22基因結(jié)構與功能分析

1、目錄目錄目錄目錄第二十二章第二十二章 基因結(jié)構與功能分析技術基因結(jié)構與功能分析技術 the analysis technology for gene structure and function目錄目錄人類的多種疾病都與基因的結(jié)構或功能異常人類的多種疾病都與基因的結(jié)構或功能異常有關，因此，要闡明疾病發(fā)生的分子機制和有關，因此，要闡明疾病發(fā)生的分子機制和進行有效的診斷與防治，均需首先揭示基因進行有效的診斷與防治，均需首先揭示基因的結(jié)構與功能。的結(jié)構與功能。dnadna序列測定序列測定基因轉(zhuǎn)錄起點及其啟動子的分析基因轉(zhuǎn)錄起點及其啟動子的分析基因編碼序列的分析基因編碼序列的分析基因拷貝數(shù)及其表達產(chǎn)物

2、的分析基因拷貝數(shù)及其表達產(chǎn)物的分析基因功能獲得和基因功能獲得和/ /或缺失策略或缺失策略隨機突變篩選策略隨機突變篩選策略目錄目錄第一節(jié)第一節(jié) 基因結(jié)構分析技術基因結(jié)構分析技術 目錄目錄一、基因一級結(jié)構解析技術一、基因一級結(jié)構解析技術 基因的一級結(jié)構是指脫氧核苷酸的排列基因的一級結(jié)構是指脫氧核苷酸的排列順序，解析一級結(jié)構最精確的技術就是順序，解析一級結(jié)構最精確的技術就是dna測序（測序（dna sequencing）。）。 目錄目錄（一）雙脫氧法和化學降解法是兩種常規(guī)的（一）雙脫氧法和化學降解法是兩種常規(guī)的dna測序方法測序方法 sanger雙脫氧測序（雙脫氧測序（dideoxy sequenc

3、ing）法）法 目錄目錄maxam-gilbert化學降解測序法化學降解測序法 目錄目錄（二）全自動激光熒光（二）全自動激光熒光dna測序技術的原理測序技術的原理基于基于sanger雙脫氧法雙脫氧法 1. 四色熒光法：四色熒光法：采用四種不同的熒光染料標記同一引物或采用四種不同的熒光染料標記同一引物或4種不同的種不同的終止底物終止底物ddntp，最終結(jié)果均相當于賦予，最終結(jié)果均相當于賦予dna片段片段4種不種不同的顏色。因此，一個樣品的同的顏色。因此，一個樣品的4個反應產(chǎn)物可在同一個泳個反應產(chǎn)物可在同一個泳道內(nèi)電泳。道內(nèi)電泳。2. 單色熒光法：單色熒光法：采用單一熒光染料標記引物采用單一熒光染

4、料標記引物5-端或端或dntp，所有產(chǎn)物，所有產(chǎn)物的的5-末端均帶上了同一種熒光標記，一個樣品的四個反應末端均帶上了同一種熒光標記，一個樣品的四個反應必須分別進行，相應產(chǎn)物也必須在四個不同的泳道內(nèi)電泳必須分別進行，相應產(chǎn)物也必須在四個不同的泳道內(nèi)電泳目錄目錄（三）焦磷酸測序是一種基于發(fā)光法測定焦磷（三）焦磷酸測序是一種基于發(fā)光法測定焦磷酸的測序技術酸的測序技術 焦磷酸測序技術操作簡單，焦磷酸測序技術操作簡單，結(jié)果準確可靠，可應用于單核結(jié)果準確可靠，可應用于單核苷酸多態(tài)性位點（苷酸多態(tài)性位點（snp）分析、）分析、等位基因頻率測定、細菌和病等位基因頻率測定、細菌和病毒等微生物的分型鑒定、毒等微生

