聚合酶鏈反應(yīng)及相關(guān)技術(shù)PPT課件

1、 聚合酶鏈反應(yīng)于二十世紀(jì)聚合酶鏈反應(yīng)于二十世紀(jì)8080年代由年代由K.MullisK.Mullis建立建立，并和定點突變的發(fā)明者并和定點突變的發(fā)明者M(jìn).SmithM.Smith一起榮獲一起榮獲19931993年年度度 諾貝爾化學(xué)獎，諾貝爾化學(xué)獎，為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究開創(chuàng)了嶄為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究開創(chuàng)了嶄新時代。新時代。第1頁/共86頁第一節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng)第二節(jié) 以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)第三節(jié) PCR產(chǎn)物的檢測第2頁/共86頁第一節(jié)第一節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)第3頁/共86頁 聚合酶鏈反應(yīng)（聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, polymerase chain r

2、eaction, PCRPCR）是是DNADNA體外復(fù)制反應(yīng)，基本原理與細(xì)胞內(nèi)體外復(fù)制反應(yīng)，基本原理與細(xì)胞內(nèi)DNADNA的復(fù)制相似的復(fù)制相似 第一節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng)第4頁/共86頁第一節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng)一、PCR反應(yīng)原理、反應(yīng)過程和特點二、PCR的反應(yīng)體系三、PCR的反應(yīng)條件四、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制第5頁/共86頁一、一、PCRPCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過程反應(yīng)原理和反應(yīng)過程1.1.原理原理 DNA DNA的體外復(fù)制包括的體外復(fù)制包括3 3個步驟：個步驟： 變性（變性（denaturationdenaturation）: 94: 94 C C9595 C C 退火（退火（annealinganneali

3、ng） : 40 : 40 C C7070 C C 延伸（延伸（extensionextension） : 72 : 72 C C 第6頁/共86頁 變性變性: DNA: DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈分子作雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈分子作為為 反應(yīng)的模板反應(yīng)的模板 退火退火: : 引物與模板互補(bǔ)結(jié)合，形成雜交鏈引物與模板互補(bǔ)結(jié)合，形成雜交鏈 延伸延伸: : 按照模板鏈的序列以互補(bǔ)的方式依次把按照模板鏈的序列以互補(bǔ)的方式依次把dNTPdNTP加至引物的加至引物的3 3 端，端，Taq DNATaq DNA聚合酶使雜交雙聚合酶使雜交雙鏈不斷延伸，直至形成新的鏈不斷延伸，直至形成新的DNADNA

4、雙鏈雙鏈 一、一、PCRPCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過程反應(yīng)原理和反應(yīng)過程第7頁/共86頁5533d.NTPs耐熱DNA聚合酶引物5353535353535353535353535353退火加入試管中添加反應(yīng)混合液及樣本變性一、一、PCRPCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過程反應(yīng)原理和反應(yīng)過程第8頁/共86頁53535353535355TaqTaq353TaqTaq55循環(huán)延伸繼續(xù)延伸一、一、PCRPCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過程反應(yīng)原理和反應(yīng)過程第9頁/共86頁5353535355335353第二個循環(huán)4個拷貝第三個循環(huán)8個拷貝53535353535353535353533553535353第n個循環(huán)2n個拷貝一、一、P

5、CRPCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過程反應(yīng)原理和反應(yīng)過程第10頁/共86頁2.特點 特異性強(qiáng) 引物與模板結(jié)合的特異性及聚合酶的忠實性 靈敏度高 指數(shù)增長，從pg (10-12)可擴(kuò)增至 mg (10-6)水平 簡便、快速 24 小時完成擴(kuò)增反應(yīng)一、PCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過程第11頁/共86頁二、二、PCRPCR的反應(yīng)體系的反應(yīng)體系參與PCR反應(yīng)的主要成份:1.模板2.引物3.脫氧核苷三磷酸4.Taq DNA聚合酶5.鎂離子濃度6.其它反應(yīng)因素第12頁/共86頁1 1. .模板（模板（templatetemplate） 基因組基因組DNADNA、RNARNA、質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA、線粒體線粒體DNADNA等

