國產(chǎn)球囊導(dǎo)管制作大鼠主動(dòng)脈損傷血管內(nèi)膜增生模型及特性的研究(精)

1、國產(chǎn)球囊導(dǎo)管制作大鼠主動(dòng)脈損傷血管內(nèi)膜增生模型及特性的研究摘 要：目的 探討國產(chǎn) 2.0F 球囊導(dǎo)管取代進(jìn)口 2F Fogarty 球囊導(dǎo)管致大鼠主動(dòng)脈 損傷血管內(nèi)膜增生模型的特點(diǎn)及可行性。方法 用國產(chǎn) 2.0F 球囊導(dǎo)管建立大鼠 主動(dòng)脈內(nèi)皮剝脫模型，分別采用組織形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)方法，觀察大鼠血 管內(nèi)皮剝脫后內(nèi)膜增生的情況及血管平滑肌細(xì)胞(VSMC 表型標(biāo)志基因 SM 肌動(dòng) 蛋白(SMa -actin)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)及I型膠原(collagenl)的表達(dá)活性。 結(jié)果與假手術(shù)組比較，術(shù)后模型 7 天組內(nèi)膜增生不明顯， SMx -actin及PCNA 表達(dá)也均不明顯； 14天內(nèi)膜

2、有輕度增厚， SMa -actin及 PCNA 表達(dá)均明顯增強(qiáng)； 21 天內(nèi)膜呈進(jìn)行性彌漫性增厚，SM% -actin 表達(dá)仍明顯增高，但 PCNA 表達(dá)不 明顯。模型 7 天、14 天、21 天組 collagenI表達(dá)與假手術(shù)組比較，差異無顯 著性(p 0.05)。 結(jié)論 國產(chǎn) 2.0F 球囊導(dǎo)管致大鼠主動(dòng)脈損傷后， 血管內(nèi)膜增生 引起再狹窄以 1421 天較為明顯，細(xì)胞增殖也明顯，表明其可以取代進(jìn)口2FFogarty 球囊導(dǎo)管運(yùn)用于血管內(nèi)膜實(shí)驗(yàn)。關(guān)鍵詞：球囊導(dǎo)管；血管平滑肌細(xì)胞；形態(tài)計(jì)量學(xué)；SM 肌動(dòng)蛋白；增殖細(xì)胞核抗原；I型膠原經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù) (percutaneous trans

3、luminal coronary angioplasty, PTCA 能明顯減輕心血管疾病的癥狀，給患者帶來福音。但術(shù)后的再狹窄 (reste nosis, RS)發(fā)生率仍然居高不下，影響了 PTCA 的遠(yuǎn)期療效。球囊擴(kuò)張后再狹窄的發(fā)生機(jī)制包括血管彈性回縮，損傷部位血栓形成，血管平滑肌細(xì)胞 (vascularsmooth muscle cell, VSMC) 增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)積聚等 1 ， 這些都是 PTCA 后再狹窄重要的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。目前，有關(guān)防治PTCA 后再狹窄的發(fā)生發(fā)展是心血管疾病領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。由于進(jìn)口的球囊導(dǎo)管價(jià)格十分昂 貴，且很難匹配應(yīng)用于小動(dòng)物模型，為建立可靠、價(jià)廉的

4、方法，我們采用國產(chǎn) 2.0F 球囊導(dǎo)管取代進(jìn)口的球囊導(dǎo)管，建立大鼠主動(dòng)脈損傷血管內(nèi)膜增生模型， 并對該模型的特點(diǎn)及可行性進(jìn)行了研究。1 材料和方法1.1 材料1.1.1動(dòng)物SD 大鼠由湖南省衛(wèi)生防疫站實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第20-010 號(hào)；1.1.2球囊導(dǎo)管球囊由天津中拓乳膠科技發(fā)展有限公司提供；導(dǎo)管（ 5?針頭改裝成）由河 北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生物化學(xué)室溫進(jìn)坤教授、韓梅教授惠贈(zèng)。國產(chǎn) 2.0F 球囊導(dǎo)管由球囊和導(dǎo)管組裝而成：將 2cm 長的球囊套在導(dǎo)管一端，在導(dǎo)管出水 孔的上下兩個(gè)楔形槽分別用細(xì)絲線扎緊；導(dǎo)管另一端連接 16 號(hào)注射針并固定好 球囊導(dǎo)管準(zhǔn)備好后，在尾端注入生

