎo)致DNADNA的錯配和序列改變，產(chǎn)生較強的細胞的錯配和序列改變，產(chǎn)生較強的細胞毒性。當這些不良影響積累過多，超過細胞修復(fù)機制承受的范圍毒性。當這些不良影響積累過多，超過細胞修復(fù)機制承受的范圍時，便會引起細胞的凋亡。時，便會引起細胞的凋亡。 另一方面，該手段在細胞內(nèi)部操作的精確程度不足，則可能會引另一方面，該手段在細胞內(nèi)部操作的精確程度不足，則可能會引起相關(guān)基因突變，引發(fā)癌癥等。起相關(guān)基因突變，引發(fā)癌癥等。 ZFN ZFN 作為基因治療的手段之一，如果在生物體內(nèi)使用，可能會作為基因治療的手段之一，如果在生物體內(nèi)使用，可能會引發(fā)引發(fā)免疫反應(yīng)免疫反

9、應(yīng)。而現(xiàn)有的研究手段尚不能預(yù)測引入的。而現(xiàn)有的研究手段尚不能預(yù)測引入的ZNFZNF蛋白是否會引起免蛋白是否會引起免疫系統(tǒng)的進攻。疫系統(tǒng)的進攻。 到目前為止，到目前為止，ZFNZFN技術(shù)只能用于體外操作（技術(shù)只能用于體外操作（in vitroin vitro），在對人體提），在對人體提取的細胞進行處理之后，再導(dǎo)入回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)。取的細胞進行處理之后，再導(dǎo)入回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)。第九頁，編輯于星期五：十五點 十分。TALENTALEN TALEN（Transcription activator -like effectors）:一種源于植物致病菌的靶向基因操作技術(shù)。 科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，來自植物細菌Xantho

10、monas sp. (黃單胞菌) 的TAL蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有恒定的對應(yīng)關(guān)系,一個模塊單元識別一個堿基，簡單且特異性極好。 通過組合各類模塊，可對任意核苷酸序列進行靶向特異性敲除或內(nèi)源基因的表達調(diào)控。 目前已在人、大鼠、小鼠、豬、羊、斑馬魚、擬南芥及酵母等多類物種中得到成功應(yīng)用。第十頁，編輯于星期五：十五點 十分。TALEN原理典型的 TALEN由一個包含核定位信號（NLS）的N端結(jié)構(gòu)域、一個包含可識別特定 DNA序列的典型串聯(lián)TALE重復(fù)序列的中央結(jié)構(gòu)域，以及一個具有FokI核酸內(nèi)切酶功能的C端結(jié)構(gòu)域組成。DNA識別域：由一系列TAL蛋白串聯(lián)組成（一般20個左右

11、），每個TAL蛋白識別并結(jié)合一個對應(yīng)的堿基。核酸內(nèi)切酶： 非特異性核酸內(nèi)切酶FokI，形成二聚體時切割雙鏈DNA第十一頁，編輯于星期五：十五點 十分。全長為34aa的Tal 蛋白的第12、13位氨基殘基可以特異性識別核苷酸堿基。 NG可以識別T HD可以識別C NI可以識別A NN可以識別G或A通過這種特異性識別，將多個Tal蛋白組裝在一起，就可以構(gòu)成可以識別目的片段的Tale蛋白。TALEN原理第十二頁，編輯于星期五：十五點 十分。TALENTALEN的特異性打靶的原理：一對可以特異性識別靶基因的TALETALE，定位到需要編輯的基因組區(qū)域；然后非特異性核酸內(nèi)切酶FokIFokI切斷雙鏈DN