6、等 RNARNA作為模板時，須先將作為模板時，須先將RNARNA逆轉(zhuǎn)錄為逆轉(zhuǎn)錄為cDNAcDNA 模板量：模板量：10001000ngng、500ng500ng、100ng100ng、50ng50ng 反應(yīng)體系中較低量的模板有利于提高擴(kuò)增反應(yīng)體系中較低量的模板有利于提高擴(kuò)增產(chǎn)量和減少非特異性擴(kuò)增產(chǎn)量和減少非特異性擴(kuò)增 二、PCR的反應(yīng)體系第13頁/共86頁2 2. .引物引物( (primer)primer) 化學(xué)合成的寡核苷酸化學(xué)合成的寡核苷酸 與模板特異地結(jié)合與模板特異地結(jié)合 決定產(chǎn)物的特異性和長度決定產(chǎn)物的特異性和長度二、PCR的反應(yīng)體系第14頁/共86頁設(shè)計引物的原則設(shè)計引物的原則(

7、(一一) ) 兩條引物分別位于被擴(kuò)增片段的兩端，與模兩條引物分別位于被擴(kuò)增片段的兩端，與模板正負(fù)鏈序列互補(bǔ)板正負(fù)鏈序列互補(bǔ) 長度為長度為18182525個核苷酸個核苷酸 二條引物之間避免形成引物二聚體二條引物之間避免形成引物二聚體 引物濃度：0.10.2mol/L，濃度過高容易生成引物二聚體二、PCR的反應(yīng)體系第15頁/共86頁設(shè)計引物的原則設(shè)計引物的原則( (二二) ) 引物的堿基組成應(yīng)平衡，引物的堿基組成應(yīng)平衡，C+G C+G 堿基含量在引物堿基含量在引物中的比例一般以中的比例一般以45%45%55%55%為宜為宜 引物退火溫度計算：引物退火溫度計算：Tm=2Tm=2（A+TA+T）+4+

8、4（C+GC+G） 引物的引物的5 5 端可被修飾（引入酶切位點、引入突端可被修飾（引入酶切位點、引入突變位點、生物素等標(biāo)記）變位點、生物素等標(biāo)記）二、PCR的反應(yīng)體系第16頁/共86頁3 3. .脫氧核苷三磷酸（脫氧核苷三磷酸（dNTPdNTP） dATPdATP、dCTPdCTP、dGTPdGTP和和dTTPdTTP的混合物的混合物 反應(yīng)體系中各種核苷酸的濃度必須一致反應(yīng)體系中各種核苷酸的濃度必須一致 濃度過高雖能加快反應(yīng)速度，但非特異濃度過高雖能加快反應(yīng)速度，但非特異性擴(kuò)增也隨之增加性擴(kuò)增也隨之增加 最適濃度：最適濃度：2020200200mol/Lmol/L二、PCR的反應(yīng)體系第17頁

9、/共86頁4 4. .Taq Taq DNADNA聚合酶聚合酶 從一種生活在熱泉（從一種生活在熱泉（80809090）中的水棲）中的水棲噬熱菌（噬熱菌（Thermus aquaticus, TaqThermus aquaticus, Taq）中提取，中提取，有很高的耐熱穩(wěn)定性有很高的耐熱穩(wěn)定性 二、PCR的反應(yīng)體系第18頁/共86頁Taq Taq 酶的作用酶的作用: : 在模板指導(dǎo)下，以在模板指導(dǎo)下，以dNTPdNTP為原料，在引物為原料，在引物3 3 - -OHOH末端加上脫氧單核苷酸，形成末端加上脫氧單核苷酸，形成3 3 , 5, 5 - -磷酸二磷酸二酯鍵，使酯鍵，使DNADNA鏈沿鏈沿

10、5 5 3 3 方向延伸，催化方向延伸，催化DNADNA合成合成 最適酶量：最適酶量：1 12.52.5U U二、PCR的反應(yīng)體系第19頁/共86頁 Taq DNATaq DNA聚合酶無聚合酶無3 3 5 5 外切酶活性，因而無外切酶活性，因而無校正功能，在復(fù)制新鏈的過程中會發(fā)生堿基錯校正功能，在復(fù)制新鏈的過程中會發(fā)生堿基錯配配 Taq DNATaq DNA聚合酶在每次循環(huán)中產(chǎn)生的移碼突變率聚合酶在每次循環(huán)中產(chǎn)生的移碼突變率為為1/300001/30000，堿基替換率為，堿基替換率為1/80001/8000，因此擴(kuò)增，因此擴(kuò)增的片段越長，錯配的機(jī)率越高的片段越長，錯配的機(jī)率越高 二、二、PCR

