乙腦病毒E蛋白的原核表達(dá)、純化及初步鑒定

1、乙腦病毒e蛋白的原核表達(dá)、純化及初步鑒定作者：高淑嫻，張偉， 任君萍，雷迎峰，丁天兵，宋建華，馬文煜，徐志凱【abstract 】 aim: to construct gene encoding japanese encephalitis virus (jev) envelope glycoprotein and to express e protein in bl21 (de3). methods: using rt pcr, the gene encoding e protein was amplified. the gene was cloned into pet28a(+) and t

2、he recombinant plasmid pet28 6his e was transformed into bl21 (de3) the 6iiis e protein expressed in bl21 (ed3) was determined by sds page and western blotting. the expression product in in elusion body was purified by ni nta chromatography. results: sequencing of e gene revealed that the mutation r

3、ate was 0. 2% (3/1500) and the base mutation didn t change the amino acid nonsense the recombinant expression vector pet28 6iiis e was constructed and the 6his e prot ein was successfully expressed in an in soluble form. after expression and purification by metal chelate affinity chromatography, pur

4、ified 6his e fusion protein was obtained. conclusion: the e protein can be expressed in prokaryotic cell and would be useful for further research on the receptor of jev and its infection mechanisms.keywords encephalitis virus, japanese; viral envelopeproteins; recombinant fusion proteins【摘要】目的：構(gòu)建乙腦病

5、毒(jev) e蛋白重組載體并在原核細(xì)胞 bl2kde3)中表達(dá).方法：釆用rt pcr擴(kuò)增片段，定向克隆入pet28a(+) 中；重組載體pet28a 6his e轉(zhuǎn)化bl21(de3),通過酶切、sds page和 western blotting檢測其載體構(gòu)建和蛋口表達(dá)；表達(dá)產(chǎn)物包涵體經(jīng) ni nta親和層析純化.結(jié)果：構(gòu)建得到原核融合重組載體 pet28a 6his e；誘導(dǎo)后表達(dá)得到6his e融合蛋白，純化得到表達(dá)產(chǎn) 物并進(jìn)行了初步的鑒定.結(jié)論：表達(dá)并純化得到j(luò)ev e蛋白原核表達(dá)產(chǎn) 物.【關(guān)鍵詞】腦炎病毒，口本；病毒包膜蛋白質(zhì)類；重組融和蛋白質(zhì) 類0引言流行性乙型腦炎(japan

6、ese encephalitis, je)簡稱乙腦，是山嗜 神經(jīng)的乙腦病毒(jev)所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)性傳染病1jev屬包膜 病毒科黃病毒屬，呈球型，直徑2030 nm,核心含單股rna,有衣殼， 冇三個結(jié)構(gòu)蛋白，即e蛋白、核蛋白c和膜蛋白m. e蛋白為糖蛋白，包 裹在病毒的表面，它決定著病毒的毒力及其宿主范圍，不僅在與宿主細(xì)胞 受體結(jié)合及隨后的膜融合中發(fā)揮重要作用，而且可刺激產(chǎn)生中和抗體2. 我們對e蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)、純化及鑒定，為進(jìn)一步研究病毒的受體和 病毒的感染機(jī)制提供了有利條件.1材料和方法1.1材料pet28a （+）表達(dá)載體和xl 10, bl21（de3）宿主菌為本試驗(yàn)室 保存

7、.p1,p2引物合成及序列測定由三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成; 限制性內(nèi)切酶、pmd 18t, ex taq聚合酶和連接試劑盒（寶航公司）；逆 轉(zhuǎn)錄試劑盒（invitrogen公司）；jev鼠源性mab和兔源多克隆抗體山本 實(shí)驗(yàn)室制備；猴抗鼠紅外標(biāo)記二抗、羊抗兔紅外標(biāo)記二抗（rockland公司）； 紅外成像系統(tǒng)（li c0r公司）；高速低溫離心機(jī)（beckman公司）；恒溫 搖床（上海智城公司）.12方法1.2. 1片段的擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建用trizol提取jev rna,以8卩 lrna 為模板，1 ul pl 為引物，1 ul dntp 65 °c 水浴 5 min,冰浴