5、物的分型鑒定、cpg甲基化分析、掃描與疾病相關甲基化分析、掃描與疾病相關基因序列中的突變點等領域?；蛐蛄兄械耐蛔凕c等領域。該方法的測序長度一般短于該方法的測序長度一般短于sanger法。法。 目錄目錄（四）循環(huán)芯片測序被稱為第二代測序技術（四）循環(huán)芯片測序被稱為第二代測序技術 循環(huán)芯片測序（循環(huán)芯片測序（cyclic-array sequencing） 可實現(xiàn)大規(guī)模并行化分析可實現(xiàn)大規(guī)模并行化分析 不需電泳，設備易于微型化不需電泳，設備易于微型化 樣本和試劑的消耗量降低，降低了測序成本樣本和試劑的消耗量降低，降低了測序成本 優(yōu)勢：優(yōu)勢：技術平臺：技術平臺：454測序、測序、solexa測序（

6、測序（illumina測序）、測序）、solid測序等。測序等。 目錄目錄基本流程：基本流程： 將基因組將基因組dna隨機切割成為小片段隨機切割成為小片段dna； 在所獲小片段在所獲小片段dna分子的末端連上接頭，然分子的末端連上接頭，然后變性得到單鏈模板文庫；后變性得到單鏈模板文庫； 將帶接頭的單鏈小片段將帶接頭的單鏈小片段dna文庫固定于固體文庫固定于固體表面；表面； 對固定片段進行克隆擴增，從而制成對固定片段進行克隆擴增，從而制成polony芯片。芯片。 針對芯片上的針對芯片上的dna，利用聚合酶或連接酶進，利用聚合酶或連接酶進行一系列循環(huán)反應，通過讀取堿基連接到行一系列循環(huán)反應，通過讀

7、取堿基連接到dna鏈過程中釋放出的光學信號而間接確定鏈過程中釋放出的光學信號而間接確定堿基序列。堿基序列。目錄目錄（五）單分子測序技術被稱為第三代測序技術（五）單分子測序技術被稱為第三代測序技術 主要策略：主要策略： 通過摻入并檢測熒光標記的核苷酸，來實現(xiàn)單分通過摻入并檢測熒光標記的核苷酸，來實現(xiàn)單分子測序，如單分子實時技術（子測序，如單分子實時技術（single molecule real time technology，smrt）；）； 利用利用dna聚合酶在聚合酶在dna合成時的天然化學方式合成時的天然化學方式來實現(xiàn)單分子測序；來實現(xiàn)單分子測序； 直接讀取單分子直接讀取單分子dna序列信

8、息。序列信息。 目錄目錄二、基因轉(zhuǎn)錄起點分析技術二、基因轉(zhuǎn)錄起點分析技術 轉(zhuǎn)錄起點（轉(zhuǎn)錄起點（transcription start site，tss） （一）用（一）用cdna克隆直接測序法鑒定克隆直接測序法鑒定tss 以以mrna為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cdna第一鏈，同時第一鏈，同時利用逆轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在利用逆轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在cdna第一鏈的末端第一鏈的末端加上加上polyc尾，并以此引導合成尾，并以此引導合成cdna第二鏈。將雙鏈第二鏈。將雙鏈cdna克隆于適宜載體，通過對克隆克隆于適宜載體，通過對克隆cdna的的5 -末端進行測末端進行測序分析即可

9、確定基因的序分析即可確定基因的tss序列。序列。 該方法比較簡單，尤其適于對特定基因該方法比較簡單，尤其適于對特定基因tss的分析。的分析。但可導致但可導致5 -末端部分缺失，從而影響對末端部分缺失，從而影響對tss的序列測定。的序列測定。 目錄目錄（二）用（二）用5 -cdna末端快速擴增技術鑒定末端快速擴增技術鑒定tss 常用的技術包括常用的技術包括5 -末端基因表達系列分析（末端基因表達系列分析（5 -end serial analysis of gene expression，5 -sage）和帽分析基因表達）和帽分析基因表達（cap analysis gene expression，

10、cage）技術。）技術。 目錄目錄（三）用數(shù)據(jù)庫搜索（三）用數(shù)據(jù)庫搜索tss 利用對寡核苷酸帽法構建的全長利用對寡核苷酸帽法構建的全長cdna文文庫庫5 -末端測序所得的數(shù)據(jù)信息建立了一個末端測序所得的數(shù)據(jù)信息建立了一個tss數(shù)據(jù)庫（數(shù)據(jù)庫（database of transcription start sites，dbtss），并在此基礎上，通過將寡核苷酸帽），并在此基礎上，通過將寡核苷酸帽法和大量平行測序技術相結(jié)合開發(fā)了一種法和大量平行測序技術相結(jié)合開發(fā)了一種tss測序法，從而實現(xiàn)了一次測試可產(chǎn)生測序法，從而實現(xiàn)了一次測試可產(chǎn)生1107 個個tss的數(shù)據(jù)。的數(shù)據(jù)。 目錄目錄三、基因啟動子結(jié)