11、PCR的反應(yīng)的反應(yīng)體系體系第20頁/共86頁 耐熱的高保真耐熱的高保真 DNADNA多聚合酶：多聚合酶： Pwo DNA polymerase Pwo DNA polymerase Tth DNA polymerase Tth DNA polymerase Pfu DNA polymerase Pfu DNA polymerase 高熱穩(wěn)定性，高保真性，能降低堿基錯配率高熱穩(wěn)定性，高保真性，能降低堿基錯配率二、二、PCRPCR的反應(yīng)體系的反應(yīng)體系第21頁/共86頁5 5. .鎂離子濃度鎂離子濃度 對反應(yīng)系統(tǒng)本身、穩(wěn)定核苷酸和提高對反應(yīng)系統(tǒng)本身、穩(wěn)定核苷酸和提高Taq Taq 酶的活酶的活性有直

12、接影響性有直接影響 PCRPCR反應(yīng)體系中反應(yīng)體系中dNTPdNTP、引物、模板引物、模板DNADNA及鰲合劑均及鰲合劑均可與可與MgMg2+2+結(jié)合，降低游離結(jié)合，降低游離MgMg2+2+的濃度，影響酶的的濃度，影響酶的活性活性 dNTPdNTP濃度為濃度為200200mol/Lmol/L時，時，M MgClgCl2 2濃度為濃度為1 1.5.5mmol/Lmmol/L較宜較宜二、PCR的反應(yīng)體系第22頁/共86頁6 6. .其它反應(yīng)因素其它反應(yīng)因素 pHpH：反應(yīng)所需的最適反應(yīng)所需的最適pHpH值在值在7.27.2左右左右 鹽：合適的鹽濃度有利于穩(wěn)定雜交體，有利于鹽：合適的鹽濃度有利于穩(wěn)定

13、雜交體，有利于引物與模板雜交引物與模板雜交 基質(zhì)：牛血清白蛋白、明膠、基質(zhì)：牛血清白蛋白、明膠、Tween20Tween20、DTTDTT等等 二、PCR的反應(yīng)體系第23頁/共86頁三、三、PCRPCR的反應(yīng)條件的反應(yīng)條件 1.反應(yīng)溫度（變性、退火、延伸）2.反應(yīng)時間（變性、退火、延伸）3.循環(huán)次數(shù)（PCR效率及產(chǎn)物量）4.PCR過程的實時監(jiān)測第24頁/共86頁1 1. .反應(yīng)溫度反應(yīng)溫度 變性溫度：變性溫度：94949797 退火溫度：低于引物退火溫度：低于引物Tm Tm 55左右左右 溫度過高：降低擴(kuò)增效率溫度過高：降低擴(kuò)增效率 溫度過低：增加非特異性擴(kuò)增溫度過低：增加非特異性擴(kuò)增 延伸溫

14、度：延伸溫度：7272三、PCR的反應(yīng)條件 第25頁/共86頁2 2. .反應(yīng)時間反應(yīng)時間 第一次變性應(yīng)給予足夠時間第一次變性應(yīng)給予足夠時間 每一個步驟所需時間取決于擴(kuò)增片段的長度，每一個步驟所需時間取決于擴(kuò)增片段的長度，時間過長易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增時間過長易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增三、PCR的反應(yīng)條件 第26頁/共86頁3 3. .循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù) 一般設(shè)為一般設(shè)為25253535個循環(huán)個循環(huán) 每一個循環(huán)使一個分子的模板被復(fù)制為二每一個循環(huán)使一個分子的模板被復(fù)制為二個，產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長個，產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長三、PCR的反應(yīng)條件 第27頁/共86頁 一個分子的模板經(jīng)過一個分子的模板經(jīng)過3030個循

15、環(huán)，理論上個循環(huán)，理論上即可得即可得2 23030( (約約10109 9) )個拷貝產(chǎn)物個拷貝產(chǎn)物 實際反應(yīng)中，每個循環(huán)的擴(kuò)增效率大多實際反應(yīng)中，每個循環(huán)的擴(kuò)增效率大多約為約為85%85%左右左右三、三、PCRPCR的反應(yīng)條件的反應(yīng)條件 第28頁/共86頁擴(kuò)增反應(yīng)的平臺效應(yīng)：擴(kuò)增反應(yīng)的平臺效應(yīng)： PCR PCR反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)性增長，但這種增反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)性增長，但這種增長形式在擴(kuò)增長形式在擴(kuò)增25253535個循環(huán)以后便放慢直至個循環(huán)以后便放慢直至停止，達(dá)到反應(yīng)平臺，此時擴(kuò)增產(chǎn)物量不再停止，達(dá)到反應(yīng)平臺，此時擴(kuò)增產(chǎn)物量不再隨循環(huán)次數(shù)的增加而呈指數(shù)增長。隨循環(huán)次數(shù)的增加而呈指數(shù)增長。三、三、P