8、 1 min, 2 u l 10 x rt 緩沖液，4 u l 25 mmol/lmgc12, 1 u l rnaseout recombinant inhibitor, 42°c水浴 2 min；加 1 u l superscripttm 混勻； 42°c水浴 50 s； 70°c水浴 15 min；加 1 u l raaseh 混勻；37°c水浴 20 min； 將得到的產(chǎn)物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，5 '端引物：5 ' cgctcgagttaagcatgcattggtcgctaa 3；3 7 端引物：5cggaattctttaatcgttgt

9、ctgggaatgggcaatcgtgac 3'.反應(yīng)條 件為： 94°c 5 min, 94°c 50 s； 55°c 1 min； 72°c 1 min 30 s, 30 個循環(huán)， 72°c 15min.l0g/l瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物,回收目的片段.將回 收的pcr產(chǎn)物克隆入pmd 18t載體中轉(zhuǎn)化ecoli e. xl 10感受態(tài)細(xì)胞, ecor i和xhol i酶切鑒定，陽性克隆送公司測序；測序正確后，ecor i和xhol i雙酶切pmd 18t e質(zhì)粒和表達(dá)載體pet28a,回收r的片段，連接; 轉(zhuǎn)ecoli e.xl

10、 10感受態(tài)細(xì)胞；挑克??；提取質(zhì)粒；酶切鑒定載體構(gòu)建. 陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌bl2kde3）；提取質(zhì)粒；酶切鑒定；陽性克 隆保留菌種.1. 2. 2工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析用載體構(gòu)建成功的菌種劃抗性 平板，挑取單克隆在37°c培養(yǎng)至a600 nm為0. 40. 6,加入100 mg/l iptg 誘導(dǎo)4h.1000 r/min, 4°c 10 min離心收菌.棄上清后用pbs洗菌體,用去離子水重懸菌體加入2xsds上樣緩沖液進(jìn)行樣品處理.另離心收 集菌體，以溶液 ste（50 mmol/l tris cl （ph 8. 0） , 1 mmol/l edta, 10

11、0 mmol/l nacl）重懸菌體，超聲破菌（間隔10 s,超聲8 s,共15 min）分 別收集上清和沉淀，上清用5xsds上樣緩沖液處理，沉淀用1 xsds±樣 緩沖液處理后徹底重懸.取上述各樣品做sds page用2.5 g/l考馬斯 r 25溶液室溫染色2 h后脫色.1.2.3重組蛋白的鑒肚同上取上清和沉淀樣品分別進(jìn)行處理并做 sds page,隨后將電泳蛋白轉(zhuǎn)移到nc膜上（轉(zhuǎn)移緩沖液：廿氨酸39 mmol/l, tris 堿 48 mmol/l, sds 3. 7 mg/l,甲醇 200 ml/l）, 100 v 轉(zhuǎn)移 80 min 后用 25 mmol/l tbs 平衡

12、 nc 膜 10 min,用 0. 5 g/l 的脫脂奶 4°c 封閉5 h ,用tbs - t洗膜3次，10 min/次，1 ： 200稀釋jev鼠源性mab, 1 : 100稀釋jev兔源性多抗，4°c孵育過夜，然后用tbs -t洗膜3次，10 min/次，再與1 ： 2500稀釋的猴抗鼠抗體和羊抗兔抗體分別孵育，4°c作 用90 min后洗膜3次，10 min/次，然后進(jìn)彳亍掃描分析.1. 2. 4重組蛋白的純化參照qiagen公司鎳離子親和層析柱（ni nta）操作說明進(jìn)行.離心收集500 ml誘導(dǎo)宿主菌，冰浴15 min；按5 ml/g濕 菌的比例加入含

