反義核酸與RNAi

1、RNA干擾RNA interference，RNAiJ生物技術(shù)史上革命性事件核酸結(jié)構(gòu)與功能的揭示核酸結(jié)構(gòu)與功能的揭示1PCR技術(shù)技術(shù)2重組重組DNA技術(shù)技術(shù)3RNAi和反義技術(shù)和反義技術(shù)4概述 RNA干擾（干擾（RNA interference, RNAi）是指在進(jìn)化是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源）誘發(fā)的、同源mRNA高高效特異性降解的現(xiàn)象。效特異性降解的現(xiàn)象。目前對目前對RNAi (RNA interference)的定義有很多種，不同的定義有很多種，不同的資料對其定義的側(cè)重點(diǎn)也不盡相同，如果

2、將的資料對其定義的側(cè)重點(diǎn)也不盡相同，如果將RNAi看作一種生物學(xué)現(xiàn)象，可以有以下定義：看作一種生物學(xué)現(xiàn)象，可以有以下定義： RNAi是有是有dsRNA參與指導(dǎo)的，以外源和內(nèi)源參與指導(dǎo)的，以外源和內(nèi)源mRNA為降解目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象。具有核苷酸序列特異為降解目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象。具有核苷酸序列特異性的自我防御機(jī)制，是一種當(dāng)外源基因?qū)牖虿《救胄缘淖晕曳烙鶛C(jī)制，是一種當(dāng)外源基因?qū)牖虿《救肭趾?，?xì)胞中與轉(zhuǎn)基因或入侵病毒侵后，細(xì)胞中與轉(zhuǎn)基因或入侵病毒RNA同源的基因發(fā)同源的基因發(fā)生共同基因沉默的現(xiàn)象。生共同基因沉默的現(xiàn)象。 如果將其作為一門生物技術(shù)，則定義為如果將其作為一門生物技術(shù)，則定義為 ：R

3、NAi是指體外人工合成的或體內(nèi)的雙鏈?zhǔn)侵阁w外人工合成的或體內(nèi)的雙鏈RNA（dsRNA）在細(xì)胞內(nèi)特異性的將與之同源的）在細(xì)胞內(nèi)特異性的將與之同源的 mRNA降解成降解成21nt23nt 的小片段，使相應(yīng)的基因沉默。的小片段，使相應(yīng)的基因沉默。 RNAi是將與靶基因的是將與靶基因的mRNA 同源互補(bǔ)的雙鏈同源互補(bǔ)的雙鏈RNA(dsRNA ) 導(dǎo)入細(xì)胞導(dǎo)入細(xì)胞,能特異性地降解該能特異性地降解該mRNA ,從從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失, 屬于屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。 發(fā)

4、現(xiàn)過程 共抑制現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)共抑制現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn) u RNAi研究的早期線索來自于美國和荷蘭的兩個研究的早期線索來自于美國和荷蘭的兩個轉(zhuǎn)基因植物實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)基因植物實(shí)驗(yàn)組,約根森（約根森（Jorgensen）研究小組）研究小組 ,在對矮牽牛在對矮牽牛(petunias)進(jìn)行的研究中有個奇怪的發(fā)進(jìn)行的研究中有個奇怪的發(fā)現(xiàn)現(xiàn):u 他們設(shè)想將更多的色素基因注入矮腳牽牛植物他們設(shè)想將更多的色素基因注入矮腳牽牛植物體中，試圖加深花朵的紫顏色，而結(jié)果出其預(yù)料，體中，試圖加深花朵的紫顏色，而結(jié)果出其預(yù)料，轉(zhuǎn)基因的植株不僅沒有新基因表達(dá)，反而使原有的轉(zhuǎn)基因的植株不僅沒有新基因表達(dá)，反而使原有的色素基因也受到了抑制。色素基

5、因也受到了抑制。加入 chalcone synthase基因 or轉(zhuǎn)基因發(fā)現(xiàn)過程 Jorgensen 將這種現(xiàn)象命名為將這種現(xiàn)象命名為 共抑制共抑制(cosuppression) 因?yàn)閷?dǎo)入的基因和其相似的內(nèi)源基因同因?yàn)閷?dǎo)入的基因和其相似的內(nèi)源基因同時都被抑制。時都被抑制。 發(fā)現(xiàn)過程發(fā)現(xiàn)過程 Quelling現(xiàn)象現(xiàn)象 并非只有植物學(xué)家才注意到了這種意外的現(xiàn)象并非只有植物學(xué)家才注意到了這種意外的現(xiàn)象。 1994年意大利的意大利的Cogoni等等,將外源類胡蘿卜素基將外源類胡蘿卜素基因?qū)腈滄呙挂驅(qū)腈滄呙?Neurosporacrassa),結(jié)果轉(zhuǎn)化細(xì)胞中結(jié)果轉(zhuǎn)化細(xì)胞中內(nèi)源性的類胡蘿卜素基因也受到