11、構分析技術三、基因啟動子結(jié)構分析技術 （一）用（一）用pcr結(jié)合測序技術分析啟動子結(jié)構結(jié)合測序技術分析啟動子結(jié)構 該方法最為簡單和直接，即根據(jù)基因的啟動該方法最為簡單和直接，即根據(jù)基因的啟動子序列，設計一對引物，然后以子序列，設計一對引物，然后以pcr法擴增啟動法擴增啟動子，經(jīng)測序分析啟動子序列結(jié)構。子，經(jīng)測序分析啟動子序列結(jié)構。 目錄目錄（二）用核酸（二）用核酸-蛋白質(zhì)相互作用技術分析啟動蛋白質(zhì)相互作用技術分析啟動子結(jié)構子結(jié)構 1. 用足跡法分析啟動子中潛在的調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點用足跡法分析啟動子中潛在的調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點 足跡法（足跡法（footprinting）是利用）是利用dna電泳條帶電泳

12、條帶連續(xù)性中斷的圖譜特點判斷與蛋白質(zhì)結(jié)合的連續(xù)性中斷的圖譜特點判斷與蛋白質(zhì)結(jié)合的dna區(qū)域，它是研究核酸區(qū)域，它是研究核酸-蛋白質(zhì)相互作用的方法，而蛋白質(zhì)相互作用的方法，而不是專門用于研究啟動子結(jié)構的方法。不是專門用于研究啟動子結(jié)構的方法。 分類：分類：酶足跡法酶足跡法化學足跡法化學足跡法 目錄目錄（1）用核酸酶進行足跡分析）用核酸酶進行足跡分析 酶足跡法酶足跡法（enzymatic footprinting）是利用是利用dna酶處理酶處理dna-蛋白質(zhì)復合物，然后通過蛋白質(zhì)復合物，然后通過電泳分析蛋白質(zhì)結(jié)合序列。電泳分析蛋白質(zhì)結(jié)合序列。常用的酶有常用的酶有dna酶酶i（dnase i）和核酸

13、外切）和核酸外切酶酶iii。 目錄目錄（2）用化學試劑進行足跡分析）用化學試劑進行足跡分析 化學足跡法（化學足跡法（chemical footprinting）是利）是利用能切斷用能切斷dna骨架的化學試劑處理骨架的化學試劑處理dna-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)復合物，由于化學試劑無法接近結(jié)合了蛋白質(zhì)的復合物，由于化學試劑無法接近結(jié)合了蛋白質(zhì)的dna區(qū)域，因此在電泳上形成空白區(qū)域的位置區(qū)域，因此在電泳上形成空白區(qū)域的位置就是就是dna結(jié)合蛋白的結(jié)合位點。最常用的化學結(jié)合蛋白的結(jié)合位點。最常用的化學足跡法是羥自由基足跡法（足跡法是羥自由基足跡法（hydroxyl radical footprinting）。）

14、。 目錄目錄2. 用電泳遷移率變動分析和染色質(zhì)免疫沉淀技術鑒定用電泳遷移率變動分析和染色質(zhì)免疫沉淀技術鑒定啟動子啟動子 電泳遷移率變動分析（電泳遷移率變動分析（emsa）和染色質(zhì)免）和染色質(zhì)免疫沉淀（疫沉淀（chip）只能確定）只能確定dna序列中含有核蛋白序列中含有核蛋白結(jié)合位點，故尚需結(jié)合結(jié)合位點，故尚需結(jié)合dna足跡實驗和足跡實驗和dna測序測序等技術來確定具體結(jié)合序列。等技術來確定具體結(jié)合序列。 目錄目錄（三）用生物信息學預測啟動子（三）用生物信息學預測啟動子 1. 用啟動子數(shù)據(jù)庫和啟動子預測算法定義啟動子用啟動子數(shù)據(jù)庫和啟動子預測算法定義啟動子 在定義啟動子或預測分析啟動子結(jié)構時應包