16、CRPCR的反應(yīng)條件的反應(yīng)條件 第29頁/共86頁n指數(shù)增長期n線形增長期n平臺期循環(huán)數(shù) 理論值 實際值Log 產(chǎn)物DNA4.PCR實時監(jiān)測三、PCR的反應(yīng)條件 第30頁/共86頁 平臺出現(xiàn)得遲早與模板的初始量有關(guān)，模板初平臺出現(xiàn)得遲早與模板的初始量有關(guān)，模板初始量越多，平臺出現(xiàn)得越早始量越多，平臺出現(xiàn)得越早 平臺效應(yīng)產(chǎn)生的因素：平臺效應(yīng)產(chǎn)生的因素： 引物二聚體的產(chǎn)生引物二聚體的產(chǎn)生 反應(yīng)體系各組分的消耗反應(yīng)體系各組分的消耗 引物和已擴(kuò)增的引物和已擴(kuò)增的DNADNA片段間的競爭等片段間的競爭等三、三、PCRPCR的反應(yīng)條件的反應(yīng)條件 第31頁/共86頁四、四、PCRPCR技術(shù)的質(zhì)量控制技術(shù)的質(zhì)

17、量控制1.1.實驗室的規(guī)范化設(shè)置實驗室的規(guī)范化設(shè)置 試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū) 標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本制備區(qū) 擴(kuò)增反應(yīng)區(qū)擴(kuò)增反應(yīng)區(qū) 產(chǎn)物分析區(qū)產(chǎn)物分析區(qū) 第32頁/共86頁2.2.防污染體系：防污染體系： 正確設(shè)置實驗室、嚴(yán)格規(guī)范實驗操作、完整正確設(shè)置實驗室、嚴(yán)格規(guī)范實驗操作、完整有效的去污染措施有效的去污染措施 反應(yīng)體系中以反應(yīng)體系中以dUTPdUTP取代取代dTTPdTTP，加入尿嘧啶糖加入尿嘧啶糖苷酶（苷酶（UNGUNG），），破壞以往的擴(kuò)增產(chǎn)物破壞以往的擴(kuò)增產(chǎn)物 每次實驗完畢后須用每次實驗完畢后須用1 1g/Lg/L次氯酸鈉清潔實驗次氯酸鈉清潔實驗臺面，或用臺面，或用254254nmnm

18、波長的紫外光近距離充分波長的紫外光近距離充分照射照射 四、四、PCRPCR技術(shù)的質(zhì)量控制技術(shù)的質(zhì)量控制第33頁/共86頁3.PCR3.PCR技術(shù)的質(zhì)量保證技術(shù)的質(zhì)量保證 基因擴(kuò)增檢驗的全過程的質(zhì)量保證基因擴(kuò)增檢驗的全過程的質(zhì)量保證 分析前分析前 分析中分析中 分析后分析后 室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量評價室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量評價四、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制第34頁/共86頁第二節(jié)第二節(jié) 以以PCRPCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)第35頁/共86頁第二節(jié)第二節(jié) 以以PCRPCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)一、逆轉(zhuǎn)錄PCR二、定量PCR三、多重PCR四、PCR誘導(dǎo)定點突變五、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)六、隨

19、機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA第36頁/共86頁一、逆轉(zhuǎn)錄一、逆轉(zhuǎn)錄PCRPCR（RT-PCRRT-PCR） 以細(xì)胞內(nèi)總以細(xì)胞內(nèi)總RNARNA或或mRNAmRNA為材料進(jìn)行體外擴(kuò)為材料進(jìn)行體外擴(kuò)增的技術(shù)增的技術(shù) 主要用于克隆主要用于克隆 cDNAcDNA、合成合成cDNAcDNA探針，探針，檢檢測測RNARNA病毒、分析基因表達(dá)等病毒、分析基因表達(dá)等第37頁/共86頁逆轉(zhuǎn)錄合成逆轉(zhuǎn)錄合成cDNAcDNA所用所用的引物：的引物： 以以PCRPCR擴(kuò)增所需的下游引物作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引擴(kuò)增所需的下游引物作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物物 以以oligo(dT)oligo(dT)作為引物作為引物 以人工合成的隨機(jī)序列（六核苷