6、了抑制。而在真菌內(nèi)源性的類胡蘿卜素基因也受到了抑制。而在真菌轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中這種共抑制現(xiàn)象被稱轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中這種共抑制現(xiàn)象被稱 “quelling”（現(xiàn)象?，F(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)過程J 95年康乃爾大學(xué)的研究人員年康乃爾大學(xué)的研究人員Guo(郭蘇郭蘇)和和kemphues在秀在秀麗線蟲麗線蟲(C.elegans)中用反義中用反義RNA 阻止一些基因的表達(dá)，給阻止一些基因的表達(dá)，給對照組用正義對照組用正義RNA不但不增加該基因的表達(dá)，反而產(chǎn)生與不但不增加該基因的表達(dá)，反而產(chǎn)生與反義反義RNA 同樣的結(jié)果同樣的結(jié)果特異性阻斷該基因的表達(dá)，這個特異性阻斷該基因的表達(dá)，這個奇怪的現(xiàn)象直到奇怪的現(xiàn)象直到3年后年后1998

7、才被解開。才被解開。J 1998年年Fire等發(fā)現(xiàn)將等發(fā)現(xiàn)將ds RNA注入秀麗線蟲可顯著抑制特注入秀麗線蟲可顯著抑制特定基因的表達(dá)，并證明了定基因的表達(dá)，并證明了Guo和和kemphues所發(fā)現(xiàn)的正義所發(fā)現(xiàn)的正義RNA的基因壓制作用其實(shí)是轉(zhuǎn)錄時污染微量的基因壓制作用其實(shí)是轉(zhuǎn)錄時污染微量dsRNA所造成所造成的。的。 線蟲體內(nèi)的RNAi線蟲中RNAi效應(yīng)的檢測（左面）兩條線蟲表現(xiàn)為綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)類型品系，該品系含有一個普遍性表達(dá)的GFP報(bào)告基因重組質(zhì)粒（帶有核內(nèi)定位信號位點(diǎn)）。（右面）喂食表達(dá)針對GFP的dsRNA的細(xì)菌后，整個蟲體的GFP信號消失。發(fā)現(xiàn)過程p將制備的將制備的RNA

8、高度純化后發(fā)現(xiàn)，正義高度純化后發(fā)現(xiàn)，正義RNA無基因抑無基因抑制作用，反義制作用，反義RNA的基因抑制作用也很微弱，而用的基因抑制作用也很微弱，而用純化后的純化后的dsRNA注入線蟲，卻能高效、特異地阻斷注入線蟲，卻能高效、特異地阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。相應(yīng)基因的表達(dá)。p實(shí)驗(yàn)證明雙鏈實(shí)驗(yàn)證明雙鏈RNA抑制基因的表達(dá)的效率比純化后抑制基因的表達(dá)的效率比純化后的反義的反義RNA至少高幾個數(shù)量至少高幾個數(shù)量 ，他們稱此現(xiàn)象為，他們稱此現(xiàn)象為ds RNA介導(dǎo)的介導(dǎo)的RNA干擾（干擾（RNAi）。）。 Effects of mex-3 RNA interference on levels of the en

9、dogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos. (A) Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. (B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). (C) Embryo from par

10、ent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. (D) Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Templates used for interfe

11、ring RNA and in situ probes were largely non-overlapping.) RNA干擾的發(fā)現(xiàn)干擾的發(fā)現(xiàn) 安德魯安德魯菲爾菲爾(AndrewZ.Fire)、克雷格、克雷格梅洛梅洛(Craig C.Mello) 1998年發(fā)現(xiàn)了年發(fā)現(xiàn)了RNA干擾和基因沉默現(xiàn)象干擾和基因沉默現(xiàn)象。其論文發(fā)表在。其論文發(fā)表在1998年的年的NATRUE雜志上。雜志上。Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by d

12、ouble-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature. 1998 Feb 19;391(6669):806-811. 發(fā)現(xiàn)過程 RNAi現(xiàn)象的普遍性現(xiàn)象的普遍性 隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)RNAi也存在也存在于水稻、煙草、果蠅、小于水稻、煙草、果蠅、小鼠及人等幾乎所有的真核鼠及人等幾乎所有的真核生物中。生物中。RNAi能高效特能高效特異的阻斷基因的表達(dá)，在異的阻斷基因的表達(dá)，在線蟲，果蠅體內(nèi)，線蟲，果蠅體內(nèi)，RNAi能達(dá)到基因敲除的效果。能達(dá)到基因敲除的效果。2006年年10月月2日瑞典皇家科學(xué)院諾貝爾獎委員會日瑞典皇家科學(xué)院諾貝爾獎委員會宣布，

13、將宣布，將2006年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎授予年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎授予兩名美國科學(xué)安德魯兩名美國科學(xué)安德魯法爾和克雷格法爾和克雷格梅洛，以表梅洛，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了彰他們發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象。法爾和梅洛將分干擾現(xiàn)象。法爾和梅洛將分享一千萬瑞典克朗的獎金享一千萬瑞典克朗的獎金(137萬美元萬美元)。 RNA干擾獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)干擾獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獎 目前普遍認(rèn)為，共抑制、基因壓制和目前普遍認(rèn)為，共抑制、基因壓制和RNAi很可能具有相很可能具有相同的分子機(jī)制，都是通過同的分子機(jī)制，都是通過dsRNA的介導(dǎo)而特異地降解靶的介導(dǎo)而特異地降解靶mRNA, 抑制相應(yīng)基因的表達(dá)。抑制相應(yīng)基因