15、括啟在定義啟動子或預測分析啟動子結(jié)構時應包括啟動子區(qū)域的動子區(qū)域的3個部分個部分 核心啟動子（核心啟動子（core promoter）；）； 近端啟動子（近端啟動子（proximal promoter）：含有幾個）：含有幾個調(diào)控元件的區(qū)域，其范圍一般涉及調(diào)控元件的區(qū)域，其范圍一般涉及tss上游幾百個堿基；上游幾百個堿基； 遠端啟動子（遠端啟動子（distal promoter）：范圍涉及）：范圍涉及tss上游幾千個堿基，含有增強子和沉默子等元件。上游幾千個堿基，含有增強子和沉默子等元件。 目錄目錄2. 預測啟動子的其他結(jié)構特征預測啟動子的其他結(jié)構特征 啟動子區(qū)域的其他結(jié)構特征包括啟動子區(qū)域的其

16、他結(jié)構特征包括gc含量、含量、cpg比比率、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、堿基組成及核心啟動子元件等。率、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、堿基組成及核心啟動子元件等。 用于啟動子預測的數(shù)據(jù)庫：用于啟動子預測的數(shù)據(jù)庫：epd（eukaryotic promoter databases）數(shù)據(jù)庫，主要預測真核）數(shù)據(jù)庫，主要預測真核rna聚合聚合酶酶型啟動子，數(shù)據(jù)庫中的所有啟動子數(shù)據(jù)信息都經(jīng)過型啟動子，數(shù)據(jù)庫中的所有啟動子數(shù)據(jù)信息都經(jīng)過實驗證實；實驗證實；trrd（transcription regulatory region databases）是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)來源于已發(fā)）是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)來源于已發(fā)表

17、的科學論文。表的科學論文。 目錄目錄四、基因編碼序列分析技術四、基因編碼序列分析技術 （一）用（一）用cdna文庫法分析基因編碼序列文庫法分析基因編碼序列 cdna克隆測序或構建克隆測序或構建cdna文庫是最早分析基因文庫是最早分析基因編碼序列的方法。全長編碼序列的方法。全長cdna文庫可以通過文庫可以通過mrna的結(jié)的結(jié)構特征進行判斷，構特征進行判斷，mrna的序列基本都由的序列基本都由3部分組成，部分組成，即即5 -utr、編碼序列和、編碼序列和3 -utr。 cdna末端快速擴增（末端快速擴增（race）技術是高效釣取未）技術是高效釣取未知基因編碼序列的一種方法。知基因編碼序列的一種方法

18、。核酸雜交法可從核酸雜交法可從cdna文庫中獲得特定基因編碼序文庫中獲得特定基因編碼序列的列的cdna克隆。克隆。目錄目錄（二）用（二）用rna剪接分析法確定基因編碼序列剪接分析法確定基因編碼序列 高通量分析高通量分析rna剪接的方法：剪接的方法： 基于基于dna芯片的分析法芯片的分析法 交聯(lián)免疫沉淀法交聯(lián)免疫沉淀法 體外報告基因測定法體外報告基因測定法選擇性剪接的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以通過基因表達序選擇性剪接的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以通過基因表達序列標簽（列標簽（expression sequence tag, est）的比較）的比較進行鑒定，但這種方法需進行大量的進行鑒定，但這種方法需進行大量的est序列測序列

19、測定；同時由于大多數(shù)定；同時由于大多數(shù)est文庫來源于非常有限的文庫來源于非常有限的組織，故組織特異性剪接變異體也很可能丟失。組織，故組織特異性剪接變異體也很可能丟失。 目錄目錄（三）用數(shù)據(jù)庫分析基因編碼序列（三）用數(shù)據(jù)庫分析基因編碼序列在基因數(shù)據(jù)庫中，對各種方法所獲得的在基因數(shù)據(jù)庫中，對各種方法所獲得的cdna片段的片段的序列進行同源性比對，通過染色體定位分析、內(nèi)含子序列進行同源性比對，通過染色體定位分析、內(nèi)含子外顯外顯子分析、子分析、orf分析及表達譜分析等，可以初步明確基因的分析及表達譜分析等，可以初步明確基因的編碼序列，并可對其編碼產(chǎn)物的基本性質(zhì)進行分析。編碼序列，并可對其編碼產(chǎn)物的基

