維生素C含量的定量測定實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)書

1、河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)課論文 姓名：封冰冰 專業(yè)：2012級(jí)生物科學(xué) 論文標(biāo)題：維生素C含量的定量測定 任課教師：李世朋 學(xué)號(hào) ：1225150064維生素C含量的定量測定摘要：用酸處理過的活性炭把還原型的抗壞血酸氧化為脫氫型抗壞血酸再繼續(xù)氧化為二酮古樂糖酸。二酮古樂糖酸與2.4-二硝基苯肼偶聯(lián)生成紅色的絡(luò)合物。其呈色的強(qiáng)度與二酮古樂糖酸濃度成正比，可以比色定量。本實(shí)驗(yàn)采用該種方法定量測定獼猴桃【1】中維生素C的含量。1、前言1.1維生素C具有的生物學(xué)意義： 對(duì)生物以及人體有意義的"維生素C"是純的左式右旋光（光學(xué)異構(gòu)）抗壞血酸；相對(duì)的"左旋光&quo

2、t;異構(gòu)物在生物體內(nèi)毫無用處。這兩種是同分異構(gòu)物。但是一般廣告經(jīng)常以左旋C稱呼，但事實(shí)上指的是L型維生素C?？箟难崾菑?qiáng)還原劑，當(dāng)它進(jìn)行作用時(shí)，會(huì)轉(zhuǎn)化為它的氧化形式為左式脫氫抗壞血酸左式脫氫抗壞血酸經(jīng)由體內(nèi)的酶和谷胱甘肽可回復(fù)至活性的左式抗壞血酸的形式。左式光抗壞血酸是一個(gè)與葡萄糖相似的弱糖酸結(jié)構(gòu)，能夠很自然的使氫離子附著上去而形成抗壞血酸，或是附著金屬離子，形成抗壞血酸礦物質(zhì)。1.2維生素C的功能作用： 在人體內(nèi)，維生素C是高效抗氧化劑，用來減輕抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase）基底的氧化應(yīng)力（oxidative stress）。還有許多重要的生物合成過程中也需要

3、維生素C參與作用。維生素C為8種不同的酵素作為電子供體： 其中3種參與膠原羥化。這些反應(yīng)將羥基放入氨基酸的脯氨酸或賴氨酸，再將此氨基酸加入至膠原蛋白分子內(nèi)（經(jīng)由脯氨羥化酶和羥化酶），從而使膠原蛋白分子能夠承擔(dān)其三重螺旋結(jié)構(gòu)，使得維生素C必須在維護(hù)組織、血管和軟骨的時(shí)候使用。 其中兩種要參與組合肉堿。肉堿在運(yùn)輸脂肪酸進(jìn)入粒線體制造ATP的時(shí)候是必需品。 剩下的三種有以下功能： 多巴胺參與腎上腺素來合成多巴胺羥化酶；另一種酶加入胺基成為縮胺酸激素，大大增加其穩(wěn)定性；其中一種調(diào)節(jié)酪氨酸代謝。 血漿中的維生素C的累積含量超過100倍的生物器官組織為腎上腺、腦垂體、胸腺、黃體酮及視網(wǎng)膜。而包括腦、脾、肺

4、、睪丸、淋巴結(jié)、肝、甲狀腺、小腸黏膜、白血球、胰臟、腎臟、唾液腺等器官組織內(nèi)的維生素C的含量也高于血漿中的維生素C 10至50倍。1.3維生素C在人體中的作用 維生素C治療壞血病是250年來醫(yī)學(xué)證實(shí)的事實(shí)。壞血病是長期缺乏維生素C的最終病況，它在人體上的表現(xiàn)是極度疲乏，肌肉無力，皮膚腫脹疼痛，牙齦出血，口臭，皮下及肌肉中血管破裂出血，關(guān)節(jié)軟弱，骨骼脆弱以致骨折，虛脫，瀉痢，肺臟及腎臟衰竭而導(dǎo)致昏迷以致死亡。由此可見維生素C對(duì)各個(gè)主要器官都有影響。 腎上腺是人體含維生素C最高的器官。人體在緊張的時(shí)候，腎上腺分泌大量的腎上腺素到全身的肌肉中，準(zhǔn)備好隨時(shí)動(dòng)作，應(yīng)付危機(jī)。腎上腺素是從酪氨酸（Tyros