13、8 mol/l尿素的緩沖液b（ph 8. 0）,室溫下輕輕攪拌使細(xì)菌 裂解至溶液清亮，4°c, 8563 g離心收集上清，棄去沉淀；將500 ml/l的 ni nta樹脂懸浮液1 ml與一定量的清亮裂解上清于室溫輕柔混勻（100 r/min搖動60 min）后，將混合液裝柱;收集穿過峰，留小樣進(jìn)行sds page； 然后用緩沖液w（20 mmol/l咪呼,ph 8.0）洗柱,再用緩沖液e（250 mmol/l 咪哇,pii80）洗脫，收集洗脫液.取不同峰值樣品進(jìn)行sds page分析.2結(jié)果2. 1重組表達(dá)載體的構(gòu)建陽性重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物在大小約1500 bp處 出現(xiàn)條帶（圖1）,與預(yù)

14、期大小相符.序列測定結(jié)果有三個堿基突變（第 30位堿基c突變?yōu)閠,笫705位堿基a突變?yōu)間,第1298位堿基t突變?yōu)?a）,皆為無意義突變.m: dl2000 dna marker; 1:空 pet28a; 2: pet28a e 雙酶切產(chǎn)物.圖lpet28a e的酶切鑒定（略）2. 2融和蛋白e的表達(dá)與溶解形式的分析經(jīng)sds page檢測,在mr約53 000處有明顯的條帶，與預(yù)期的6his e融和蛋白大小一致.融和蛋白 主要以包涵體形體存在于沉淀中，但上清中也有少量的誘導(dǎo)表達(dá)的融和蛋 白薄層掃描顯示其占菌體總蛋白的40% （圖2）.m:標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)marker; 1:空pet28a未誘導(dǎo)細(xì)胞

15、；2:空pet28a誘 導(dǎo)細(xì)胞；3:重組載體pet28a e未秀導(dǎo)細(xì)胞；4:重組載體pet28a e誘 導(dǎo)細(xì)胞；5:重組載體pet28a e誘導(dǎo)細(xì)胞裂解上清；6:重組載體 pet28a e誘導(dǎo)細(xì)胞裂解沉淀.圖2e蛋白的表達(dá)及可溶性分析（略）2. 3融和蛋白e的大量表達(dá)及純化利用ni nta agarose柱通過金屬 螯合親和層析進(jìn)行純化，從大腸桿菌bl2kde3）表達(dá)菌體的沉淀中變性、 純化得到6hise融合蛋白.純化的蛋白經(jīng)peg4000濃縮后經(jīng)透析除去尿素，應(yīng)用紫外光吸收法定量分析表明獲得蛋白的濃度約為0. 759 g/l （圖 3）2.4e蛋白的western blotting用0dys

16、sey掃描,在預(yù)期大小處可見 清晰條帶，提示純化的e蛋白較好地保持了與抗jev的多抗和單抗的結(jié)合 活性（圖4,5）m:標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)marker. 1:空pet28a未誘導(dǎo)細(xì)胞；2:空pet28a誘 導(dǎo)細(xì)胞；3:重組載體pet28a e誘導(dǎo)細(xì)胞裂解上清；4:重組載體 pet28a e誘導(dǎo)細(xì)胞裂解沉淀；59:純化的融和蛋白.圖36his e蛋白的純化（略）1, 2: pet28a e誘導(dǎo)細(xì)胞；3: pet28a e未誘導(dǎo)的細(xì)胞；4:空 pet28a誘導(dǎo)的細(xì)胞；5:空pet28a未誘導(dǎo)的細(xì)胞.圖4融合蛋白6his e的jev多抗western blotting鑒定（略）1, 2: pet28a e誘導(dǎo)

