實(shí)驗(yàn)四、原生質(zhì)體的分離效率、體積和表面積測定 (1)

1、張群張群 生科樓生科樓E實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)11、 原生質(zhì)體的分離效率、體積和原生質(zhì)體的分離效率、體積和表面積的測定表面積的測定1、掌握原生質(zhì)的分離和提純技術(shù)；2、原生質(zhì)體積和表面積的測定；3、分離效率的測定（目視法和熒光雙醋酸酯法）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩?shí)驗(yàn)?zāi)康模簩?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理原生質(zhì)體的研究是近年來在生物學(xué)中比較活躍的領(lǐng)域之一。原生質(zhì)體的研究是近年來在生物學(xué)中比較活躍的領(lǐng)域之一。原生質(zhì)體（原生質(zhì)體（ProtoplastProtoplast）一詞的使用始自一詞的使用始自Hanstein(1880), 是指：是指：“用質(zhì)壁分離能夠和細(xì)胞壁分開的那部分物質(zhì)組成了一個原生質(zhì)體用質(zhì)壁分離能夠和細(xì)胞壁分開的那部分物質(zhì)組成了一

2、個原生質(zhì)體”或或“除去了全部細(xì)胞壁的細(xì)胞除去了全部細(xì)胞壁的細(xì)胞”，“一個為質(zhì)膜所包圍的裸露細(xì)胞一個為質(zhì)膜所包圍的裸露細(xì)胞”。原生質(zhì)體的分離和提純是植物生理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)中的一項(xiàng)基本技術(shù)。原生質(zhì)體的分離和提純是植物生理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)中的一項(xiàng)基本技術(shù)。利用制備的原生質(zhì)體可進(jìn)行離體培養(yǎng)、全能性表達(dá)、細(xì)胞壁再生、質(zhì)利用制備的原生質(zhì)體可進(jìn)行離體培養(yǎng)、全能性表達(dá)、細(xì)胞壁再生、質(zhì)膜特性，以及各種細(xì)胞操作（如原生體融合）、遺傳操作（如外源基膜特性，以及各種細(xì)胞操作（如原生體融合）、遺傳操作（如外源基因的導(dǎo)入）等，廣泛應(yīng)用于抗性生理、病性生理和細(xì)胞融合等領(lǐng)域。因的導(dǎo)入）等，廣泛應(yīng)用于抗性生理、病性生理和細(xì)胞融合

3、等領(lǐng)域。 早期分離制備原生質(zhì)體采用早期分離制備原生質(zhì)體采用機(jī)械法機(jī)械法。其。其缺點(diǎn)缺點(diǎn)是：是： （1）手續(xù)繁多，得率少；）手續(xù)繁多，得率少； （2）材料局限于具有較大液泡的細(xì)胞或長形細(xì)胞的組）材料局限于具有較大液泡的細(xì)胞或長形細(xì)胞的組織，如葉片、球莖的鱗片，果實(shí)表皮等?？棧缛~片、球莖的鱗片，果實(shí)表皮等。 直到直到1960年，年，Cocking 試用試用酶解法酶解法制備番茄原生質(zhì)制備番茄原生質(zhì)體首次獲得成功。體首次獲得成功。 其原理是細(xì)胞壁的組成物質(zhì)主要有纖維素、半纖維素其原理是細(xì)胞壁的組成物質(zhì)主要有纖維素、半纖維素和果膠等，利用和果膠等，利用纖維素酶和果膠酶纖維素酶和果膠酶等在一定的條件下等

4、在一定的條件下可將細(xì)胞壁的組成物質(zhì)分解掉，使得原生質(zhì)體游離出可將細(xì)胞壁的組成物質(zhì)分解掉，使得原生質(zhì)體游離出來。來。 圖1、利用酶解法獲得的蠶豆葉片細(xì)胞原生質(zhì)體A Root400 B Leaf400圖圖2 大豆幼苗根和葉片原生質(zhì)體的分離和純化大豆幼苗根和葉片原生質(zhì)體的分離和純化實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 未經(jīng)抗寒未經(jīng)抗寒鍛煉的小鍛煉的小麥幼苗麥幼苗 抗寒鍛煉抗寒鍛煉的小麥幼的小麥幼苗。苗。 儀器與藥品儀器與藥品光學(xué)顯微鏡、培養(yǎng)箱、血球計(jì)數(shù)板、計(jì)數(shù)器、物鏡和目鏡測微尺、小搖床、離心機(jī)、酸度計(jì)。纖維素酶、果膠酶、山梨醇、KCl、 CaCl2、山梨醇、金鋼砂。實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟（1 1）酶液配制：）酶液配制： 根