12、ADNA從而造成DNADNA雙鏈斷裂（double-strand breakdouble-strand break，DSBDSB）；再通過DNADNA的自我修復(fù)，引起堿基的缺失或突變，從而引起基因突變。FokIFokI只有在形成二聚體的時候才有內(nèi)切酶活性。TALEN原理第十三頁，編輯于星期五：十五點 十分。T A L E NT A L E N 介導(dǎo)的基因編輯TALEN質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細胞后，表達兩個融合蛋白，分別與靶位點特異結(jié)合，由于兩個TALEN融合蛋白中的Fok I臨近，形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，在兩個靶位點之間剪切DNA。 形成DSB時，同源重組可將需要敲入的序列組合入基因組。第十

13、四頁，編輯于星期五：十五點 十分。TALENTALEN的技術(shù)特點 任意敲除，無基因序列、細胞、物種限制，永久失活 成功率高，在保證轉(zhuǎn)染效率的前提下，有效性可達95%95%以上 打靶效率高，可完全替代RNAiRNAi技術(shù) 脫靶率低，尚未發(fā)現(xiàn)明顯脫靶效應(yīng) 技術(shù)簡單，只需按照常規(guī)構(gòu)建質(zhì)粒方法構(gòu)建TalenTalen質(zhì)粒第十五頁，編輯于星期五：十五點 十分。CRISPR/Cas 9 背景背景 CRISPR是生命進化歷史上，細菌和病毒進行斗爭是生命進化歷史上，細菌和病毒進行斗爭產(chǎn)生的免疫武器，簡單說就是病毒能把自己的基因整合產(chǎn)生的免疫武器，簡單說就是病毒能把自己的基因整合到細菌內(nèi)，利用細菌的細胞工具為自

14、己的基因復(fù)制服務(wù)，到細菌內(nèi)，利用細菌的細胞工具為自己的基因復(fù)制服務(wù)，細菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進化出很多成簇細菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進化出很多成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列( (既既CRISPR序列序列) )和和CRISPR相關(guān)基因，這一序列首先由日本學(xué)者于相關(guān)基因，這一序列首先由日本學(xué)者于1987年首次年首次發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)(1)，于，于2002年被年被Jansen等將正式命名等將正式命名(。第十六頁，編輯于星期五：十五點 十分。 CRISPR-Cas系統(tǒng)簡介 CRISPR-Cas系統(tǒng)的研究歷史p1987 年，日本課題組在年，日本課題組在K12 大腸桿

15、菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列，隨后發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于細菌和古細菌的基因組中。隔重復(fù)序列，隨后發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于細菌和古細菌的基因組中。2002 年，正式將其命名為年，正式將其命名為成簇的規(guī)律間隔的短回文成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列重復(fù)序列p 2005 年發(fā)現(xiàn)年發(fā)現(xiàn)CRISPR 的間隔序列的間隔序列(spacer)與宿主菌的染色體外的遺傳物與宿主菌的染色體外的遺傳物質(zhì)高度同源，推測細菌可能通過質(zhì)高度同源，推測細菌可能通過CRISPR 系統(tǒng)可能以類似于真核生物的系統(tǒng)可能以類似于真核生物的RNAi 方式抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵。方式抵抗外源遺傳物質(zhì)的入

16、侵。p2007 年，年，Barrangou 等首次發(fā)現(xiàn)細菌可能利用等首次發(fā)現(xiàn)細菌可能利用CRSPR 系統(tǒng)抵抗噬菌體入系統(tǒng)抵抗噬菌體入侵；侵；2008 年，年，Marraffini 等發(fā)現(xiàn)細菌等發(fā)現(xiàn)細菌CRISPR 系統(tǒng)能阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)系統(tǒng)能阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，首次利用實驗驗證了移，首次利用實驗驗證了CRISPR 系統(tǒng)的功能系統(tǒng)的功能p2013 年初，年初，MIT 的研究組首次利用的研究組首次利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對人系統(tǒng)對人293T 細胞細胞EMX1 和和PVALB 基因以及小鼠基因以及小鼠Nero2A 細胞細胞Th 基因?qū)崿F(xiàn)了定點突變?；?qū)崿F(xiàn)了定點突變。同年同年Mali 利用利