5、理鹽水充盈球囊 （黃豆大小 ） ，回縮自如即可 （ 見圖 1） 。1.1.3試劑增殖細(xì)胞核抗原 （The proliferating cell nuclear antigen,PCNA）免疫組化染色試劑盒、兔抗大鼠I型膠原多克隆抗體、兔抗大鼠SMa -actin 多克隆抗體、DAB 顯色試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供，SP-9001 免疫組化染色試劑盒、多聚賴氨酸由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，其他試劑為 進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。1.2 動(dòng)物模型的建立方法及分組選用體重 300H350g 的雄性 SD 大鼠，水合氯醛麻醉后，作頸部正中切口， 手術(shù)暴露及游離左頸總動(dòng)脈 11.5cm，遠(yuǎn)心端

6、結(jié)扎，在左頸總動(dòng)脈近心端用動(dòng) 脈夾阻斷后，于頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端剪一“ V形切口，插入國產(chǎn) 2.0F 球囊導(dǎo)管， 仔細(xì)操縱導(dǎo)管越過主動(dòng)脈弓入胸，下至腹主動(dòng)脈，深度約為67cm 自導(dǎo)管尾端注入生理鹽水 0.40.6ml 充盈球囊，使球囊膨脹至回拉時(shí)有較明顯的阻力感， 保持阻力一致回拉導(dǎo)管至主動(dòng)脈弓處，如此重復(fù) 3 次，旋轉(zhuǎn) 180使球囊轉(zhuǎn)至 血管腔的另一面，依上法再重復(fù) 3 次，充分剝脫內(nèi)皮。完成后撤出導(dǎo)管，結(jié)扎 左頸總動(dòng)脈近心端血管以止血，逐層縫合肌肉、皮下層及皮膚層。術(shù)后腹腔注 射青霉素（PNC）20 萬單位消炎抗菌，連用 3 天。將動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模 型 7 天組、模型 14 天組和模型

7、21天組。假手術(shù)組只進(jìn)行手術(shù)操作，但不插入球囊損傷。分別于術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)取 損傷部位胸主動(dòng)脈段進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及SMx -actin、PCNA& collagenI免疫組化檢測。形態(tài)學(xué)及血管形態(tài)學(xué)計(jì)量指標(biāo)的測定大鼠麻醉后，放血處死，打開胸腔，在內(nèi)皮剝脫段相同部位取血管1cm，4多聚甲醛固定 24 小時(shí)，乙醇梯度脫水，石蠟垂直定向包埋，每段血管間斷均勻 切片 810 張后，常規(guī) HE 染色，每只大鼠標(biāo)本不同時(shí)間點(diǎn)各隨機(jī)取 3 片進(jìn)行光 鏡觀察、照相和圖像分析。按組織學(xué)劃分，內(nèi)彈力膜以內(nèi)為內(nèi)膜，內(nèi)彈力膜與 外彈力膜之間為中膜。以 MIAS 醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分別測量外彈力膜內(nèi)面積、內(nèi) 彈力膜內(nèi)

8、面積、管腔面積、外彈力膜周徑、內(nèi)彈力膜周徑以及管腔周徑。并在 此基礎(chǔ)上計(jì)算出中膜面積 =（外彈力膜內(nèi)面積 -內(nèi)彈力膜內(nèi)面積 ）、內(nèi)膜面積=（內(nèi) 彈力膜內(nèi)面積-管腔面積）、中膜厚度=（外彈力膜周徑-內(nèi)彈力膜周徑）/2n、 內(nèi)膜厚度=（內(nèi)彈力膜周徑-管腔周徑）/2n、內(nèi)膜面積增生比率=（內(nèi)膜面積”（內(nèi)膜面積+中膜面積）X100%、內(nèi)膜厚度增生比率=（內(nèi)膜厚度”（內(nèi)膜厚度+ 中膜厚度）X100% 、內(nèi)膜/中膜面積比、內(nèi)膜/中膜厚度比。免疫組織化學(xué)分析分別對 SMx -actin、PCNA 及 collagenI進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，鏡下觀 察相關(guān)抗原的表達(dá)變化，以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)信號(hào)。

