幽門螺桿菌nctc11639基因hpaa的克隆表達(dá)及鑒定

1、幽門螺桿菌nctc11639基因hpaa的克隆表達(dá)及鑒定作者：谷禎梅籍會(huì)彩向春艷溫淑娟【摘要】目的 獲取幽門螺桿菌(hp) hpaa基因的序列，預(yù)測(cè)其編碼蛋白hpaa 作為候選疫苗的可行性，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)hpaa0方法提取hp標(biāo)準(zhǔn)株 nctc11639的基因組dna,使用pcr擴(kuò)增hpaa基因，克隆入pgem t載體中測(cè)序， 并進(jìn)行同源性分析。將hpaa克隆入表達(dá)載體pgex 4t 1中，誘導(dǎo)表達(dá)，sds page電泳鑒定。結(jié)果同源性分析表明hpaa具有很高的保守性，成功構(gòu)建出可 以高效、分泌型表達(dá)hpaa的原核表達(dá)系統(tǒng)。結(jié)論hpaa具有高保守性，在hp各 菌株中普遍存在，是有良好應(yīng)

2、用前景的hp候選疫苗?！娟P(guān)鍵詞】hpaa基因；克隆表達(dá)；sds pageabstract objective the intention of this study can be subscribed in three aspects: obtaining the sequence of helicobacter pylori gene hpaa,predicting whether protein hpaa has potential to become a vaccine candidate of hp and expressing hpaa in e.coli heterogeneous

3、 expression system. methods the hpaa gene was ampl if ied from the genome of hp strain nctc11639 and then cloned into vector pgem t. the sequence has been obtained by sequencing the recombinant vector. the pgex 4t 1 was used to construct expression system in e.coli strain bl21 and the expression res

4、ult verified by sds page. results the homogeneous analysis showed that hpaa is a highly conservative gene.an efficient and secretive expression system in bl21 was constructed. conclusion the research indicates that hpaa is a universal and highly conservative gene and hpaa is a promising vaccine cand

5、idate of helicobacter pylori.key words gene hpaa; clone and expression; sds page幽門螺桿菌(helicobacter pylori, hp)是慢性胃炎和消化性潰瘍的重要致病菌, 并與胃腺癌和胃粘膜相關(guān)b細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)。如何有效控制hp感染, 一直為國(guó)內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注。目前臨床上多采用抗生素治療hp感染，但hp容易產(chǎn) 生耐藥性，導(dǎo)致抗生素治療失效，并且hp未能根除，大多數(shù)患者很快又舊病復(fù)發(fā), 因此開發(fā)疫苗被認(rèn)為是控制hp感染最有效的方法。但迄今為止，尚未開發(fā)出成功 hp的疫苗，篩選合適的抗原表位仍是目前hp疫

6、苗研究的熱點(diǎn)。hp的主要粘附素 為n乙酰神經(jīng)氨酰乳糖結(jié)合原纖維樣血凝素(nacetylneuraminyl lactosebinding haemagglutinin, nlbh), hpaa是其亞單位,并且作為核心組成部分, 主要參與編碼鞭毛鞘殼和外膜中的脂蛋白1-3。hpaa在hp感染過程中不可或 缺，hpaa突變的hp菌株無(wú)法在小鼠體內(nèi)定植4,目前hpaa的具體功能尚未闡 明。本項(xiàng)研究旨在探討hpaa蛋白作為抗hp感染的候選疫苗的可行性，擬構(gòu)建可 高效表達(dá)hpaa的原核表達(dá)系統(tǒng)，并獲得重組hpaa蛋白。1材料和方法1. 1菌株與培養(yǎng)基hp標(biāo)準(zhǔn)株nctc11639.大腸桿菌toplo及bl

7、21來(lái)源于本實(shí)驗(yàn) 室菌種庫(kù)。重組大腸桿菌所用培養(yǎng)基為lb培養(yǎng)基。1.2實(shí)驗(yàn)試劑 細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、dna marker均購(gòu) 自天為時(shí)代，一管式pcr反應(yīng)體系及pcr產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自英韋創(chuàng)津公司，限 制性內(nèi)切酶bamh i和hind iii以及低分子量蛋白質(zhì)marker購(gòu)自takara公司。1. 3擴(kuò)增及克隆設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增hpaa的引物，并送交takara公司合成。hpaal： 5gga tcc atg aaa gca aat aat cat ttt aaa g 3hpaa2： 5aag ctt tta tgg gtt tct ttt gcc ttt taa 3利用以上引

8、物和一管式pcr反應(yīng)體系，從提取到的hp nctc11639基因組中擴(kuò)增 hpaa。擴(kuò)增條件：蓋溫 105°c,預(yù)熱 94°c lomin, （94°c 30s,50°c 1 min,70°c 2. 5min） x 35,最后70°c再延伸6 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用pcr產(chǎn)物純化試劑盒純化后，連入t載體pgem t,轉(zhuǎn)入大腸桿菌 toplo感受態(tài)細(xì)胞中，37°c在含有x gal的平板上培養(yǎng)14 h,利用amp抗性和 藍(lán)白斑篩選出白色重組菌落，微量pcr鑒定，挑取陽(yáng)性菌落，提取重組質(zhì)粒，雙 酶切鑒定，保存陽(yáng)性克隆菌種，提取的質(zhì)粒送