17、細(xì)胞；3: pet28a e未誘導(dǎo)的細(xì)胞.圖 5 融和蛋白 6his e 的 jev mab western blotting 分析（略）3討論jev 與西尼羅病毒（west nile virus, wnv） 登革病毒（dengue virus,dv）同屬黃病科黃病毒屬成員3,其e蛋白有著與jev e蛋白有著相似 的結(jié)構(gòu)和功能，例如它們都有著三個結(jié)構(gòu)域，即i ,11,111 2, 4蛋白 結(jié)構(gòu)域i主要承擔(dān)著整個蛋白結(jié)構(gòu)的形成；結(jié)構(gòu)域ii包含一個融合環(huán)，推 測其與病毒與豬主細(xì)胞的膜融合冇關(guān)；而結(jié)構(gòu)域iii則被認(rèn)為是病毒與豬主 細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)的部位2, 5chu等4用wnv e蛋白結(jié)構(gòu)域iii蛋白

18、不僅能抑制wnv對c6/36細(xì)胞、vero細(xì)胞的侵入，還能夠抑制dv 2對這 兩種細(xì)胞的入侵.作為同屬病毒它們冇著很相似的結(jié)構(gòu)和交叉的功能，但它們又有著種 的特異性.例如，研究已證明wnv e蛋白是三聚體，而不是像dv e蛋白 是二聚體，并且揭示和分析了 wnve蛋白的表位抗原位點(diǎn)3,揭示了 dv 2 型e蛋白晶體結(jié)構(gòu)，明確了 dv 2 e蛋口各區(qū)的功能4.另外，已有 報道用黃病毒科的莫他病毒的e蛋白和e蛋白iii區(qū)蛋白成功的篩選到受體 蛋白或受體復(fù)合物6-8目前je仍然威脅著人類的健康，在亞洲國家每年仍有je 50 000例, 其中有10 000例死亡9然而關(guān)于jev的致病機(jī)制到目前為止仍不

19、明 確.jev的e蛋白在病毒與敏感細(xì)胞結(jié)合過程中起著重要的作用，jev敏 感細(xì)胞表面冇病毒的相應(yīng)受體，但其性質(zhì)和結(jié)構(gòu)尚未明確.由于e蛋白 的真核表達(dá)糖基化過多，嚴(yán)重影響了e蛋白的生物學(xué)活性，我們力圖用原 核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)e蛋白，在多次嘗試不同表達(dá)載體與宿主菌z后，成功的 構(gòu)建了 e蛋白的原核表達(dá)載體.對原核表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析結(jié)果表明，表達(dá)的e蛋白主要以包涵體的形式存在于菌體裂解后的沉淀中（占表達(dá)總量的95%左右).表達(dá)的e蛋白經(jīng)純化后用sds page和western blotting鑒定，結(jié) 果表明其mr人約為53 000,與預(yù)期大小一致；表達(dá)的e蛋白均能與jev的 單抗和多抗結(jié)合，表明其具

20、有較好的反應(yīng)原性.實(shí)驗(yàn)中觀察到e蛋白與多 抗的結(jié)合要強(qiáng)于與單抗的結(jié)合，分析其原因，可能是由于多抗所針對的抗 原表位多，而單抗只針対單一抗原表位，因此蛋白與單抗的結(jié)合受到一定 影響.基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(30400378)【參考文獻(xiàn)】1 馮國和，竇曉光，王玉梅，等.流行性乙型腦炎dna疫苗研究 新進(jìn)展j國外醫(yī)學(xué)流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊，2005, (32):368-3702 lin cw, wu sc. a functional epitope determinant on domain ttt of the japanese encephalitis virus envelope prote

21、in interacted with neutralizing antibody combining sites j j virol, 2003,77(4):2600-26063 kanai r, kar k, anthony k, et al. crystal structure of west nile virus envelope glycoprotein reveals viral surface epitopes j j virol, 2006,80(22):11000-11008_4 chu jj, rajamanonmani r, li j, et al. inhibition

22、of westnile virus entry by using a recombinant domain 111 from the envelope glycoprotein j j gen virol. 2005;86(pt 2):405-412.5 modis y, ogata s, clements d, et al. a 1 igand binding pocket in the dengue virus envelope glycoprotein j . proc natl acad sci usa, 2003, 100(12):6986-6991.infection6 reyes del valle j, chavez salinas s, medina f, et al. heat shock protein