9、每個(gè)指標(biāo) 在假手術(shù)組、模型7 天組、模型 14 天組和模型 21 天組都設(shè)立一個(gè)陰性對照 （陰 性對照以 PBS 替代一抗）。用圖像分析系統(tǒng)對表達(dá)信號(hào)進(jìn)行分析。結(jié)果以灰度值 表示，灰度值越小，表示相關(guān)的抗原表達(dá)越強(qiáng)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用 SPSS11.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn) 差（xs）表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者用 LSD 檢驗(yàn)，方差不齊者用 Dunnett T3 檢驗(yàn)。2 結(jié)果2.1 國產(chǎn)球囊致大鼠主動(dòng)脈損傷內(nèi)皮剝脫后血管形態(tài)學(xué)變化假手術(shù)組大鼠主動(dòng)脈壁各層結(jié)構(gòu)完整，管腔面積無縮小，內(nèi)膜光滑無增生， 中膜VSM（排列整齊。手術(shù)后 7 天

10、模型組增生不明顯；14 天內(nèi)膜有增厚，管腔 面積有縮??；21 天內(nèi)膜呈進(jìn)行性彌漫性增厚，管腔面積明顯縮小，增厚的內(nèi)膜 中以 VSM（為主，中膜細(xì)胞排列紊亂，表明內(nèi)皮剝脫后 21 天已形成典型的血管 再狹窄動(dòng)物模型（見圖 2）。2.2 血管形態(tài)學(xué)計(jì)量指標(biāo)比較各組中膜面積和中膜厚度差異均無顯著性意義 （P 0.05）。模型 7 天組內(nèi)膜 面積、內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜面積增生比率、內(nèi)膜厚度增生比率、內(nèi)膜 /中膜面積比、 內(nèi)膜/中膜厚度比與假手術(shù)組比較差異均無顯著性意義 （P0.05） 。模型 14 天組 上述各指標(biāo)均有所增加，但與假手術(shù)組和模型 7 天組比較差異均無顯著性意義 （P0.05） 。模型 21天

11、組內(nèi)膜顯著增生，其內(nèi)膜面積、內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜面積增 生比率、內(nèi)膜厚度增生比率、內(nèi)膜 /中膜面積比、內(nèi)膜 /中膜厚度比均顯著高于 假手術(shù)組和模型 7 天、14 天組（PV0.01）。見表 1。2.3 各組 PCNA 表達(dá)的比較假手術(shù)組未見到陽性細(xì)胞；模型 7 天組僅可見到極少量的陽性細(xì)胞；模型 14 天組可見到大量的陽性細(xì)胞，PCNA 表達(dá)非常明顯，分布在新生內(nèi)膜和中膜中; 模型 21 天組仍可見到較多的陽性細(xì)胞，但不及模型 14 天組顯著（見圖 3）。各 組定量比較見圖 6。模型 14 天組與假手術(shù)組、 模型 7 天組、 模型 21 天組比較 差異有顯著性意義（PV0.01） 。2.4 各組 S

12、Ma -actin 表達(dá)的比較假手術(shù)組未見到陽性細(xì)胞；模型 7 天組僅可見到極少量的陽性細(xì)胞；模型 14 天組和 21 天組均可見到大量的陽性細(xì)胞，SMa -actin 表達(dá)非常明顯（見圖 4）。各組定量比較見圖 6。模型 14 天組和模型 21 天組SMa -actin 表達(dá)顯著高 于假手術(shù)組和模型 7 天組（PV0.01）。各組 collagenI 表達(dá)的比較模型 7 天、14 天、21 天組 collagenI表達(dá)與假手術(shù)組比較，差異均無顯 著性（P 0.05）。（見圖 5）。各組定量比較見圖 6。3 討論內(nèi)膜增生的動(dòng)物模型主要有大鼠、兔、豬、狗和非人類靈長類。但迄今為 止尚無一種模型能

