《DNA的粗提取與鑒定》

1、dna的粗提取與鑒定教材內容解讀要點1提取dna的方法（1）分離選用一定的物理或化學方法分離具有不同物理或化學性質的生物人分子。（2）dna的溶解性dna和蛋白質等其他成分在不同濃度的nacl溶液中溶解度不同，dna在nacl溶液中的 溶解度隨nacl的濃度變化，在0. 14mol/l的nacl溶液中溶解度最低。選擇適當?shù)柠}溶液就 能使dma充分溶解，而使雜質沉淀，在0. 14mol/l的nacl溶液中dna會析出。dna不溶于酒精溶液，但是細胞屮的某些蛋白質則溶于酒精。利用這一原理，可以將dna 與蛋白質進一步分離。（3）dna對酶、高溫和洗滌劑的耐受性蛋白酶能水解蛋白質，但是對dna沒冇影

2、響。大多數(shù)蛋白質不能忍受6080°c的高溫, 而dna在80°c以上才會變性。洗滌劑能夠瓦解細胞膜，但對dna沒有影響。（4）dna的鑒定在沸水浴的條件下，dna遇二苯胺會被染成藍色。二苯胺可以作為鑒定dna的試劑。 要點2實驗設計（1）實驗材料的選取選用dna含量相對較高的生物組織，如雞血。（2）破碎細胞，獲取含dna的濾液動物細胞以雞血為例，在雞血細胞液屮加入一定量的蒸憎水，同時用玻璃棒攪拌，過濾 后收集濾液即可。植物細胞需要先用洗滌劑溶解細胞膜。（3）去除濾液中的雜質方法有三種：%1 在濾液中加入nacl,使nacl溶液濃度為2mol/l,過濾除去不溶的雜質，再調節(jié)n

3、acl 溶液濃度為0. 14mol/i.析出dna過濾去除溶液屮的雜質,再川加ol/l的nacl溶液溶解dna。%1 直接在濾液中加入嫩肉粉反應1015分鐘，嫩肉粉中的木瓜蛋白質酶能夠分解蛋白 質。%1 將濾液放在6075°c的恒溫水浴箱屮保溫1015分鐘。（4）dna的析出與鑒定%1 析出較純凈的dna將處理后的溶液過濾，加入與溶液體積相等的、冷卻的酒和溶液（體積分數(shù)為95%）, 靜置23分鐘，溶液中會出現(xiàn)白色絲狀物，并用濾紙吸去上而的水分。%1 dna的鑒定取兩支20n）l的試管，各加入物質的量濃度為2mol/l的nacl溶液5ml,將絲狀物放入 其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使

4、絲狀物溶解。然后，向兩支試管屮各加入4汕的二苯胺 試劑。泯合均勻后，將試管置于沸水中加熱5分鐘，待試竹冷卻后，比較兩支試管中溶液顏 色的變化。溶解有dna的溶液變藍。要點3實驗案例案例一以雞血為實驗材料進行dna的粗提取課前準備本實驗用雞血細胞做實驗材料有兩個原因。一是因為雞血細胞核的dna含量豐富，材料 易得；二是雞血細胞極易吸水脹破，而用動物肝臟細胞作實驗材料常常需要勻漿和離心，對 設備要求較高，操作繁瑣，歷時較長。教師可以到市場售活雞處索取雞血，所帶燒杯中必須提前放入抗凝劑檸檬酸鈉溶液。具 休制備方法如下。取質量濃度為0. lg/ml的檸檬酸鈉溶液looml,置于500n±燒杯

5、中，注入 新鮮的雞血（約180ml）,同時用玻璃棒攪拌，使血液與檸檬酸鈉溶液充分混合，以免血液 凝結。將燒杯中的血液置于冰箱內，靜置id,使血細胞自行沉淀。有條件的學校也可以將 血液倒入離心管內進行離心,用2000r/min或3000r/min的轉速,離心2min,使血細胞沉 淀于離心管底部，這樣可以使血細胞沉淀更完全。川吸管除去上部的澄清液，就町以得到雞 血細胞液。值得注意的是雞血細胞破碎以后釋放出的dna,容易被玻璃容器吸附，所以在提 取過程中為了減少dna的損火，最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細胞液。提取dna的具體步驟1. 破碎細胞,釋放dna雞血細胞中的d5ia與核蛋白結合，位于雞