14、的表達(dá)。 實(shí)際上，法爾在接受諾貝爾獎網(wǎng)站采訪時提到，第一個在實(shí)際上，法爾在接受諾貝爾獎網(wǎng)站采訪時提到，第一個在線蟲中觀察到線蟲中觀察到(RNA干擾干擾)這種特別現(xiàn)象的是康奈爾大學(xué)研這種特別現(xiàn)象的是康奈爾大學(xué)研究生究生郭蘇郭蘇。 1995年，從復(fù)旦大學(xué)畢業(yè)后赴美的郭蘇在坎菲斯年，從復(fù)旦大學(xué)畢業(yè)后赴美的郭蘇在坎菲斯(KennethKemphues)指導(dǎo)下，試圖阻斷秀麗新小桿線蟲的某個基因指導(dǎo)下，試圖阻斷秀麗新小桿線蟲的某個基因時，意外地發(fā)現(xiàn)反義和正義這兩種單鏈時，意外地發(fā)現(xiàn)反義和正義這兩種單鏈RNA都阻斷了該基都阻斷了該基因的表達(dá)。因的表達(dá)。 但可惜的是，她和坎菲斯一直沒能解釋這個奇怪現(xiàn)象。直但可

15、惜的是，她和坎菲斯一直沒能解釋這個奇怪現(xiàn)象。直到到3年后，當(dāng)時在卡內(nèi)基研究所供職的法爾和梅洛才揭開年后，當(dāng)時在卡內(nèi)基研究所供職的法爾和梅洛才揭開了謎底：在郭蘇的實(shí)驗(yàn)中，體外轉(zhuǎn)錄所得了謎底：在郭蘇的實(shí)驗(yàn)中，體外轉(zhuǎn)錄所得RNA污染了微量污染了微量的雙鏈的雙鏈RNA，而經(jīng)過純化的雙鏈，而經(jīng)過純化的雙鏈RNA能夠高效率地阻斷相能夠高效率地阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。這就是應(yīng)基因的表達(dá)。這就是RNA干擾。干擾。 郭蘇目前在舊金山加州大學(xué)任職。她說：郭蘇目前在舊金山加州大學(xué)任職。她說：“他們在我們工他們在我們工作的基礎(chǔ)上，解釋了我們那個讓人迷惑的現(xiàn)象，是一個飛作的基礎(chǔ)上，解釋了我們那個讓人迷惑的現(xiàn)象，是一個飛躍躍

16、我和坎菲斯通過話，我們的工作在這個獎項(xiàng)中有所我和坎菲斯通過話，我們的工作在這個獎項(xiàng)中有所貢獻(xiàn)，我們?yōu)榇烁械阶院?，也都認(rèn)為安德魯貢獻(xiàn)，我們?yōu)榇烁械阶院?，也都認(rèn)為安德魯法爾和克雷格法爾和克雷格理應(yīng)獲獎。理應(yīng)獲獎?！?amp;在實(shí)驗(yàn)時，要認(rèn)真觀察每個現(xiàn)象，發(fā)在實(shí)驗(yàn)時，要認(rèn)真觀察每個現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)懷疑并給予證明，不要被誤導(dǎo)。現(xiàn)懷疑并給予證明，不要被誤導(dǎo)。正如美國西北大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教授饒毅所說：正如美國西北大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教授饒毅所說：“法爾的法爾的發(fā)現(xiàn)打開了一個新的研究領(lǐng)域，它既是一項(xiàng)科學(xué)發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)打開了一個新的研究領(lǐng)域，它既是一項(xiàng)科學(xué)發(fā)現(xiàn)，也是一項(xiàng)技術(shù)發(fā)明，為治療人類許多疾病提供了新的希也是一項(xiàng)技術(shù)發(fā)明，

17、為治療人類許多疾病提供了新的希望，這項(xiàng)成就和兩位華人很有關(guān)系，其中一位就是法爾望，這項(xiàng)成就和兩位華人很有關(guān)系，其中一位就是法爾實(shí)驗(yàn)室的研究技術(shù)員徐思群實(shí)驗(yàn)室的研究技術(shù)員徐思群”。 畢業(yè)于上海第二醫(yī)科大學(xué)的徐思群是那篇畢業(yè)于上海第二醫(yī)科大學(xué)的徐思群是那篇自然自然論文的第二作者。自論文的第二作者。自1992年起，從美國拿到碩士學(xué)位年起，從美國拿到碩士學(xué)位的他在法爾實(shí)驗(yàn)室以研究技術(shù)員身份工作了的他在法爾實(shí)驗(yàn)室以研究技術(shù)員身份工作了6年。但他年。但他扮演的角色不只是通常意義上負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)室日常運(yùn)作的扮演的角色不只是通常意義上負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)室日常運(yùn)作的“管家管家”?！耙粋€科學(xué)實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一