20、酸混合物）作為以人工合成的隨機(jī)序列（六核苷酸混合物）作為引物引物一、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）第38頁/共86頁一、逆轉(zhuǎn)錄一、逆轉(zhuǎn)錄PCRPCR第39頁/共86頁二、定量二、定量PCR(quantitative PCR)PCR(quantitative PCR) 對對DNADNA或或RNARNA樣本的靶序列進(jìn)行定量分析樣本的靶序列進(jìn)行定量分析 主要用于基因表達(dá)的分析、病原體核酸的檢測主要用于基因表達(dá)的分析、病原體核酸的檢測等等第40頁/共86頁 熒光定量熒光定量PCRPCR（fluorescence quantitative fluorescence quantitative PCR,FQ-

21、PCRPCR,FQ-PCR），），又稱實時又稱實時PCR(real-time PCR)PCR(real-time PCR) FQ-PCRFQ-PCR通過熒光信號對通過熒光信號對PCRPCR過程中的產(chǎn)物量進(jìn)過程中的產(chǎn)物量進(jìn)行實時監(jiān)測，精確計算出行實時監(jiān)測，精確計算出PCRPCR的初始模板量的初始模板量 二、定量二、定量PCRPCR第41頁/共86頁熒光信號的檢測方法熒光信號的檢測方法二、定量PCR1.DNA結(jié)合染料技術(shù)2.水解探針技術(shù)3.雜交探針技術(shù)4.分子信標(biāo)技術(shù)第42頁/共86頁1 1.DNA.DNA結(jié)合染料技術(shù)結(jié)合染料技術(shù) PCRPCR反應(yīng)體系中加入反應(yīng)體系中加入SYBR Green IS

22、YBR Green I染料，能染料，能選擇性地?fù)饺胫岭p鏈選擇性地?fù)饺胫岭p鏈DNADNA分子中，并且產(chǎn)生分子中，并且產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光強(qiáng)烈熒光 PCRPCR過程中，過程中，SYBR Green ISYBR Green I染料結(jié)合到新合染料結(jié)合到新合成的雙鏈成的雙鏈DNADNA分子中，結(jié)合的熒光信號和分子中，結(jié)合的熒光信號和DNADNA含量成正比含量成正比 二、定量PCR第43頁/共86頁 二、定量PCR第44頁/共86頁 優(yōu)點：成本較低，無須對引物或探針進(jìn)行特殊優(yōu)點：成本較低，無須對引物或探針進(jìn)行特殊的熒光標(biāo)記，操作亦比較簡單的熒光標(biāo)記，操作亦比較簡單 缺點：特異性不夠，染料分子會結(jié)合到非特異缺點：特

23、異性不夠，染料分子會結(jié)合到非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈分子和引物二聚體中，使反性擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈分子和引物二聚體中，使反應(yīng)體系中的熒光本底較高應(yīng)體系中的熒光本底較高 二、定量PCR第45頁/共86頁2.2.水解探針技術(shù)技術(shù)水解探針技術(shù)技術(shù) 熒光素標(biāo)記探針熒光素標(biāo)記探針 探針的探針的5 5 端和端和3 3 端分別標(biāo)記熒光報告基團(tuán)端分別標(biāo)記熒光報告基團(tuán)R R和熒光淬滅基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)Q Q 探針完整時探針完整時R R基團(tuán)與基團(tuán)與Q Q基團(tuán)分別位于探針的基團(tuán)分別位于探針的二端，二端，Q Q基團(tuán)抑制基團(tuán)抑制R R基團(tuán)使其不能發(fā)射熒光基團(tuán)使其不能發(fā)射熒光 二、定量PCR第46頁/共86頁熒光信號檢測熒光信號檢