13、完整系統(tǒng)地模仿人類 PTCA 術(shù)后再狹窄的發(fā)生過程。由于大鼠 模型復(fù)制簡單，成功率高，實(shí)驗(yàn)周期短，廉價(jià)易得，且其頸總動(dòng)脈段無側(cè)枝血 管，無周圍血管內(nèi)皮的遷徙，其胸主動(dòng)脈管腔大小適中，中膜肌層較厚，可較 好地模擬 PTCA 手術(shù)。加之大鼠一般對動(dòng)脈粥樣硬化具有抗性，進(jìn)一步減少了影 響 VSMC 曾殖的干擾因素，便于機(jī)制的闡明，是初篩實(shí)驗(yàn)的首選模型2。由于進(jìn)口的球囊導(dǎo)管價(jià)格十分昂貴，尤其它很難匹配應(yīng)用在小動(dòng)物模型之上，因此 為建立可靠、價(jià)廉的方法，我們采用了國產(chǎn) 2.0F 球囊導(dǎo)管，試圖取代進(jìn)口的球 囊導(dǎo)管，建立大鼠主動(dòng)脈損傷血管內(nèi)膜增生模型，并對其特點(diǎn)及可行性進(jìn)行了 初步研究。實(shí)驗(yàn)中我們不僅從血

14、管形態(tài)學(xué)方面進(jìn)行了直觀分析，而且通過免疫組化指 標(biāo)加以佐證。形態(tài)計(jì)量學(xué)結(jié)果表明國產(chǎn)球囊導(dǎo)管制作的大鼠胸主動(dòng)脈損傷模型，血管內(nèi)膜有增生，且增生比較明顯的時(shí)間點(diǎn)在術(shù)后 21 天。因此，術(shù)后 21 天為 較好的時(shí)間觀察點(diǎn)。PCN/是脫氧核糖核酸（DNA）多聚酶的輔助蛋白，它參與 DNA 的合成，代表細(xì)胞的分裂增殖，是反映細(xì)胞增殖的一個(gè)特異性指標(biāo) 3 。結(jié)果發(fā) 現(xiàn)模型 14 天可以見到大量陽性細(xì)胞，表明增殖活躍的細(xì)胞此時(shí)PCNA 表達(dá)增加非常明顯。SMbc -actin 是 VSMC 勺特異性抗體，VSM（只有從分化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿?分化狀態(tài)，才能獲得增殖和合成能力，故 VSM（表型轉(zhuǎn)化是上述過程發(fā)生的前

15、提 條件，在血管再狹窄發(fā)病機(jī)制中占有重要地位。在血管損傷后的初始修復(fù)階段， VSMC1 現(xiàn)活躍增殖，SMx -actin 含量減少；當(dāng)病變逐步修復(fù)后， VSMC?止分 裂增殖，SM% -actin 含量增加。模型 7 天時(shí)僅見少量陽性細(xì)胞，模型 14 天、 21 天可以見到大量的陽性細(xì)胞。結(jié)合形態(tài)學(xué)結(jié)果和免疫組化PCNA 吉果，推斷術(shù)后 14 天、21 天增殖的 VSM（漸趨或已恢復(fù)到分化狀態(tài)。膠原是構(gòu)成正常血管 壁和新生內(nèi)膜細(xì)胞外基質(zhì)（ECM 的主要成分之一。已知的 19 種膠原中，I、川 型膠原分別占血管膠原總量的 6O%和 30%。I 型膠原具有促使 VSMC 由收縮型 向合成型轉(zhuǎn)變的作

16、用，因此選用 I 型膠原能有效反映受損血管 ECM 的合成情況。 然而，不同的粥樣硬化斑塊中膠原的情況可以有很大區(qū)別，即使在同一斑塊中 膠原的改變亦不均一，如在某一區(qū)域以I 型及川型膠原占優(yōu)勢，幾乎沒有W型或V型膠原；而另一區(qū)域可在內(nèi)皮下有大量W型膠原包裹的平滑肌細(xì)胞。多脂 的斑塊含有膠原較少，纖維斑塊可以沒有 I 型及川型膠原而富含W型及V型膠 原4。因此，這可能是實(shí)驗(yàn)中 collagenI表達(dá)無明顯變化的原因之一。目前，國際上比較常用的的模型是采用2F Fogarty 球囊導(dǎo)管損傷動(dòng)脈內(nèi)膜造模，使血管內(nèi)膜增生，導(dǎo)致管腔狹窄。與其相比，國產(chǎn)球囊導(dǎo)管簡單實(shí)用， 但造模損傷較輕，剝脫內(nèi)皮不夠均勻，內(nèi)膜增殖厚度不一致，在短時(shí)間內(nèi)達(dá)不 到比較好的效果。如果在實(shí)驗(yàn)具體操作中嚴(yán)格把握前后一致的球囊充盈量、保 持始終如一的球囊剝脫摩擦感