5、ine）制成多巴（Dopa），轉(zhuǎn)化成多巴胺（Dopamine），再轉(zhuǎn)化為降腎上腺素（Noradrenaline），最后制成腎上腺素（Adrenaline）。其中每一步驟都要消耗維生素C進(jìn)行羥基化反應(yīng)（Hydroxylation）。這是為什么人和動(dòng)物的腎上腺必須儲(chǔ)備大量維生素C的原因。 膠原（Collagen）是一種蛋白質(zhì)，它存在人體的結(jié)締組織、血管和骨骼的組織及牙本質(zhì)細(xì)胞之間。它的機(jī)械強(qiáng)度超過同重量的鋼鐵，是動(dòng)物體型的基本支撐物質(zhì)。所以它可以使細(xì)胞排列緊密，皮膚緊致，骨骼牙齒堅(jiān)固。當(dāng)受到外傷時(shí)或是手術(shù)后它可以幫助細(xì)胞修復(fù)、促進(jìn)傷口的愈合。 維生素C促進(jìn)膠原質(zhì)的形成。膠原質(zhì)是由兩種氨基酸，賴氨酸

6、（Lysine）和脯氨酸（Proline），組合成的聚合巨分子。膠原質(zhì)的強(qiáng)度是因?yàn)橄木S生素C方才使吡咯氨酸醇化而加強(qiáng)了巨分子間的吸引力。缺乏維生素C時(shí)膠原質(zhì)的強(qiáng)度不足，則所有的器官組織都減弱而產(chǎn)生各種疾病，最嚴(yán)重的時(shí)候就成為壞血病。正常人的血管壁細(xì)胞，由于有膠原質(zhì)填塞所以能排列整齊，并確保其嚴(yán)密性。當(dāng)缺乏維生素C時(shí)，血管組織的嚴(yán)密性受到損害，只要外界稍加壓力，血液即自行滲出，這就是所謂的壞血病最表面的現(xiàn)象。合成膠原質(zhì)時(shí)必定消耗維生素C，所以要維持身體各個(gè)器和組織器官的健康，必須經(jīng)常攝取足夠的維生素C。 壞血病是維生素C枯竭的終結(jié)癥狀，它最明顯的特征就是血管系統(tǒng)的崩潰。在長期缺乏維生素C的情況

7、下，血管的組織減弱因此導(dǎo)致各種心臟和血管的疾病。血管之中冠狀動(dòng)脈是受壓力最高的部分，為了防止冠狀動(dòng)脈滲血及破裂，血管自行修補(bǔ)的方法一是加厚血管而使血管硬化，二是沈積膽固醇堵塞滲血的漏洞而使血管阻塞。 賴斯醫(yī)師Rath和鮑林Pauling發(fā)現(xiàn)大量的維生素C加上離氨基酸（Lysine）和吡咯氨基酸（Proline）可以清除冠狀動(dòng)脈現(xiàn)有沈積的粥樣硬化塊（Plaques）。 癌細(xì)胞其實(shí)普遍存在人體的許多組織中，但是它們不能無限制地增長和擴(kuò)散，只形成良性腫瘤。只有在膠原質(zhì)減弱時(shí)，癌細(xì)胞才能溶化膠原質(zhì)的屏障，從原始病灶擴(kuò)展到其它的組織和器官，對(duì)人體造成危害。平時(shí)維持足夠的維生素C，可以降低癌癥發(fā)生率。癌癥

8、病人服用大量維生素C，可以延緩癌細(xì)胞的擴(kuò)展，甚至壓制癌細(xì)胞的生長。 眼睛中的晶狀體和視網(wǎng)膜都含有高濃度的維生素C。缺乏維生素C時(shí)，晶狀體中的膠原質(zhì)就失去它的透明性而產(chǎn)生白內(nèi)障。維生素C也可以降低眼球內(nèi)液體的壓力，避免青光眼的病癥。 卡尼?。–arnitine）是一種氨基化合物，它在肌肉組織中幫助肌肉獲得收縮需要的能量?？嵬∫彩怯呻x氨酸（Lysine）經(jīng)過醇化而制成的。這個(gè)醇化反應(yīng)，也要消耗維生素C?？嵬∈侵舅嵫趸a(chǎn)生能量之重要運(yùn)送者，因此當(dāng)維生素C缺乏時(shí)，就會(huì)使人感到精神不濟(jì)，同時(shí)血液中亦會(huì)積存多量的中性脂肪。 維生素C可以增強(qiáng)血管的組織和減少血液中膽固醇的含量，對(duì)于動(dòng)脈硬化性心臟血管的