18、個科學(xué)實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析理解，這當(dāng)然要?dú)w功于安迪和克雷格。我經(jīng)常說分析理解，這當(dāng)然要?dú)w功于安迪和克雷格。我經(jīng)常說我是小人，因?yàn)樾∪藙邮?，君子動口和動腦，我不過我是小人，因?yàn)樾∪藙邮?，君子動口和動腦，我不過是把他們的實(shí)驗(yàn)意圖比較完整地在實(shí)驗(yàn)臺上體現(xiàn)出來是把他們的實(shí)驗(yàn)意圖比較完整地在實(shí)驗(yàn)臺上體現(xiàn)出來。”徐思群說。徐思群說。 u法爾和梅洛等人的研究發(fā)表以后，激發(fā)法爾和梅洛等人的研究發(fā)表以后，激發(fā)了全球研究人員對了全球研究人員對RNA干擾領(lǐng)域的興趣。干擾領(lǐng)域的興趣。u2001年和年和2002年，美國年，美國科學(xué)科學(xué)雜志連續(xù)雜志連續(xù)將將RNA干擾列入年度十大科學(xué)進(jìn)展干擾列入年度十大

19、科學(xué)進(jìn)展 。 轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing, TGS) 轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS)TGS是指轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞核內(nèi)RNA 合成受到了阻止而導(dǎo)致基因沉默。PTGS 則是指轉(zhuǎn)基因能夠在細(xì)胞核里被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)錄，但在細(xì)胞質(zhì)里卻無相應(yīng)的mRNA 存在這一現(xiàn)象。基因沉默RNA干擾的分子機(jī)制干擾的分子機(jī)制 J基因沉默基因沉默RNA干擾的分子機(jī)制干擾的分子機(jī)制 1.dsRNA的產(chǎn)生的產(chǎn)生:內(nèi)源性內(nèi)源性:p包括細(xì)胞內(nèi)源性基因的雙向表達(dá)包括細(xì)胞內(nèi)源性基因的雙向表達(dá);p具有反向重復(fù)序列的細(xì)胞內(nèi)

20、源性基因表達(dá)產(chǎn)具有反向重復(fù)序列的細(xì)胞內(nèi)源性基因表達(dá)產(chǎn)生的短發(fā)夾生的短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA， shRN A)等等外源性外源性:p以轉(zhuǎn)基因表達(dá)的以轉(zhuǎn)基因表達(dá)的mRNA 為模板，通過異常聚合作為模板，通過異常聚合作用形成用形成dsRNA;p真核生物基因組中的轉(zhuǎn)座子在復(fù)制表達(dá)過程真核生物基因組中的轉(zhuǎn)座子在復(fù)制表達(dá)過程 中產(chǎn)中產(chǎn)生的生的dsRNA;pRNA病毒基因組或病毒感染復(fù)制過程中產(chǎn)生的病毒基因組或病毒感染復(fù)制過程中產(chǎn)生的dsRNA中間產(chǎn)物中間產(chǎn)物;p采采 用化學(xué)合成的用化學(xué)合成的dsRNA;或用質(zhì)粒或病毒載體表達(dá)或用質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)所需的所需的dsRNA等等 siRN

21、A制備方法制備方法 化學(xué)合成化學(xué)合成 體外轉(zhuǎn)錄法合成體外轉(zhuǎn)錄法合成siRNA siRNA表達(dá)載體表達(dá)載體 siRNA表達(dá)框架表達(dá)框架siRNA設(shè)計(jì)的原則設(shè)計(jì)的原則 siRNA雙鏈設(shè)計(jì)時，一般在靶雙鏈設(shè)計(jì)時，一般在靶mRNA起始密碼下游起始密碼下游100200 bp至翻譯終止密碼上游至翻譯終止密碼上游50100 bp的范圍內(nèi)搜尋的范圍內(nèi)搜尋AA序列，并記錄每個序列，并記錄每個AA 3 端相鄰端相鄰19個核苷酸作為候選個核苷酸作為候選siRNA靶位點(diǎn)。靶位點(diǎn)。 建議設(shè)計(jì)的建議設(shè)計(jì)的siRNA不要針對不要針對mRNA的的5 和和3 端非編碼區(qū)端非編碼區(qū)(untranslated regions，UT

22、Rs)，因?yàn)檫@些區(qū)域有豐富，因?yàn)檫@些區(qū)域有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)，而的調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)，而UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響復(fù)合物可能會影響siRNP(siRNA protein complex，核，核酸內(nèi)切酶復(fù)合物酸內(nèi)切酶復(fù)合物)結(jié)合結(jié)合mRNA，從而影響，從而影響siRNA干擾的干擾的效果效果 。 最后還應(yīng)將候選最后還應(yīng)將候選siRNA序列在序列在GenBank進(jìn)行進(jìn)行BLAST檢檢索，與非同源基因具有索，與非同源基因具有3個或個或3個以上堿基相異的序列個以上堿基相異的序列方可選用。方可選用。化學(xué)合成化學(xué)合成 早期早期RNAi實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)中，dsRNA或或siR

23、NA均由化學(xué)法所均由化學(xué)法所合成?；瘜W(xué)合成的合成?；瘜W(xué)合成的siRNA純度高，合成量不受限純度高，合成量不受限制，且還可對制，且還可對siRNA進(jìn)行標(biāo)記，方便對其跟蹤，進(jìn)行標(biāo)記，方便對其跟蹤，但該方法價(jià)格昂貴，不適用于但該方法價(jià)格昂貴，不適用于siRNA序列的篩選序列的篩選和長期基因沉默實(shí)驗(yàn)。和長期基因沉默實(shí)驗(yàn)。 體外轉(zhuǎn)錄法合成體外轉(zhuǎn)錄法合成siRNA較為經(jīng)濟(jì)。根據(jù)較為經(jīng)濟(jì)。根據(jù)siRNA序列序列合成相應(yīng)合成相應(yīng)DNA Oligo模板，再利用模板，再利用T7 RNA聚合酶進(jìn)聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，分別獲得行體外轉(zhuǎn)錄，分別獲得siRNA的正義鏈和反義鏈，的正義鏈和反義鏈，然后將其退火、純化即可得到能