17、用CRISPR/ Cas9 在人在人293T 細胞和細胞和K652 細胞基因的靶位點細胞基因的靶位點形成雙鏈或單鏈的切口，從而激活細胞的形成雙鏈或單鏈的切口，從而激活細胞的DNA 修復(fù)機制高效介導(dǎo)外源基修復(fù)機制高效介導(dǎo)外源基因定點插入。因定點插入。第十七頁，編輯于星期五：十五點 十分。 由這些序列和基因組成的系統(tǒng)我們稱之為由這些序列和基因組成的系統(tǒng)我們稱之為CRISPR/Cas系統(tǒng)，而在這個系統(tǒng)中常用到的核酸內(nèi)切酶為系統(tǒng)，而在這個系統(tǒng)中常用到的核酸內(nèi)切酶為Cas9, ,所以通常稱該系統(tǒng)所以通常稱該系統(tǒng)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。利用這個系統(tǒng)，細菌可以不動聲色地把病毒基因從自己的染色體上系統(tǒng)。

18、利用這個系統(tǒng)，細菌可以不動聲色地把病毒基因從自己的染色體上切除，這是細菌特有的免疫系統(tǒng)。切除，這是細菌特有的免疫系統(tǒng)。CRISPR/Cas 9 背景背景第十八頁，編輯于星期五：十五點 十分。CRISPR/Cas 9概述概述CRISPR-Cas：一種來源是細菌獲得性免疫的由：一種來源是細菌獲得性免疫的由RNA指指導(dǎo)導(dǎo)Cas蛋白對靶向基因進行修飾的技術(shù)。蛋白對靶向基因進行修飾的技術(shù)。第十九頁，編輯于星期五：十五點 十分。 CRISPR-Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)pCRISPR-CAS 系統(tǒng)的組成主要包括: 由不連續(xù)的重復(fù)序列R( repeat) 與長度相似的間區(qū)序列S( spacers) 間隔排列而成的CR

19、ISPR 簇，前導(dǎo)序列L( leader) 以及一系列CRISPR 相關(guān)蛋白基因cas。 CasCas蛋白是一種雙鏈蛋白是一種雙鏈DNADNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide guide RNARNA引導(dǎo)下對靶位點進行切割。它與引導(dǎo)下對靶位點進行切割。它與folkfolk酶酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。能發(fā)揮作用。第二十頁，編輯于星期五：十五點 十分。CRISPR/Cas系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)識別作用識別作用切割作用切割作用 CRISPR系統(tǒng)通常包括：由不連續(xù)的重復(fù)序列（系統(tǒng)通常包括：由不連續(xù)的重復(fù)序列（repeats，R）與長度

20、相似的間區(qū)序列（與長度相似的間區(qū)序列（spacers，S）間隔排列而成的）間隔排列而成的CRISPRCRISPR簇，前導(dǎo)簇，前導(dǎo)序列序列( (leader，L)以及一系列的以及一系列的CRISPR相關(guān)蛋白基因相關(guān)蛋白基因(cas)(cas)。 Cas（CRISPR associated）：存在于）：存在于CRISPR位點附近，是一種位點附近，是一種雙鏈雙鏈DNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNA引導(dǎo)下對靶位點進行切割。它不需引導(dǎo)下對靶位點進行切割。它不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。要形成二聚體才能發(fā)揮作用。第二十一頁，編輯于星期五：十五點 十分。CRISPR的轉(zhuǎn)錄與加工的轉(zhuǎn)錄與加工CRI

21、SPR簇首先轉(zhuǎn)錄成長的轉(zhuǎn)錄體，即（簇首先轉(zhuǎn)錄成長的轉(zhuǎn)錄體，即（crRNA），然后），然后逐步被加工成小的逐步被加工成小的 crRNA。第二十二頁，編輯于星期五：十五點 十分。CRISPR/Cas 9作用機理作用機理第二十三頁，編輯于星期五：十五點 十分。CRISPR/Cas 9作用機理作用機理PAM（NGG序列）序列）第二十四頁，編輯于星期五：十五點 十分。CRISPR/Cas 9系統(tǒng)靶向要求系統(tǒng)靶向要求最主要的要求：最主要的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）為）為NGG。在人類基。在人類基因組中，平均每因組中，平均每8bp就出現(xiàn)一個就出現(xiàn)一個NGG PAM。