24、測 PCR PCR過程中，過程中，Taq DNATaq DNA聚合酶沿模板移動，其聚合酶沿模板移動，其 5 5 33 外切核酸酶活性，可逐個水解脫氧核外切核酸酶活性，可逐個水解脫氧核 苷三磷酸，苷三磷酸，R R基團(tuán)與基團(tuán)與Q Q基團(tuán)隨之分離基團(tuán)隨之分離 R R基團(tuán)不再受基團(tuán)不再受Q Q基團(tuán)的抑制便發(fā)射熒光，基團(tuán)的抑制便發(fā)射熒光，R R基基團(tuán)信團(tuán)信 號強(qiáng)弱的程度與號強(qiáng)弱的程度與PCRPCR反應(yīng)產(chǎn)物的拷貝數(shù)成正反應(yīng)產(chǎn)物的拷貝數(shù)成正比比 二、定量PCR第47頁/共86頁水水 解解 探探 針針 技技 術(shù)術(shù)二、定量PCR第48頁/共86頁二、定量PCR第49頁/共86頁3 3. .雜交探針技術(shù)（雜交探針

25、技術(shù)（hybridization probehybridization probe）反應(yīng)體系需要反應(yīng)體系需要2 2條探針條探針 探針探針A A的的3 3 端標(biāo)以熒光素作為熒光染料供體；端標(biāo)以熒光素作為熒光染料供體；探針探針B B的的5 5 端標(biāo)以另一種染料，作為熒光染端標(biāo)以另一種染料，作為熒光染料受體。料受體。2 2個探針的序列頭尾排列，并且相距僅間隔個探針的序列頭尾排列，并且相距僅間隔1 1個堿基，從而能夠進(jìn)行熒光共振能量的轉(zhuǎn)移個堿基，從而能夠進(jìn)行熒光共振能量的轉(zhuǎn)移 二、定量PCR第50頁/共86頁外來光源首先刺激供體熒光染料，供體便發(fā)外來光源首先刺激供體熒光染料，供體便發(fā)光刺激附近的受體熒

26、光染料，使后者再發(fā)射光刺激附近的受體熒光染料，使后者再發(fā)射出具另一種波長的信號而被檢測系統(tǒng)接收出具另一種波長的信號而被檢測系統(tǒng)接收 受體熒光染料在受體熒光染料在2 2個探針都與模板雜交時才個探針都與模板雜交時才會被激發(fā)而發(fā)射熒光信號會被激發(fā)而發(fā)射熒光信號 二、定量PCR第51頁/共86頁 分子信標(biāo)是一段熒光素標(biāo)記的寡核苷酸分子信標(biāo)是一段熒光素標(biāo)記的寡核苷酸 環(huán)狀區(qū)環(huán)狀區(qū)(15(153030個核苷酸個核苷酸) ) 柄區(qū)柄區(qū)(5(58 8個堿基對個堿基對) )組成組成 5 5 末端標(biāo)記熒光基團(tuán)末端標(biāo)記熒光基團(tuán) 3 3 末端標(biāo)記淬滅基團(tuán)末端標(biāo)記淬滅基團(tuán)4.分子信標(biāo)技術(shù)（molecular beaco

27、n）二、定量PCR第52頁/共86頁 在自由狀態(tài)下，分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)呈發(fā)夾狀，兩在自由狀態(tài)下，分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)呈發(fā)夾狀，兩端的基團(tuán)相距較近，熒光基團(tuán)將能量轉(zhuǎn)移給淬端的基團(tuán)相距較近，熒光基團(tuán)將能量轉(zhuǎn)移給淬滅基團(tuán)而使熒光淬滅，熒光本底極低滅基團(tuán)而使熒光淬滅，熒光本底極低 當(dāng)分子信標(biāo)與序列互補(bǔ)的靶分子結(jié)合時，分子當(dāng)分子信標(biāo)與序列互補(bǔ)的靶分子結(jié)合時，分子信標(biāo)的構(gòu)型發(fā)生變化，柄部被打開，從而使熒信標(biāo)的構(gòu)型發(fā)生變化，柄部被打開，從而使熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)而發(fā)射熒光光基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)而發(fā)射熒光 二、定量PCR第53頁/共86頁分子信標(biāo)技術(shù)原理R二、定量PCR第54頁/共86頁定量 PCR參照系統(tǒng)二、定量PCR1

28、.外參照系統(tǒng)的設(shè)置2.內(nèi)參照系統(tǒng)的設(shè)置第55頁/共86頁1.1.外參照系統(tǒng)外參照系統(tǒng)CtCt值值( (cycle threshold)cycle threshold) 擴(kuò)增曲線與熒光本底基線的交叉點處相應(yīng)的反擴(kuò)增曲線與熒光本底基線的交叉點處相應(yīng)的反應(yīng)循環(huán)數(shù)應(yīng)循環(huán)數(shù), ,即每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)即每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù) CtCt值與模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性反比值與模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性反比關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CtCt值越小值越小 二、定量PCR第56頁/共86頁相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖二、