24、直接導(dǎo)入細(xì)胞的然后將其退火、純化即可得到能直接導(dǎo)入細(xì)胞的siRNA。 體外轉(zhuǎn)錄法最大缺點(diǎn)是體外轉(zhuǎn)錄法最大缺點(diǎn)是siRNA合成量受限制，不過合成量受限制，不過其價(jià)格較低，毒性小，穩(wěn)定性好，效率高。其價(jià)格較低，毒性小，穩(wěn)定性好，效率高。體外轉(zhuǎn)錄法合成體外轉(zhuǎn)錄法合成siRNAConstruction of siRNA by T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription.siRNA表達(dá)載體表達(dá)載體 體外合成體外合成siRNA，不宜進(jìn)行長期基因沉默研究。借助，不宜進(jìn)行長期基因沉默研究。借助表達(dá)質(zhì)?；虿《据d體在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒或病毒載體在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生s

25、iRNA，使研究者，使研究者無需直接操作無需直接操作RNA就可達(dá)到長期抑制靶基因表達(dá)的目就可達(dá)到長期抑制靶基因表達(dá)的目的，且載體上的抗性標(biāo)記有助于快速篩選出陽性克隆的，且載體上的抗性標(biāo)記有助于快速篩選出陽性克隆，這將具有更為廣闊的應(yīng)用前景。，這將具有更為廣闊的應(yīng)用前景。短發(fā)夾短發(fā)夾RNA (shRNA) shRNA表達(dá)質(zhì)粒多采用表達(dá)質(zhì)粒多采用RNA聚合酶聚合酶 啟動子啟動子 (pol)。pol 在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)引導(dǎo)非編碼小在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)引導(dǎo)非編碼小RNA的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物無的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物無poly(A)尾，且在轉(zhuǎn)錄過尾，且在轉(zhuǎn)錄過程中遇到連續(xù)程中遇到連續(xù)45個個U時轉(zhuǎn)錄終止。時轉(zhuǎn)錄終止。 此

26、載體最后轉(zhuǎn)錄出的產(chǎn)物是經(jīng)折疊形成的發(fā)夾狀小此載體最后轉(zhuǎn)錄出的產(chǎn)物是經(jīng)折疊形成的發(fā)夾狀小RNA (small hairpin RNA，shRNA)；shRNA在細(xì)在細(xì)胞內(nèi)被胞內(nèi)被Dicer酶切割成酶切割成3 端帶有兩個端帶有兩個U突出的突出的siRNA，進(jìn)而啟動，進(jìn)而啟動RNAi，介導(dǎo)基因沉默。載體中的間隔，介導(dǎo)基因沉默。載體中的間隔序列為序列為9個核苷酸時最為有效。個核苷酸時最為有效。 (A) U6 or H1 PolIII promoters drive the expression of a hairpin structure in which the sense and antisens

27、e strands of the siRNAare connected by a loop sequence. (B) Two U6- or H1-based expression cassettes are used to drive the separate transcription of the sense and antisense strands in the cell. The two strands would then anneal to form a double-stranded siRNA. An oligo-U overhang is present on each

28、strand. (C) A PolII promoter (a shortened version of the human CMV) drives the expression of a hairpin siRNA. The transcript includes extra nucleotides at its 5 end and a poly-A tail (instead of an oligo-U) overhang at the 3 end.L用病毒載體介導(dǎo)用病毒載體介導(dǎo)RNAi近年來受到人們重點(diǎn)關(guān)注。利近年來受到人們重點(diǎn)關(guān)注。利用病毒載體可以解決質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低、效果不穩(wěn)定用病毒載

29、體可以解決質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低、效果不穩(wěn)定且某些類型細(xì)胞不能轉(zhuǎn)染等問題，從而擴(kuò)大且某些類型細(xì)胞不能轉(zhuǎn)染等問題，從而擴(kuò)大RNAi應(yīng)應(yīng)用范圍。常見病毒載體有腺病毒用范圍。常見病毒載體有腺病毒(Adenovirus)載體、載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus)載體、慢病毒載體、慢病毒 (Lentivirus)載載體等。體等。RNAi 的機(jī)制2. dsRNA被加工成被加工成小干擾小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）。）。 pdsRNA是是RNAi的初始誘導(dǎo)因子，的初始誘導(dǎo)因子， 但是但是dsRNA必須被必須被Dicer酶酶進(jìn)一步加工成長度為進(jìn)一步加工成長度為21