20、本性質(zhì)進行分析。利用有限的序列信息即可通過同源性搜索獲得全長基利用有限的序列信息即可通過同源性搜索獲得全長基因序列，然后，利用因序列，然后，利用ncbi的的orf finder軟件或軟件或emboss中的中的getorf軟件進行軟件進行orf分析，并根據(jù)編碼序列和非編碼序分析，并根據(jù)編碼序列和非編碼序列的結(jié)構特點，便可確定基因的編碼序列。列的結(jié)構特點，便可確定基因的編碼序列。 目錄目錄五、基因拷貝數(shù)分析技術五、基因拷貝數(shù)分析技術 分析某種基因的種類及拷貝數(shù)，實質(zhì)上就是對分析某種基因的種類及拷貝數(shù)，實質(zhì)上就是對基因進行定性和定量分析，常用的技術包括基因進行定性和定量分析，常用的技術包括dna印跡

21、（印跡（southern印跡）、實時定量印跡）、實時定量pcr技術等。技術等。 dna印跡是根據(jù)探針信號出現(xiàn)的位置和次數(shù)印跡是根據(jù)探針信號出現(xiàn)的位置和次數(shù)判斷基因的拷貝數(shù)判斷基因的拷貝數(shù) 實時定量實時定量pcr是通過被擴增基因在數(shù)量上的差是通過被擴增基因在數(shù)量上的差異推測模板基因拷貝數(shù)的異同異推測模板基因拷貝數(shù)的異同dna測序是最精確的鑒定基因拷貝數(shù)的方法測序是最精確的鑒定基因拷貝數(shù)的方法目錄目錄第二節(jié)第二節(jié) 基因表達產(chǎn)物分析技術基因表達產(chǎn)物分析技術 目錄目錄一、通過檢測一、通過檢測rna而在轉(zhuǎn)錄水平分析而在轉(zhuǎn)錄水平分析基因表達基因表達 根據(jù)分析方法的原理和功能特性，可將基因根據(jù)分析方法的原理

22、和功能特性，可將基因轉(zhuǎn)錄水平分析分為封閉和開放性系統(tǒng)研究方法。轉(zhuǎn)錄水平分析分為封閉和開放性系統(tǒng)研究方法。 封閉性系統(tǒng)研究方法（如封閉性系統(tǒng)研究方法（如dna芯片、芯片、rna印跡、實時印跡、實時rt-pcr等）的應用范圍僅限于已知等）的應用范圍僅限于已知基因。開放性系統(tǒng)研究方法（如差異顯示基因。開放性系統(tǒng)研究方法（如差異顯示pcr、雙向基因表達指紋圖譜、分子索引法、隨機引物雙向基因表達指紋圖譜、分子索引法、隨機引物pcr指紋分析等）可用于發(fā)現(xiàn)和分析未知基因。指紋分析等）可用于發(fā)現(xiàn)和分析未知基因。 目錄目錄（一）用核酸雜交法檢測（一）用核酸雜交法檢測rna表達水平表達水平 1. 用用rna印跡分

23、析印跡分析rna表達表達 rna印跡被廣泛應用于印跡被廣泛應用于rna表達分析，并表達分析，并作為鑒定作為鑒定rna轉(zhuǎn)錄本、分析其大小的標準方法。轉(zhuǎn)錄本、分析其大小的標準方法。 2. 用核糖核酸酶保護實驗分析用核糖核酸酶保護實驗分析rna水平及其剪接情況水平及其剪接情況 rna酶保護實驗（酶保護實驗（ribonuclease protection assay，rpa）是一種基于雜交原理分析）是一種基于雜交原理分析rna的方的方法，既可進行定量分析，又可研究其結(jié)構特征。法，既可進行定量分析，又可研究其結(jié)構特征。 目錄目錄目錄目錄3. 用原位雜交進行用原位雜交進行rna區(qū)域定位區(qū)域定位 原位雜交（

