多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段(優(yōu)質(zhì)課)

1、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù)技術(shù))， 是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為序列的方法，故又稱為DNA體外擴(kuò)增技術(shù)體外擴(kuò)增技術(shù)。課題課題2 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段片段1 1、DNADNA分子的組成成分和結(jié)構(gòu)分子的組成成分和結(jié)構(gòu)DNA DNA 分子的基本組成單位是分子的基本組成單位是 . .共有共有 種種, ,每個(gè)基本單位是由一分子每個(gè)基本單位是由一分子的的 、一分子的、一分子的 、和一分子的和一分子的 構(gòu)成。構(gòu)成。脫氧核甘酸脫氧核甘酸4 4磷酸磷酸堿基堿基脫氧核糖脫氧核糖 那么那么DNADNA分子的平面結(jié)構(gòu)怎分

2、子的平面結(jié)構(gòu)怎樣呢？樣呢？二二 、基礎(chǔ)知識、基礎(chǔ)知識脫氧脫氧核糖核糖含氮堿基含氮堿基磷酸磷酸A G C T1 1、DNADNA的基本單位的基本單位12345OOOPOHO堿基堿基OOHOOPOHOOH堿基堿基533553ATGCAGCT5端端3端端5端端3端端 識別識別 ： DNA分子的分子的3 端與端與5 端端-OH端為端為3 ; 磷酸基團(tuán)的末磷酸基團(tuán)的末端為端為5。2 2、DNADNA分子復(fù)制的過程分子復(fù)制的過程參與的組分參與的組分在在DNADNA復(fù)制中的作用復(fù)制中的作用解旋酶解旋酶打開打開DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA母鏈母鏈提供提供DNADNA復(fù)制的模板復(fù)制的模板4 4種脫氧核苷酸種

3、脫氧核苷酸合成子鏈的原料合成子鏈的原料DNADNA聚合酶聚合酶催化合成催化合成DNADNA子鏈子鏈引物引物使使DNADNA聚合酶能夠從引物的聚合酶能夠從引物的3 3 端開始連接脫氧核苷酸端開始連接脫氧核苷酸解旋酶解旋酶DNADNA母鏈母鏈4 4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸DNADNA聚合酶聚合酶引物引物（ RNA）打開打開DNADNA雙鏈雙鏈模板模板合成子鏈原料合成子鏈原料催化子鏈合成催化子鏈合成使使DNADNA聚合酶能從引聚合酶能從引物物3 3端開始連接脫氧端開始連接脫氧核苷酸核苷酸 思考：思考：是什么？是什么？ 體外擴(kuò)增體外擴(kuò)增DNA DNA 如何提供相似環(huán)境？如何提供相似環(huán)境？ 變性變性（

4、80-100 ）TaqTaq聚合酶（耐高溫）聚合酶（耐高溫）20203030個(gè)核苷酸構(gòu)個(gè)核苷酸構(gòu)成成DNADNA或或RNARNADNA雙鏈雙鏈單鏈單鏈變性（加熱變性（加熱80-100 ）復(fù)性（緩慢冷卻）復(fù)性（緩慢冷卻）4 4、DNA DNA 分子的熱變性原理：分子的熱變性原理：變性的目的：變性的目的：復(fù)性的目的：復(fù)性的目的：解開雙鏈解開雙鏈有利于引物有利于引物和引物和引物與兩條單與兩條單鏈的結(jié)合鏈的結(jié)合一、一、PCRPCR的原理的原理（ PCRPCR的技術(shù)原理）的技術(shù)原理）1234522557294時(shí)間（時(shí)間（minmin）溫度（）適溫延伸高溫變性低溫復(fù)性重復(fù)13步30輪3、DNA復(fù)制的方向D

5、NA的合成方向總是從子鏈的的合成方向總是從子鏈的5端向端向3端端延伸延伸2 2、步驟：、步驟：變性變性 復(fù)性復(fù)性延伸延伸PCRPCR技術(shù)的原理總結(jié)技術(shù)的原理總結(jié) 利用利用DNA分子的分子的熱變性原理熱變性原理，通過控制，通過控制溫度溫度來控制雙鏈的來控制雙鏈的解旋與結(jié)合解旋與結(jié)合，從而完成體外，從而完成體外DAN分分子的子的擴(kuò)增擴(kuò)增。 體外體外DNADNA復(fù)制的條件：復(fù)制的條件： 四種脫氧四種脫氧核苷核苷酸酸、耐高溫的、耐高溫的DNADNA聚合酶聚合酶、引物引物、 模板模板；緩沖溶液緩沖溶液、嚴(yán)格控制溫度的、嚴(yán)格控制溫度的溫控設(shè)備溫控設(shè)備。復(fù)制的方向：復(fù)制的方向：子鏈的子鏈的5端向端向 3端延