30、 - 23個核苷酸的個核苷酸的siRNA才能產(chǎn)生才能產(chǎn)生RNAi反反 應(yīng)。應(yīng)。 pDicer酶屬酶屬RNase家族中的第二類：家族中的第二類：l兩個兩個RNase結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域l一個一個dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合結(jié)構(gòu)域( dsRNA-binding domain， dsRBD) ，l一個解旋酶結(jié)構(gòu)域一個解旋酶結(jié)構(gòu)域(helicase domain)l一個一個PAZ結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域 體外實(shí)驗(yàn)表明，人重組體外實(shí)驗(yàn)表明，人重組Dicer酶對酶對dsRNA切割時，切割時，PAZ結(jié)構(gòu)域綁定結(jié)構(gòu)域綁定dsRNA的末端，的末端，dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域綁定結(jié)合結(jié)構(gòu)域綁定dsRNA 內(nèi)部，隨后通過兩個內(nèi)部，隨后通過兩個R

31、Nase結(jié)構(gòu)域?qū)Y(jié)構(gòu)域?qū)sRNA的的雙鏈分別進(jìn)行切割成雙鏈分別進(jìn)行切割成 長度約長度約22個核昔酸的個核昔酸的siRNA片段片段 。usiRNA片段帶有片段帶有5端磷酸基團(tuán)，在其端磷酸基團(tuán)，在其 3端有端有2個突出個突出的核苷酸的核苷酸 3.RISC裝載裝載siRNA p裝載裝載siRNA的的RISC ( RNA - induced silencing complex. RISC) 被稱為被稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，由誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，由多種蛋白組成，其中關(guān)鍵成分是具核擊內(nèi)切酶活性多種蛋白組成，其中關(guān)鍵成分是具核擊內(nèi)切酶活性的的Argonaut2 ( Ago2 )蛋白。蛋白。 psiRNA

32、 在在ATP參與下被參與下被RNA解旋酶解旋成單鏈，解旋酶解旋成單鏈，并由其中反義鏈指導(dǎo)形成并由其中反義鏈指導(dǎo)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC由由siRNA、解旋酶、解旋酶、ATP、核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶等、核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶等多種成分組成。多種成分組成。RNAi 的機(jī)制 4. RISC剪切剪切mRNA pRISC裝載裝載siRNA的引導(dǎo)鏈而處于激活狀態(tài)，尋找和識的引導(dǎo)鏈而處于激活狀態(tài)，尋找和識別與之匹配的別與之匹配的mRNA，對，對mRNA進(jìn)行剪切，這一過程與進(jìn)行剪切，這一過程與前面提及的對前面提

33、及的對siRNA過客鏈的剪切過程類似。過客鏈的剪切過程類似。 pRISC剪切剪切mRNA可可以重復(fù)使用；可可以重復(fù)使用；p RISC剪切剪切mRNA位點(diǎn)一般處于位點(diǎn)一般處于siRNA的的5端數(shù)起的端數(shù)起的第第11個到第個到第12個堿基相對應(yīng)的位置。個堿基相對應(yīng)的位置。 p剪切過程不依賴于剪切過程不依賴于ATP的，但是有的，但是有ATP存在的情況存在的情況下，下，ATP可能促可能促 進(jìn)進(jìn)RISC對對mRNA剪切后產(chǎn)物的釋放，剪切后產(chǎn)物的釋放，或使或使RISC回復(fù)構(gòu)象準(zhǔn)備第二次剪切，回復(fù)構(gòu)象準(zhǔn)備第二次剪切， RNAi的機(jī)制的機(jī)制RNAiRNAi的放大效應(yīng)機(jī)制的放大效應(yīng)機(jī)制siRNA不僅可引導(dǎo)不僅可

34、引導(dǎo)RISC切割靶切割靶RNA，而且可作為引，而且可作為引物在物在RNA依賴的依賴的RNA聚合酶聚合酶(RdRP)作用下以靶作用下以靶mRNA為模板合成新的為模板合成新的dsRNA。新合成的長鏈新合成的長鏈dsRNA同樣可被同樣可被RNase樣核酸酶切割、樣核酸酶切割、降解而生成大量的降解而生成大量的次級次級siRNA。次級。次級siRNA又可進(jìn)入又可進(jìn)入合成合成-切割的循環(huán)過程，進(jìn)一步放大切割的循環(huán)過程，進(jìn)一步放大RNAi作用。這種作用。這種合成合成-切割的循環(huán)過程稱為切割的循環(huán)過程稱為隨機(jī)降解性隨機(jī)降解性PCR（random degradative PCR）。）。Gisela Storz,

35、 Science, 296(5571):1263-1265, 2002.RNAi 的特點(diǎn)PTGS 是指轉(zhuǎn)基因能夠在細(xì)胞核里被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)錄，但在細(xì)胞質(zhì)里卻無相應(yīng)的mRNA 存在這一現(xiàn)象 能夠非常特異地降解與之序列相應(yīng)的單個內(nèi)源基因的mRNA RNAi 的特點(diǎn)相對少量的dsRNA就可以使相應(yīng)的基因表達(dá)受抑制 RNAi基因表達(dá)的效應(yīng)可以突破細(xì)胞的界限，傳遞給子一代 (可遺傳給F1，但F2往往恢復(fù)為野生型。)RNA i應(yīng)用應(yīng)用1. RNA干擾介導(dǎo)的細(xì)胞發(fā)育調(diào)控干擾介導(dǎo)的細(xì)胞發(fā)育調(diào)控 n線蟲中調(diào)節(jié)幼蟲發(fā)育的線蟲中調(diào)節(jié)幼蟲發(fā)育的Lin14 基因受到基因受到Lin4基因基因控制。控制。Lin4基因基因轉(zhuǎn)錄物經(jīng)