24、原位雜交（ish）是通過設計與目標）是通過設計與目標rna堿基序列互補的寡核苷酸探針，利用雜交原理堿基序列互補的寡核苷酸探針，利用雜交原理在組織原位檢測在組織原位檢測rna的技術，其可對細胞或組的技術，其可對細胞或組織中原位表達的織中原位表達的rna進行區(qū)域定位，同時也可進行區(qū)域定位，同時也可作為定量分析的補充。作為定量分析的補充。 目錄目錄（二）用（二）用pcr技術檢測技術檢測rna表達水平表達水平 1. 用逆轉(zhuǎn)錄用逆轉(zhuǎn)錄pcr進行進行rna的半定量分析的半定量分析 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄pcr（rt-pcr）一般用于）一般用于rna的的定性分析；如果設置陽性參照，則可對待測定性分析；如果設置陽性參照

25、，則可對待測rna樣品進行半定量分析。樣品進行半定量分析。2. 用實時定量用實時定量pcr進行進行rna的定量分析的定量分析 實時定量實時定量pcr是定量分析是定量分析rna的最通用、的最通用、最快速、最簡便的方法，該方法是對最快速、最簡便的方法，該方法是對pcr反應反應進行實時監(jiān)測，具有很高的靈敏度和特異性。進行實時監(jiān)測，具有很高的靈敏度和特異性。 目錄目錄（三）用基因芯片和高通量測序技術分析（三）用基因芯片和高通量測序技術分析rna表達水平表達水平 1. 基因芯片已成為基因表達譜分析的常用方法基因芯片已成為基因表達譜分析的常用方法 基因芯片主要采用基因芯片主要采用cdna芯片，其便于對不同

26、狀態(tài)下芯片，其便于對不同狀態(tài)下的基因表達譜進行比較，揭示轉(zhuǎn)錄組差異表達的規(guī)律，對的基因表達譜進行比較，揭示轉(zhuǎn)錄組差異表達的規(guī)律，對探索發(fā)病機制、評價治療效果、篩選藥物靶標具有重要意探索發(fā)病機制、評價治療效果、篩選藥物靶標具有重要意義。義。 2. 用循環(huán)芯片測序技術分析基因表達譜用循環(huán)芯片測序技術分析基因表達譜 運用循環(huán)芯片測序技術，可對基因表達譜進行高通量運用循環(huán)芯片測序技術，可對基因表達譜進行高通量分析，一次可完成幾十萬到幾百萬個分析，一次可完成幾十萬到幾百萬個dna分子片段的序列分子片段的序列測定，從而快速獲得轉(zhuǎn)錄組或基因組的全貌。測定，從而快速獲得轉(zhuǎn)錄組或基因組的全貌。 目錄目錄二、通過

27、檢測蛋白質(zhì)二、通過檢測蛋白質(zhì)/多肽而在翻譯水平多肽而在翻譯水平分析基因表達分析基因表達 （一）用蛋白質(zhì)印跡技術檢測蛋白質(zhì)（一）用蛋白質(zhì)印跡技術檢測蛋白質(zhì)/多肽多肽 （二）用酶聯(lián)免疫吸附實驗分析蛋白質(zhì)（二）用酶聯(lián)免疫吸附實驗分析蛋白質(zhì)/多肽多肽 酶聯(lián)免疫吸附實驗（酶聯(lián)免疫吸附實驗（elisa）也是一種建立）也是一種建立在抗原在抗原-抗體反應基礎上的蛋白質(zhì)抗體反應基礎上的蛋白質(zhì)/多肽分析方法，多肽分析方法，其主要用于測定可溶性抗原或抗體，其主要用于測定可溶性抗原或抗體， 目錄目錄（三）用免疫組化實驗原位檢測組織（三）用免疫組化實驗原位檢測組織/細胞表達細胞表達的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)/多肽多肽 免疫組化實