6、伸。端延伸。二、二、PCR的反應(yīng)過程的反應(yīng)過程 5/3/3/5/5/3/引物引物5/3/引物引物變性變性95oC復(fù)性復(fù)性55oC延伸延伸72oC5/3/3/5/5 引物引物15 引物引物2第二次復(fù)制第二次復(fù)制第一次復(fù)制第一次復(fù)制5 5 5 5 5 5 模板模板DNA5 5 5 5 5 5 5 5 每個(gè)循環(huán)包括：每個(gè)循環(huán)包括：變性變性 復(fù)性復(fù)性延伸延伸 從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也可以作為模板參與反應(yīng)，并且由引物可以作為模板參與反應(yīng)，并且由引物延伸延伸而成的而成的DNADNA單鏈會與引物單鏈會與引物結(jié)合，進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)行DNADNA的的延伸，這樣，延伸，

7、這樣，DNADNA聚合酶只能特異性地復(fù)制聚合酶只能特異性地復(fù)制處處于兩個(gè)引物之間的于兩個(gè)引物之間的DNADNA序列序列，使這段固定長度使這段固定長度的序列的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。呈指數(shù)擴(kuò)增。PCRPCR的反應(yīng)過程總結(jié)的反應(yīng)過程總結(jié)三、三、 PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作三、三、 PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作（1）按配方將所需試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上（）按配方將所需試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上（準(zhǔn)備準(zhǔn)備）（2）用）用微量移液器微量移液器按配方在微量按配方在微量離心管離心管中依次加入各組分（中依次加入各組分（移液移液）（3）蓋嚴(yán)）蓋嚴(yán)離心管離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合

8、混合）（4）將微量離心管放在）將微量離心管放在離心機(jī)離心機(jī)上（上（離心離心）（5）將離心管放入）將離心管放入PCR儀儀上，設(shè)置好上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序（儀的循環(huán)程序（反應(yīng)反應(yīng)）四、結(jié)果分析與評價(jià)四、結(jié)果分析與評價(jià)DNA 含量的測定：含量的測定：稀釋稀釋對照調(diào)零對照調(diào)零測定測定計(jì)算（公式見計(jì)算（公式見P63）波長波長260nm處讀數(shù)處讀數(shù)蒸餾水蒸餾水做對照做對照50倍倍 測定測定并并 的含量為的含量為體內(nèi)體內(nèi)DNA復(fù)制與復(fù)制與PCR的技術(shù)區(qū)別：的技術(shù)區(qū)別：體內(nèi)復(fù)制體內(nèi)復(fù)制PCRPCR技術(shù)技術(shù)解旋解旋在解旋酶作用下，細(xì)在解旋酶作用下，細(xì)胞提供胞提供ATPATP，部分解開，部分解開加熱到加熱到

9、9494o oC,C,雙鏈全雙鏈全部解開，不需解旋酶部解開，不需解旋酶引物引物一小段一小段RNARNA一般用一般用DNADNA片段片段DNADNA聚合酶聚合酶細(xì)胞自身的細(xì)胞自身的DNADNA聚合酶聚合酶（不耐高溫）（不耐高溫）TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶復(fù)制特點(diǎn)復(fù)制特點(diǎn)半保留復(fù)制，邊解旋半保留復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，多起點(diǎn)復(fù)制。邊復(fù)制，多起點(diǎn)復(fù)制。半保留復(fù)制，完全解半保留復(fù)制，完全解旋后復(fù)制，從模板鏈旋后復(fù)制，從模板鏈的一端開始復(fù)制。的一端開始復(fù)制。復(fù)制的方向復(fù)制的方向 子鏈的子鏈的55端向端向 3 3端端延伸延伸子鏈的子鏈的55端向端向 3 3端延伸端延伸課堂小結(jié)課堂小結(jié)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)

10、增多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段片段PCR原理原理DNA的復(fù)制需要酶、原料、能量、引物的復(fù)制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復(fù)性受溫度影響的變性和復(fù)性受溫度影響PCR過程過程變性變性復(fù)性復(fù)性延伸延伸操作步驟操作步驟配制配制PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系移入離心管移入離心管放入放入PCR設(shè)置工作參數(shù)設(shè)置工作參數(shù)DNA擴(kuò)增擴(kuò)增測定含量測定含量稀釋稀釋調(diào)零調(diào)零測定并讀數(shù)測定并讀數(shù)計(jì)算計(jì)算練習(xí)鞏固練習(xí)鞏固1、關(guān)于、關(guān)于PCR技術(shù)的應(yīng)用，錯(cuò)誤的一項(xiàng)是技術(shù)的應(yīng)用，錯(cuò)誤的一項(xiàng)是A 古生物學(xué)、刑偵破案、古生物學(xué)、刑偵破案、DNA序列測定序列測定B 診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學(xué)診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學(xué)C DNA序列測定、基因克隆、刑偵破案序列測定、基因克隆、刑偵破案D 診斷遺傳疾病、合成核苷酸、診斷遺傳疾病、合成核苷酸、DNA序列序列測定測定2、DNA的合成方向總是從子鏈的哪一的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延伸？端向哪一端延伸？3、PCR技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是A 原理簡單原理簡單 B 原料易找原料易找C TaqDNA聚合酶有耐熱性聚合酶有耐熱性D 快