29、定量PCR第57頁/共86頁利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值 獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù) 二、定量PCR第58頁/共86頁2.2.內(nèi)參照系統(tǒng)內(nèi)參照系統(tǒng) 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品: :一段人為地引入了突變序列的靶一段人為地引入了突變序列的靶基因片段基因片段 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品加入被檢樣品中一起抽提、擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品加入被檢樣品中一起抽提、擴(kuò)增 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品和靶基因的探針分別用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品和靶基因的探針分別用2 2種不同的種不同的熒光染料標(biāo)記，二者探針雜交的序列不同熒光染料標(biāo)記，二者探針雜交的序列不同 二、定量PCR第59頁/共86頁 同一對

30、引物同時擴(kuò)增靶基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品，雙通同一對引物同時擴(kuò)增靶基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品，雙通道熒光檢測系統(tǒng)可以特異地同時檢測出內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)道熒光檢測系統(tǒng)可以特異地同時檢測出內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品和靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，計算出靶基因起始拷品和靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，計算出靶基因起始拷貝數(shù)貝數(shù) 內(nèi)參照系統(tǒng)避免了由于不同抽提效率導(dǎo)致的樣內(nèi)參照系統(tǒng)避免了由于不同抽提效率導(dǎo)致的樣本間的差異，使結(jié)果的重復(fù)性更好，定量更為本間的差異，使結(jié)果的重復(fù)性更好，定量更為準(zhǔn)確準(zhǔn)確,但仍不能監(jiān)控內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品和靶基因是否有一但仍不能監(jiān)控內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品和靶基因是否有一致的擴(kuò)增效率致的擴(kuò)增效率 二、定量PCR第60頁/共86頁三、多重三、多重PCR(multiplex PCR)PC

31、R(multiplex PCR) 在同一反應(yīng)體系中加入多對引物，同時擴(kuò)增一在同一反應(yīng)體系中加入多對引物，同時擴(kuò)增一份份 DNA DNA樣本中多個靶片段樣本中多個靶片段第61頁/共86頁四、四、PCRPCR誘導(dǎo)定點突變誘導(dǎo)定點突變1.1.引入點突變引入點突變ABABP2P1PCR用酶A和B消化，將突變位點引入PCR產(chǎn)物第62頁/共86頁2.引入大片段缺失四、PCR誘導(dǎo)定點突變第63頁/共86頁五、連接酶鏈反應(yīng)(LCR）空隙LCR 引物與模板特異性互補(bǔ)引物A和B之間、a和b之間有一段空隙空隙在DNA聚合酶的作用下特異性延伸連接酶連接缺口 第64頁/共86頁六、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性六、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA

32、DNA( (RAPD) RAPD) RAPDRAPD是一種在整個基因組是一種在整個基因組DNADNA內(nèi)進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增而內(nèi)進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增而獲得多態(tài)性長度獲得多態(tài)性長度DNADNA片段片段的技術(shù)的技術(shù) 用一條隨機(jī)序列的引物與模板用一條隨機(jī)序列的引物與模板DNADNA序列作隨機(jī)配序列作隨機(jī)配對，反應(yīng)過程中隨機(jī)引物只有在與模板對，反應(yīng)過程中隨機(jī)引物只有在與模板DNADNA互補(bǔ)互補(bǔ)后，在足夠近的間距后，在足夠近的間距(200(20020002000bp)bp)內(nèi)、方向相內(nèi)、方向相對的兩個引物片段之間的模板對的兩個引物片段之間的模板DNADNA序列才能被擴(kuò)序列才能被擴(kuò)增增 第65頁/共86頁六、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性

33、六、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNADNA 不同個體不同個體DNADNA序列之間存在差異或發(fā)生突變，經(jīng)擴(kuò)增所得到的產(chǎn)序列之間存在差異或發(fā)生突變，經(jīng)擴(kuò)增所得到的產(chǎn)物片段長度會有所不同，經(jīng)過電泳分離便可以發(fā)現(xiàn)這種差異，物片段長度會有所不同，經(jīng)過電泳分離便可以發(fā)現(xiàn)這種差異，從而可了解和比較兩個生物體之間基因組從而可了解和比較兩個生物體之間基因組DNADNA的結(jié)構(gòu)等信息的結(jié)構(gòu)等信息 第66頁/共86頁 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA六、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性六、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNADNA第67頁/共86頁RAPDRAPD的應(yīng)用的應(yīng)用 種群生物學(xué)研究種群生物學(xué)研究 基因組基因組DNADNA圖譜構(gòu)建圖譜構(gòu)建 遺傳鑒定遺傳鑒定 臨床致病