28、驗包括免疫組織化學和免疫細胞化學實免疫組化實驗包括免疫組織化學和免疫細胞化學實驗，二者原理相同，都是用標記的抗體在組織驗，二者原理相同，都是用標記的抗體在組織/細胞原位對細胞原位對目標抗原（目標蛋白質(zhì)目標抗原（目標蛋白質(zhì)/多肽）進行定性、定量、定位檢測。多肽）進行定性、定量、定位檢測。 （四）用流式細胞術分析表達特異蛋白質(zhì)的陽（四）用流式細胞術分析表達特異蛋白質(zhì)的陽性細胞性細胞 流式細胞術（流式細胞術（flow cytometry）通常利用熒光標記抗）通常利用熒光標記抗體與抗原的特異性結(jié)合，經(jīng)流式細胞儀分析熒光信號，體與抗原的特異性結(jié)合，經(jīng)流式細胞儀分析熒光信號，根據(jù)細胞表達特定蛋白質(zhì)的水平對

29、某種蛋白質(zhì)陽性細胞根據(jù)細胞表達特定蛋白質(zhì)的水平對某種蛋白質(zhì)陽性細胞做出判斷。做出判斷。 目錄目錄（五）用蛋白質(zhì)芯片和雙向電泳高通量分析蛋（五）用蛋白質(zhì)芯片和雙向電泳高通量分析蛋白質(zhì)白質(zhì)/多肽表達水平多肽表達水平 1. 用蛋白質(zhì)芯片分析蛋白質(zhì)用蛋白質(zhì)芯片分析蛋白質(zhì)/多肽的表達譜多肽的表達譜 根據(jù)制作方法和用途不同，可將其分為蛋白質(zhì)檢測和根據(jù)制作方法和用途不同，可將其分為蛋白質(zhì)檢測和功能芯片兩大類。蛋白質(zhì)檢測芯片包括抗體芯片、抗原芯功能芯片兩大類。蛋白質(zhì)檢測芯片包括抗體芯片、抗原芯片、配體芯片等，它是將具有高親和力的特異性探針分子片、配體芯片等，它是將具有高親和力的特異性探針分子固定在基片上，用以

30、識別生物樣品溶液中的目標多肽；蛋固定在基片上，用以識別生物樣品溶液中的目標多肽；蛋白質(zhì)功能芯片可用來研究蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)白質(zhì)功能芯片可用來研究蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白蛋白質(zhì)質(zhì)-dna蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-rna，以及蛋白質(zhì)與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)與藥物、，以及蛋白質(zhì)與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)與藥物、酶與底物、蛋白質(zhì)酶與底物、蛋白質(zhì)-小分子等的相互作用。小分子等的相互作用。 目錄目錄蛋白質(zhì)芯片可用于檢測組織蛋白質(zhì)芯片可用于檢測組織細胞來源的樣細胞來源的樣品中蛋白質(zhì)的表達譜；其精確程度、信息范疇品中蛋白質(zhì)的表達譜；其精確程度、信息范疇取決于芯片上已知多肽的信息多寡。取決于芯片上已知多肽的信息多寡。 2. 用雙向電

31、泳分析蛋白質(zhì)用雙向電泳分析蛋白質(zhì)/多肽表達譜多肽表達譜 雙向電泳可同時分離成百上千的蛋白質(zhì)，雙向電泳可同時分離成百上千的蛋白質(zhì)，對差異表達的蛋白質(zhì)進行鑒定。對差異表達的蛋白質(zhì)進行鑒定。 目錄目錄第三節(jié)第三節(jié) 基因的生物學功能鑒定技術基因的生物學功能鑒定技術目錄目錄一、用功能獲得策略鑒定基因功能一、用功能獲得策略鑒定基因功能 基因功能獲得策略的本質(zhì)是將目的基因直基因功能獲得策略的本質(zhì)是將目的基因直接導入某一細胞或個體中，使其獲得新的或更接導入某一細胞或個體中，使其獲得新的或更高水平的表達，通過細胞或個體生物性狀的變高水平的表達，通過細胞或個體生物性狀的變化來研究基因功能?；瘉硌芯炕蚬δ?。 方法