36、轉(zhuǎn)錄物經(jīng)Dicer酶切割后產(chǎn)生一種由酶切割后產(chǎn)生一種由22個核苷酸組成的個核苷酸組成的miRNA，然，然后該后該miRNA可以和可以和Lin14 mRNA3 端非翻譯區(qū)中存在的端非翻譯區(qū)中存在的7個重復(fù)序個重復(fù)序 列互補(bǔ)配對，導(dǎo)致該列互補(bǔ)配對，導(dǎo)致該mRNA的降解。的降解。 n人類細(xì)胞中存在幾百種不同的人類細(xì)胞中存在幾百種不同的miRNA，它們形成了一個十分復(fù)，它們形成了一個十分復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在發(fā)育時間調(diào)控、造血細(xì)胞分雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在發(fā)育時間調(diào)控、造血細(xì)胞分 化、細(xì)胞繁殖、細(xì)化、細(xì)胞繁殖、細(xì)胞凋亡、組織發(fā)育等過程中扮演重要的角色。胞凋亡、組織發(fā)育等過程中扮演重要的角色。 n果蠅中也發(fā)現(xiàn)果蠅中

37、也發(fā)現(xiàn)miRNA調(diào)控一套特殊的基因，使其在細(xì)胞發(fā)育過調(diào)控一套特殊的基因，使其在細(xì)胞發(fā)育過程中適時表達(dá)程中適時表達(dá) 2. RNA干擾和病毒防御干擾和病毒防御 pRNA沉默是植物和無脊椎動物主要的病毒防御機(jī)制；沉默是植物和無脊椎動物主要的病毒防御機(jī)制； p病毒本身既是病毒本身既是 RNA干擾的誘導(dǎo)物，又是干擾的誘導(dǎo)物，又是RNA干擾的攻擊干擾的攻擊目標(biāo)；目標(biāo)； p病毒為了抵抗病毒為了抵抗RNA干擾的攻擊，普遍編碼了干擾的攻擊，普遍編碼了RNA干擾的干擾的抑制蛋白抑制蛋白 。p迄今為止未發(fā)現(xiàn)在病毒感染哺乳動物細(xì)胞過程中能自然迄今為止未發(fā)現(xiàn)在病毒感染哺乳動物細(xì)胞過程中能自然誘發(fā)有效的防御病毒的誘發(fā)有效

38、的防御病毒的RNA干擾反應(yīng)。干擾反應(yīng)。 3. 基因治療：基因治療： 在利用在利用RNAi技術(shù)對技術(shù)對HIV、乙型肝炎、丙型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎等進(jìn)行基因治療等進(jìn)行基因治療研究中發(fā)現(xiàn)，選擇病毒基因組中與人類基因組無同源性的序列作研究中發(fā)現(xiàn)，選擇病毒基因組中與人類基因組無同源性的序列作為抑制序列可在抑制病毒復(fù)制的同時避免對正常組織的毒副作用。為抑制序列可在抑制病毒復(fù)制的同時避免對正常組織的毒副作用。同時將抑制序列選擇在特定的位點(diǎn)，可對部分有明確基因突變同時將抑制序列選擇在特定的位點(diǎn)，可對部分有明確基因突變的的惡性腫瘤惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡誘導(dǎo)作用以及抑制細(xì)胞產(chǎn)生凋亡誘導(dǎo)作用以及抑制MDR 基因。

39、 科學(xué)家們已經(jīng)應(yīng)用科學(xué)家們已經(jīng)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，在多種不同的動物疾病模型干擾技術(shù)，在多種不同的動物疾病模型中獲得了良好療效。目前，中獲得了良好療效。目前，6種基于該技術(shù)的藥物已經(jīng)在美國進(jìn)種基于該技術(shù)的藥物已經(jīng)在美國進(jìn)入入II期臨床試驗(yàn)。期臨床試驗(yàn)。4. RNAi在探索基因功能中的應(yīng)用：在探索基因功能中的應(yīng)用：n在在RNAi技術(shù)出現(xiàn)以前，基因敲除（技術(shù)出現(xiàn)以前，基因敲除（gene knockout）是主要的反）是主要的反向遺傳學(xué)（向遺傳學(xué)（reverse genetics）研究手段，但其技術(shù)難度較高、操作）研究手段，但其技術(shù)難度較高、操作復(fù)雜、周期長。復(fù)雜、周期長。n 由于由于RNAi技術(shù)可以

40、利用技術(shù)可以利用siRNA或或siRNA表達(dá)載體快速、經(jīng)濟(jì)、表達(dá)載體快速、經(jīng)濟(jì)、簡便的以序列特異方式剔除目的基因表達(dá)，所以現(xiàn)在已經(jīng)成為探簡便的以序列特異方式剔除目的基因表達(dá)，所以現(xiàn)在已經(jīng)成為探索基因功能的重要研究手段。同時索基因功能的重要研究手段。同時siRNA表達(dá)文庫構(gòu)建方法的建表達(dá)文庫構(gòu)建方法的建立，使得利用立，使得利用RNAi技術(shù)進(jìn)行高通量篩選成為可能，對闡明信號轉(zhuǎn)技術(shù)進(jìn)行高通量篩選成為可能，對闡明信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點(diǎn)有重要意義。導(dǎo)通路、發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點(diǎn)有重要意義。 總總 述述 J植物、動物、人類都存在植物、動物、人類都存在RNA干擾現(xiàn)象，干擾現(xiàn)象，RNA干擾已經(jīng)作為一