34、菌的流行病學(xué)檢測和分型臨床致病菌的流行病學(xué)檢測和分型 DNADNA指紋鑒定指紋鑒定 六、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性六、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNADNA第68頁/共86頁第三節(jié)第三節(jié) PCRPCR產(chǎn)物的產(chǎn)物的檢測檢測第69頁/共86頁第三節(jié)第三節(jié) PCRPCR產(chǎn)物的檢測產(chǎn)物的檢測一、PCR-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）二、等位基因特異性寡核苷酸（ASO）三、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）四、變性梯度凝膠電泳（DGGE）五、融點曲線分析(melting curve analysis)六、PCR產(chǎn)物的序列分析（sequencing）第70頁/共86頁一、一、 PCR-PCR-限制性片段長度多態(tài)性限制性片段長度

35、多態(tài)性 PCR-RFLPPCR-RFLP是對是對PCRPCR產(chǎn)物作限制性片段長度多產(chǎn)物作限制性片段長度多態(tài)性分析態(tài)性分析 根據(jù)根據(jù)PCRPCR產(chǎn)物的突變序列是否位于限制性內(nèi)產(chǎn)物的突變序列是否位于限制性內(nèi)切酶的酶切位點內(nèi)而設(shè)計切酶的酶切位點內(nèi)而設(shè)計 突變點在某一限制性內(nèi)切酶的酶切位點序列突變點在某一限制性內(nèi)切酶的酶切位點序列時，可在突變點的二側(cè)設(shè)計引物，或通過改時，可在突變點的二側(cè)設(shè)計引物，或通過改變引物序列使擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生（或消失）酶切變引物序列使擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生（或消失）酶切位點位點第71頁/共86頁 用相應(yīng)的內(nèi)切酶對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行水解并作電用相應(yīng)的內(nèi)切酶對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行水解并作電泳分離，泳分離，PC

36、RPCR產(chǎn)物能（或不能）被酶水解而產(chǎn)物能（或不能）被酶水解而產(chǎn)生不同長度的片段產(chǎn)生不同長度的片段 根據(jù)水解片段的大小和相應(yīng)電泳位置可區(qū)分根據(jù)水解片段的大小和相應(yīng)電泳位置可區(qū)分野生型和突變型靶基因片段野生型和突變型靶基因片段一、一、 PCR-PCR-限制性片段長度多態(tài)性限制性片段長度多態(tài)性第72頁/共86頁EcoRI 水解 A B C A B C一、一、 PCR-PCR-限制性片段長度多態(tài)性限制性片段長度多態(tài)性第73頁/共86頁二、二、等位基因特異性寡核苷酸等位基因特異性寡核苷酸 用寡核苷酸探針和用寡核苷酸探針和PCRPCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交檢測點產(chǎn)物進(jìn)行雜交檢測點突變的技術(shù)突變的技術(shù) 被檢靶片段經(jīng)被

37、檢靶片段經(jīng)PCRPCR擴(kuò)增并經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移擴(kuò)增并經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到膜上，分別與經(jīng)標(biāo)記的野生型和突變型靶到膜上，分別與經(jīng)標(biāo)記的野生型和突變型靶基因序列的寡核苷酸探針雜交基因序列的寡核苷酸探針雜交第74頁/共86頁 PCRPCR產(chǎn)物僅與完全互補(bǔ)的探針進(jìn)行雜產(chǎn)物僅與完全互補(bǔ)的探針進(jìn)行雜交交 含突變序列的產(chǎn)物僅與突變探針雜交含突變序列的產(chǎn)物僅與突變探針雜交 根據(jù)有無雜交信號判斷被檢擴(kuò)增片段根據(jù)有無雜交信號判斷被檢擴(kuò)增片段中是否帶有突變點中是否帶有突變點二、等位基因特異性寡核苷酸第75頁/共86頁二、二、等位基因特異性寡核苷酸等位基因特異性寡核苷酸第76頁/共86頁不同順序 不同構(gòu)象 不同電泳行為三、三、單鏈構(gòu)象多態(tài)性單鏈構(gòu)象多態(tài)性 單鏈單鏈DNADNA分子的空間構(gòu)象，取決于該分子本分子的空