9、疾病與高血壓、中風(fēng)等的成人病都有很好的預(yù)防和治療效果。缺乏維生素C時(shí)，膽固醇不易分解成膽酸，而使血清膽固量提高，容易導(dǎo)致血管粥狀硬化及血栓癥。 人類和動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的主要工作是由白血球和淋巴球來完成的。白血球和淋巴球中維生素C的含量是血液中維生素C含量的30倍。白血球和淋巴球必須有足夠維生素C才能吞噬濾過性病毒與細(xì)菌，所以人體的免疫力，是和維生素C的存量是切切相關(guān)的。維生素C有很強(qiáng)的還原的能力。體內(nèi)許多生化反應(yīng)都需要維生素C的幫助才得以完成。維生素C可避免白血球受自體氧化的傷害，因此可強(qiáng)化免疫系統(tǒng)。 服用大量維生素C會(huì)增加血液中IgA，IgG及IgM等抗體的濃度。這些抗體附著在外來的病毒和細(xì)菌

10、上，指引白血球和淋巴球來將它們消滅。 維生素C可以幫助鈣、磷、鐵這類的礦物質(zhì)在小腸的吸收，所以對(duì)于貧血或是骨質(zhì)疏松癥者很有幫助。大多數(shù)鈣、磷、鐵的化合物，都不溶于水，所以不容易被人體吸收。維生素C的鈣、磷、鐵鹽則有很高的水溶解性，所以能夠幫助這類的礦物質(zhì)在小腸的吸收。 維生素C是一種抗氧化極強(qiáng)的物質(zhì)，對(duì)于人體長期暴露在不良的環(huán)境中（過氧化脂質(zhì)、抽煙、喝酒、蟲蛇咬傷及許多化學(xué)毒素）所產(chǎn)生的自由基物質(zhì)，都可以有效的清除。醫(yī)學(xué)界認(rèn)為自由基與癌癥或老化的發(fā)生有關(guān)。亞硝酸胺是一種致癌物質(zhì)，體內(nèi)若有足量維生素C存在時(shí)，就可以防止腌肉用的亞硝酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)生亞硝酸胺。 維生素C參與人體內(nèi)許多的生化反應(yīng)，缺乏維生素

11、C時(shí)這些反應(yīng)都不能順利進(jìn)行，在許多相關(guān)的器官中產(chǎn)生病變。大多數(shù)動(dòng)物都能在肝臟中自行生產(chǎn)維生素C，所以很少會(huì)染上傷風(fēng)，感冒，冠狀動(dòng)脈阻塞和癌癥這些人類特有的病癥。2.設(shè)備與試劑： 設(shè)備：50ml三角瓶4個(gè)；50ml容量瓶1個(gè)；大離心管2支；20ml量筒1個(gè)；移液管10ml 2支；離心機(jī)；研缽；堿式滴定管1支 實(shí)驗(yàn)材料：獼猴桃試劑： （1）1%草酸溶液 （2）2%草酸溶液 （3）0.005mg/ml 標(biāo)準(zhǔn)維生素C溶液：準(zhǔn)確稱取維生素C20mg，用1%草酸溶液定容至200ml。吸取此液10ml，以1%的草酸溶液稀釋定容至200ml。臨用時(shí)配，冰箱中貯存。 （4）0.005mg/ml2,6-二氯酚靛酚

12、溶液：稱取干燥的2,6-二氯酚靛酚60mg，放入200ml的容量瓶中，加熱蒸餾水100150ml，滴加0.01mg/ml NaOH溶液45滴，強(qiáng)烈搖動(dòng)10min，冷卻后加水至刻度，搖勻后用濾紙過濾，放入棕色瓶中。貯存在冰箱中備用，有效期一周，使用前標(biāo)定。3.實(shí)驗(yàn)原理 維生素C (又稱抗壞血酸)屬水溶性維生素，是人類營養(yǎng)中最重要的維生素之一，缺乏時(shí)得壞血病。它廣泛存在于植物中，尤以蔬菜和水果含量豐富【2】。 維生素C有強(qiáng)的還原性，在中性 和微酸性環(huán)境中它能將藍(lán)色的染料2，6-二氯酚靛酚還原成無色的還原型2,6-二氯酚靛酚，同時(shí)自身被氧化成脫氫抗壞血酸。 氧化型的2,6-二氯酚靛酚在酸性溶液中呈紅