22、第二十五頁，編輯于星期五：十五點 十分。CRISPR/Cas 9基因編輯實驗流程圖基因編輯實驗流程圖第二十六頁，編輯于星期五：十五點 十分。CRISPR/Cas 9的技術(shù)應(yīng)用的技術(shù)應(yīng)用應(yīng)用于基因的敲除、敲入以及基因沉默、激活等。應(yīng)用于基因的敲除、敲入以及基因沉默、激活等。能夠在真核細胞中發(fā)揮作用，使真核基因組中的特異性能夠在真核細胞中發(fā)揮作用，使真核基因組中的特異性位點發(fā)生雙鏈斷裂。位點發(fā)生雙鏈斷裂。在模式生物中的應(yīng)用在模式生物中的應(yīng)用: :成功地對線蟲成功地對線蟲( (左左) )、斑馬魚胚胎（中）和果蠅進行遺傳學(xué)改造，斑馬魚胚胎（中）和果蠅進行遺傳學(xué)改造，獲得更粗短的線蟲，腹部組織體積更大的

23、獲得更粗短的線蟲，腹部組織體積更大的斑馬魚胚胎，和眼睛顏色更深的果蠅，表斑馬魚胚胎，和眼睛顏色更深的果蠅，表明明CRISPR技術(shù)在動物基因改造方面有巨技術(shù)在動物基因改造方面有巨大應(yīng)用潛力。大應(yīng)用潛力。中國科學(xué)院遺傳所中國科學(xué)院遺傳所高彩霞團隊：成功高彩霞團隊：成功地使三種水稻基因地使三種水稻基因失活。失活。第二十七頁，編輯于星期五：十五點 十分。近日，中國科學(xué)家利用基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9，對抑制狗骨骼肌生長的基因（MSTN）進行了敲除，培育出兩只肌肉發(fā)達的“大力神”狗，成功構(gòu)建了世界首個基因敲除狗模型。CRISPR/Cas 9的技術(shù)應(yīng)用的技術(shù)應(yīng)用第二十八頁，編輯于星期五：十五點 十

24、分。三大基因修飾技術(shù)比較三大基因修飾技術(shù)比較第二十九頁，編輯于星期五：十五點 十分。CRISPR/Cas 9系統(tǒng)的優(yōu)勢系統(tǒng)的優(yōu)勢操作簡單，靶向精確性更高。操作簡單，靶向精確性更高。sgRNA靶向序列和基因組序列必須完靶向序列和基因組序列必須完全匹配，全匹配，Cas9才會對才會對DNA進行剪切。編碼進行剪切。編碼sgRNA 的序列不超過的序列不超過100bp，因此比構(gòu)建，因此比構(gòu)建TALENs和和ZENs更簡單方便，用于更簡單方便，用于CRISPR的的sgRNA識別序列僅需識別序列僅需2020個核苷酸。個核苷酸。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是由系統(tǒng)是由RNA調(diào)控的對調(diào)控的對DNA的修飾，其基因修飾可的修飾，其基因修飾可遺傳。遺傳?；蛐揎椔矢?，基因修飾率高，CRISPRs基因敲入的效率為基因敲入的效率為51%-79%，TALENs的效率為的效率為0%-34%?；蛘{(diào)控方式多樣，例如敲除、插入、抑制、激活等基因調(diào)控方式多樣，例如敲除、插入、抑制、激活等無物種限制無物種限制, ,可實現(xiàn)對靶基因多個位點同時敲除?？蓪崿F(xiàn)對靶基因多個位點同時敲除。實驗周期短，最快僅需實驗周期短，最快僅需2個月，節(jié)省大