41、種干擾已經(jīng)作為一種強(qiáng)大的強(qiáng)大的“基因沉默基因沉默”技術(shù)而出現(xiàn)。技術(shù)而出現(xiàn)。JRNAi技術(shù)與基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和功能蛋白質(zhì)組學(xué)密切相關(guān)，技術(shù)與基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和功能蛋白質(zhì)組學(xué)密切相關(guān)，因此，因此， RNAi本身可作為一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)為生物工程及制藥業(yè)等相關(guān)本身可作為一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)為生物工程及制藥業(yè)等相關(guān)行業(yè)服務(wù)，從而在更深更廣的領(lǐng)域發(fā)揮其作用。行業(yè)服務(wù)，從而在更深更廣的領(lǐng)域發(fā)揮其作用。J動物實(shí)驗(yàn)已證明，可以通過動物實(shí)驗(yàn)已證明，可以通過RNAi的方法使導(dǎo)致血膽固醇升高的基的方法使導(dǎo)致血膽固醇升高的基因因“沉默沉默”；病毒性疾病，眼疾，心血管代謝性疾病等方面的臨床；病毒性疾病，眼疾，心血管代謝性疾病

42、等方面的臨床試驗(yàn)也正在進(jìn)行中；這一方法為病毒性肝炎、艾滋病和腫瘤等人類試驗(yàn)也正在進(jìn)行中；這一方法為病毒性肝炎、艾滋病和腫瘤等人類頑疾的治療指了一條新路頑疾的治療指了一條新路 。RNA干干 擾的治療技術(shù)正在進(jìn)入人體試驗(yàn)階段，擾的治療技術(shù)正在進(jìn)入人體試驗(yàn)階段，不過還有一些不過還有一些難題難題有待解決有待解決:如何在生物體內(nèi)如何在生物體內(nèi) 實(shí)現(xiàn)有效的組織特異性的實(shí)現(xiàn)有效的組織特異性的siRNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染染;如何降低這種療法對目的基因以外的其他基如何降低這種療法對目的基因以外的其他基 因的影因的影響，從而避免產(chǎn)生副作用響，從而避免產(chǎn)生副作用;如何實(shí)現(xiàn)如何實(shí)現(xiàn)RNA干擾效應(yīng)在細(xì)胞與細(xì)胞、組織與組織干擾效應(yīng)在

43、細(xì)胞與細(xì)胞、組織與組織 間的系統(tǒng)性擴(kuò)散等。間的系統(tǒng)性擴(kuò)散等。 反義核酸及藥物 一、反義核酸概述： 反義核酸反義核酸（antisense nucleic acid）是指與體內(nèi)某RNA或DNA序列具有互補(bǔ)順序并能通過堿基配對與互補(bǔ)鏈雜交從而影響其目的基因表達(dá)的RNA或DNA片段。 反義核酸與目的 反義核酸也稱反義寡核苷酸，最初是指與單鏈RNA互補(bǔ)的一段寡核苷酸序列。 反義抑制機(jī)理：目前普遍認(rèn)為反義核酸可以在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)3個水平上發(fā)揮作用。其機(jī)制為：(1)在細(xì)胞核內(nèi)以堿基配對原理與基因組DNA 結(jié)合，從復(fù)制與轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮反義阻止作用,這種反義技術(shù)稱為“反基因治療”(Anti-genetherap

44、y); (2)與引物結(jié)合,從而在復(fù)制水平上阻止基因表達(dá); (3)與mRNA 的5末端的SD(Shine-Dalgarno)序列或核糖體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,阻礙核糖體的結(jié)合,從而阻礙翻譯,或使反義RNA 與mRNA 形成雙鏈,以被水解酶水解; (4)與mRNA 的SD 序列上游的非編碼區(qū)結(jié)合，改變mRNA 的二級結(jié)構(gòu)，從而阻礙核糖體的結(jié)合; (5)與mRNA 的5末端編碼區(qū)(主要是起始密碼AUG) 結(jié) 合，阻止RNA 的翻譯; (6)作用于mRNA 的poly A 形成位點(diǎn)， 阻止成熟和轉(zhuǎn)運(yùn); (7)作用于mRNAR 的5末端，阻止帽子結(jié)構(gòu)的形成;(8)結(jié)合到前體RNA的外顯子和內(nèi)含子的連接區(qū),阻止其剪切成熟; 二、反義核酸技術(shù)與藥物反義核酸技術(shù)是指根據(jù)堿基互補(bǔ)原理，用人工合成或生物體合成的特定互補(bǔ)的DNA或RNA片段（或其化學(xué)修飾產(chǎn)物）抑制或封閉目的基因表達(dá)的技術(shù)。它包括反義RNA、反義DNA和肽核酸三大技術(shù)。第一代反義寡核苷酸藥物硫代修飾寡聚核苷酸；第二代反義寡