32、：方法： 轉(zhuǎn)基因技術轉(zhuǎn)基因技術基因敲入技術基因敲入技術 目錄目錄（一）用轉(zhuǎn)基因技術獲得基因功能（一）用轉(zhuǎn)基因技術獲得基因功能 轉(zhuǎn)基因技術（轉(zhuǎn)基因技術（transgenic technology）是指將外源基因?qū)耄┦侵笇⑼庠椿驅(qū)胧芫鸦蚺咛ジ杉毎ㄊ芫鸦蚺咛ジ杉毎╡mbryonic stem cell），即），即es細胞，通過細胞，通過隨機重組使外源基因插入細胞染色體隨機重組使外源基因插入細胞染色體dna，隨后將受精卵或，隨后將受精卵或es細胞植入假孕受體動物的子宮，使得外源基因能夠隨細胞分裂遺細胞植入假孕受體動物的子宮，使得外源基因能夠隨細胞分裂遺傳給后代。傳給后代。 轉(zhuǎn)基因動物（轉(zhuǎn)

33、基因動物（transgenic animal）是指應用轉(zhuǎn)基因技術培）是指應用轉(zhuǎn)基因技術培育出的攜帶外源基因，并能穩(wěn)定遺傳的動物，其制備步驟主育出的攜帶外源基因，并能穩(wěn)定遺傳的動物，其制備步驟主要包括轉(zhuǎn)基因表達載體的構建、外源基因的導入和鑒定、轉(zhuǎn)要包括轉(zhuǎn)基因表達載體的構建、外源基因的導入和鑒定、轉(zhuǎn)基因動物的獲得和鑒定、轉(zhuǎn)基因動物品系的繁育等?；騽游锏墨@得和鑒定、轉(zhuǎn)基因動物品系的繁育等。轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因小鼠最為常見。小鼠最為常見。 目錄目錄目錄目錄（二）用基因敲入技術獲得基因的功能（二）用基因敲入技術獲得基因的功能 基因敲入基因敲入（gene knock-in）是通過同源重組）是通過同源重組的方法，

34、用某一基因替換另一基因，或?qū)⒁粋€設的方法，用某一基因替換另一基因，或?qū)⒁粋€設計好的基因片段插入到基因組的特定位點，使之計好的基因片段插入到基因組的特定位點，使之表達并發(fā)揮作用。表達并發(fā)揮作用。通過基因敲入可以研究特定基因在體內(nèi)的功通過基因敲入可以研究特定基因在體內(nèi)的功能；也可以與之前的基因的功能進行比較；或?qū)⒛?；也可以與之前的基因的功能進行比較；或?qū)⒄；蛞牖蚪M中置換突變基因以達到靶向正?；蛞牖蚪M中置換突變基因以達到靶向基因治療的目的?；蛑委煹哪康?。 目錄目錄基因敲入基因敲入是基因打靶（是基因打靶（gene targeting）技術）技術的一種。的一種?；虼虬谢虼虬惺且环N按預

35、期方式準確改造生是一種按預期方式準確改造生物遺傳信息的實驗手段。除基因敲入外，基因打物遺傳信息的實驗手段。除基因敲入外，基因打靶還包括靶還包括基因敲除、點突變、缺失突變、染色體基因敲除、點突變、缺失突變、染色體大片段刪除大片段刪除等。等。基因打靶與轉(zhuǎn)基因技術均可用于基因功能研基因打靶與轉(zhuǎn)基因技術均可用于基因功能研究，但二者的究，但二者的最大區(qū)別最大區(qū)別就是基因打靶能去除和就是基因打靶能去除和/或或替換生物體內(nèi)的固有基因，而轉(zhuǎn)基因技術則未去替換生物體內(nèi)的固有基因，而轉(zhuǎn)基因技術則未去除或替換固有基因。目前，基因打靶已成為研究除或替換固有基因。目前，基因打靶已成為研究基因功能最直接和最有效的方法之一?；蚬δ茏钪苯雍妥钣行У姆椒ㄖ弧?目錄目錄二、用功能失活策略鑒定基因功能二、用功能失活策略鑒定基因功能 基因功能失活策略的本質(zhì)是將細胞或個體基因功能失活策略的本質(zhì)是將細胞或個體的某一基因功能部分或全部失活后，通過觀察的某一基因功能部分或全部失活后，通過觀察細胞生物學行為或個體遺傳性狀表型的變化來細胞生物學行為或個體遺傳性狀表型的變化來鑒定基因的功能。鑒定基因的功能。 方法：方法： 基因敲除基因敲除基因沉默基因沉默 目錄目錄基因敲除基因敲除（gene knock-out）屬于基因打靶技術的一）屬于基因打靶技術的一