13、色，在中性或堿性溶液中呈藍(lán)色。所以，當(dāng)用2,6-二氯酚靛酚滴定含有抗壞血酸的酸性溶液時(shí)，在抗壞血酸全部被氧化后，再滴下的2,6-二氯酚靛酚將立即使溶液呈淡紅色，從而顯示到達(dá)滴定終點(diǎn)。如無其他雜質(zhì)干擾，樣品提取液所還原的標(biāo)準(zhǔn)染料量與樣品中所含的還原型抗環(huán)血酸量成正比。 此法操作簡便，但存在下列缺點(diǎn)：生物組織中的脫氫抗環(huán)血酸及結(jié)合抗環(huán)血酸同樣具有維生素C的生理作用，不能用此法測出。生物材料提取液中含有的其他還原性物質(zhì)，也可使2,6-二氯酚靛酚還原脫色而引起誤差。提取液中常存在的色素類物質(zhì)干擾滴定終點(diǎn)的觀察。由于提取液中其他還原性物質(zhì)還原2,6-二氯酚靛酚的速度較慢，故可將滴定過程控制在2min之內(nèi)

14、，并判斷終點(diǎn)以淡紅色1530s內(nèi)不消失為準(zhǔn)。當(dāng)提取液綠色素太多，嚴(yán)重干擾終點(diǎn)判斷時(shí)，可先用白陶土或氫氧化鋁乳液脫色。這些措施可以在一定程度上減少測量誤差。4.實(shí)驗(yàn)操作步驟4.1樣品提取 取1g獼猴桃，加5ml2%草酸溶液，于研缽中研磨成漿狀，將提取液及渣子一起轉(zhuǎn)移到離心管中，用20ml2%草酸溶液分23次沖洗研缽，洗液一并轉(zhuǎn)入離心管中【3】。在其中加入6ml氫氧化鋁乳液（也可用適量白陶土代替），搖勻并靜置約5min，然后3000r/min的轉(zhuǎn)速離心1520min，上清液轉(zhuǎn)移到50ml容量瓶中，用2%草酸溶液定容至刻度，搖勻備用。4.2標(biāo)準(zhǔn)液的滴定 準(zhǔn)確吸取0.005mg/ml標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)維生素C

15、溶液10ml，放入50ml，同時(shí)吸取10ml1%草酸溶液于另一個(gè)50ml三角瓶中作空白對(duì)照。用已標(biāo)定的2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至粉紅色出現(xiàn)，且15s內(nèi)不消失，記錄所用毫升數(shù)。計(jì)算每毫升2，6-二氯酚靛酚溶液所能氧化的毫克數(shù)。4.3樣液的滴定 準(zhǔn)確吸取樣液兩份，每份10.0ml，分別放入兩個(gè)50ml錐形瓶中用標(biāo)定過的2，6-二氯酚靛酚溶液滴定，空白樣滴定方法如前。5.結(jié)果及計(jì)算 每100g樣品中抗壞血酸的量（mg）= 式中：為滴定樣液所用染料體積（ml）; 為滴定空白樣所用染料體積（ml）； 為樣品測定時(shí)所用的濾液體積（ml） 為樣品提取液稀釋的總體積（ml） 為1ml2，6-二氯酚靛酚溶液所能氧化的抗壞血酸的量（mg/ml）,可由標(biāo)定計(jì)算； 為10ml樣液相當(dāng)于含樣品的量（g）6.結(jié)束語（1） 滴定過程宜迅速進(jìn)行，一般不應(yīng)超過2min。滴定所用染料應(yīng)在14ml之間，若滴定結(jié)果超出此范圍，則必須增、減樣品量或?qū)⑻崛∫哼m當(dāng)稀釋。（2） 2%草酸溶液可抑制抗壞血酸氧化酶，1%草酸溶液則不能，偏磷酸也有同樣功效。若樣品中含有大量亞鐵離子