9、交takara進(jìn)行測(cè)序。從重組pgemt中用bam h i和hind iii,雙酶切下hpaa,克隆入表達(dá)載體pgex 4t 1 中，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌bl21感受態(tài)細(xì)胞中，血ip抗性平板培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆， 進(jìn)行pcr及雙酶切鑒定。重組大腸桿菌30°c下4 h, 150 rpm, 0. 05 mm iptg誘 導(dǎo)表達(dá)，將產(chǎn)物進(jìn)行sds page鑒定。2結(jié)果與分析2. 1 pcr擴(kuò)增hpaa擴(kuò)增出的hpaa片段長(zhǎng)度符合預(yù)測(cè)，將pcr產(chǎn)物分別連入pgem t中獲得重組t載體，經(jīng)測(cè)序證明為hpaa基因（圖1）。2.2同源性比較 對(duì)測(cè)序結(jié)果分別與genebank ±已公布的8株hp

10、的hpaa序列進(jìn) 行同源性比較,結(jié)果表明nctc11639的hpaa基因同源性達(dá)到94. 34%96. 72 %。2. 3 hpaa的誘導(dǎo)表達(dá) 從重組pgem t克隆中切下hpaa,克隆入pgex 4t 1中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21,對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行雙酶切（圖2）和pcr鑒定，誘導(dǎo)表 達(dá)，上清液經(jīng)sds page鑒定（圖3）。結(jié)果表明gst hpaa為可溶性表達(dá)，重 組蛋白主要存在于上清液中。3討論hp與胃炎、消化性潰瘍、胃腺癌及胃粘膜相關(guān)b細(xì)胞淋巴瘤等消化道疾病密切 相關(guān)。目前hp疫苗研究熱點(diǎn)主要集中在尿素酶(ure),毒力因子caga和vaca, 熱休克蛋白60 ( hsp60 )等亞單位保護(hù)

11、性抗原上4 。但ure難以誘導(dǎo)出全面而 穩(wěn)定的保護(hù)性免疫應(yīng)答5 ; caga和vaca變異較大，且caga是否為hp感染所 必需還存在一定爭(zhēng)議6; hsp60和人體自身蛋白有較高同源性，用hsp60免疫 小鼠只能獲得局部保護(hù)性免疫應(yīng)答，并且會(huì)導(dǎo)致小鼠腸胃炎7,其作為疫苗的 安全性和有效性尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，仍需進(jìn)行研究以篩選出更合適的hp候選 疫苗。nlbh是hp的主要粘附素之一，它能與多種胃上皮細(xì)胞表面成分如神經(jīng)節(jié)昔脂 (gm3)、硫酸腦昔脂(slc)及層粘連蛋白上的唾液酸乳糖等結(jié)合，使hp緊密粘附于 胃上皮細(xì)胞，從而進(jìn)一步發(fā)揮對(duì)胃粘膜的損傷作用。所有hp菌株均有hpaa基因, 并且其核昔

12、酸序列高度保守。hp感染患者血清中出現(xiàn)的hpaa抗體能與hpaa融合 蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，因此hpaa作為hp疫苗的候選抗原非?？尚?。本研究克隆并表達(dá)了幽門螺桿菌nctc11639的hpaa基因，與genbank上已經(jīng)公 布的hp菌株hpaa序列進(jìn)行對(duì)比，同源性達(dá)到94. 34 % 96. 72 %,表明hpaa具 有較高的保守性。目前已成功構(gòu)建了可高效表達(dá)hpaa的原核表達(dá)系統(tǒng)，擬分離純 化重組蛋白，利用臨床陽(yáng)性血清進(jìn)行鑒定?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 kim n, weeks dl, shin jm, et al proteins released by helicobacter pylori in v

13、itro. j bacteriol, 2002, 184 (22): 61556162.2 evans dg, kar jalainen tk, evans dj jr, et al. cloning,nucleot ide sequence,and expression of a gene encoding an adhesin subunit protein of helicobacter pylori. j bacteriol, 1993, 175 (3): 674683.3 baik sc, kim km, song sm, et al. proteomic analysis of t

14、he sarcosineinsoluble outer membrane fraction of hel icobacter pylori strain 26695.j bacteriol, 2004, 186 (4): 949955.4 carlsohn e, nystrom j, bolin i, et al. hpaa is essential for helicobacterpylori colonization in mice. infect immun, 2006, 74 (2):9209265李丙生，周曾芬.幽門螺旋桿菌疫苗的研究現(xiàn)狀.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2004, 13 (2)： 203206.6陳洪，劉晶星