5、據(jù)酶液用量，用冰冷的含5mmol/L KCl、5mmol/L CaCl2、0.6mol/L山梨醇等滲溶液配制含1.5% 纖維素酶、0.5%果膠酶的溶液（用于分離未經(jīng)鍛煉的植物組織，經(jīng)鍛煉的植物組織用0.9mol/L 山梨醇等滲溶液配制），攪拌溶解，用1N HCl調(diào)pH至5.5, 1500g離心10分鐘，上清液（酶液）冷貯備用。等滲溶液（適用于等滲溶液（適用于鍛煉和非鍛煉材料鍛煉和非鍛煉材料2種）種）酶液（適用于鍛煉和酶液（適用于鍛煉和非鍛煉材料非鍛煉材料2種）種）原生體的分離：原生體的分離：（1）取小麥葉片（挑大者），去除尖端和基部后（中段）稱取0.5克；（2）置于培養(yǎng)皿中加入少量金鋼砂，用毛

6、刷刷去表皮角質(zhì)層，經(jīng)自來水沖洗后用濾紙吸干，葉面呈均勻水漬狀即可；（3）用鋒利剪刀或刀片將其制成2mm長的小段，放入100ml燒杯中加入10 ml酶液；（4）置于33-35C的培養(yǎng)箱內(nèi)的小搖床上（約30-40rpm）培養(yǎng)3h, 或靜置培養(yǎng)5h左右；（5）混合物經(jīng)雙層紗布過濾，以去除組織的殘余物，用500rpm離心3-5min, 小心果斷棄去上清液；（6）小心懸浮沉淀物，加相應(yīng)等滲溶液5ml稀釋；（7）再離心一次，去上清液，小心懸浮，用等滲溶液定容 至一定體積(0.2-0.5 ml, 具體視原生質(zhì)體數(shù)量而定）。計(jì)數(shù)和測定分離效率：計(jì)數(shù)和測定分離效率：熟悉血球計(jì)數(shù)板的使用和計(jì)數(shù)方法，按下列要求進(jìn)行

7、計(jì)數(shù)： （a) 洗凈、涼干計(jì)數(shù)板； (b) 上板均勻； (c) 以綠、亮、圓形的原生質(zhì)體為有活力的； (d) 同區(qū)域計(jì)數(shù)要設(shè)重復(fù)（10個左右）。因而可計(jì)算出每克鮮重葉片所分離出的原生質(zhì)體數(shù)(單位：個/g FW)。血球計(jì)數(shù)板的總體積為：0.30.3（長）（長） 0.30.3（寬）（寬） 0.010.01（厚）（厚）=0.0009(cm=0.0009(cm3 3) ) 原生質(zhì)體表面積（原生質(zhì)體表面積（SA）和體積（）和體積（V）的）的測定測定目鏡和物鏡測微尺的校正（?m/格目鏡）；離體原生質(zhì)體在等滲溶液中呈圓球形;計(jì)數(shù)要設(shè)重復(fù)（10個左右）懸浮于等滲溶液中的原生質(zhì)體的表面積和體積，可通過在高倍光學(xué)

8、顯微鏡下用目鏡和物鏡測微尺測量其直徑(D)而求得。為了便于在冰凍過程中對植物細(xì)胞的脫植物細(xì)胞的脫水情況和原生體失去滲透反應(yīng)能力水情況和原生體失去滲透反應(yīng)能力進(jìn)行定量的研究。 SA=4（D/2）2 V=4(D/2)3/3 圖3 物鏡測微尺示意圖4 目鏡測微尺示意圖5 目、物鏡測微尺校準(zhǔn)示意（舉例）提純：提純：可采用離心洗滌法和漂浮法兩種方法。離心洗滌法就是重復(fù)（二）中離心、棄上清、懸浮沉淀、加等滲液再離心、再棄上清和懸浮沉淀的過程，鏡檢直至滿意為止。其優(yōu)點(diǎn)是省事，但缺點(diǎn)是比原生質(zhì)體重的雜質(zhì)（如金鋼砂）去不掉。漂浮法：加4ml左右17%蔗糖溶液（用于未經(jīng)鍛煉的植物材料，鍛煉材料用23%的蔗糖溶液）于離心管中，再用彎頭吸管緩 慢加入等體積的 0.6mol/L山梨醇溶液（用于未經(jīng)鍛煉的植物材料，鍛煉材料用0.9mol/L山梨醇溶液）,使兩溶液間建立界面層，用彎頭吸管把1/3