6、血細胞的細胞核屮，正常情況下是不會釋放出 來的。為了使dna從細胞核中禪放出來，需要向雞血細胞液中加入蒸館水，并月攪拌，從而 使血細胞膜和核膜脹破。用玻璃棒攪拌可以加速細胞的破裂。注意應沿一個方向快速攪拌， 但也不能太快太猛，防止打碎dna。-般5loml的雞血細胞液加入20ml蒸館冰攪拌5min0 釋放出來的人量dna和rna往往與蛋白質結合在-起，應用34層紗布進行過濾，除去一 些顆粒較人的雜質。2. 溶解細胞核內的dm在濃度較高的nacl溶液中核蛋白容易解聚，游離出的dna溶解在溶液中。在溶液中加 入兩倍體積的濃度為2mol/l的nacl溶液，攪拌lmino注意應沿一個方向攪拌，使d7a

7、充 分溶解。3. dna的析出將溶液中的dna與其他雜質分離，這一步驟是實驗成敗的關鍵。教材中列舉了提取dna 的三種方案，本案例選取方案一。加蒸懈水降低nacl溶液濃度，使dna析出。實驗中應該 緩慢貼樂加入蒸錨水，并輕輕地沿一個方向不停地均勻攪拌，以利于dna分子的附著和纏繞。 同時應注意控制加水量，使nacl溶液的終濃度為0.10. 2mol/lo加水過程一般分三次進 行，當總加水量為300ml左右時，dna已基本析出。加水太多、溶液過稀，會使dna分子又 重新溶解。用34層紗布對dna稀釋液進行過濾，濾去蛋白質，收集d7a的黏稠物。如果采用離 心法，效果更好。用4000r/min轉速的

8、離心機，離心15min,除去上清液（含有蛋白質），留 卜的沉淀物中含有dnao此時注意觀察dna黏稠物的顏色。4. dna的初步純化如果提取的dna量不夠多且其中禽有較多雜質，或者加入溶液和攪拌等操作過程不規(guī) 范，都會導致實驗現(xiàn)象不明顯，常常使制取的dna粗制品不能顯示出dna的本色白色。 為了增進實驗效果，需要對d7a粗制品進行簡單的提純，下面的方案可供參考。將dna黏稠物再溶解，繼續(xù)用2mol/l的nacl溶液20ml溶解dna黏稠物，仍ih沿一個 方向不停攪拌3min,使dna充分溶解，以免損失。用34層紗布進行過濾（或離心），濾 去雜質，收集含有dna的濾液。向濾液中貼舉緩慢加入50m

9、l預冷的體積分數(shù)為95%的乙醇, 并用玻璃棒朝一個方向緩慢、均勻地攪拌，溶液屮會出現(xiàn)dma絲狀物。實驗一般要求釆用預冷的95%的乙醇，但對比結果顯示，常溫下的乙醇溶液也可產(chǎn)生 明顯效果。從理論上分析，預冷的乙醇溶液具有以下優(yōu)點。一是抑制核酸水解酶活性，防止 dna降解；二是降低分了運動，易于形成沉淀析;lh三是低溫冇利于增加dna分了柔韌性， 減少斷裂。此時懸浮于溶液中的dna絲狀物相對禽雜質較少，如果出現(xiàn)的絲狀物較少，可以 將此混介液再放入冰箱屮冷卻兒分鐘。濃縮后的dna絲狀物，可以用緩緩旋轉玻璃棒的方法 卷起（因為玻璃棒冇吸附dna的作用）。如果dna絲狀物較少，不易吸附在玻璃棒上，也可以

10、 用筷子等表面粗糙的用具來幫助dna分子纏繞。dna的純化述有許多其他方法。例如，添加質量分數(shù)為25%的十二烷基磺酸鈉（sds）溶 液，使蛋白質變性后與dna分開。隨后，加入氯仿一異丙醇混合液（體積比為24 : 1）,通 過離心將蛋白質及其他雜質除去，取上清液?？芍貜蜕鲜霾僮鲀捍?，直至上清液變成透明的 黏稠液體。此外苯酚可以迅速使蛋白質變性，抑制核酸酶的活性。利用苯酚處理后，離心分 層，dna溶于上層水相，蛋白質變性存在于酚層中，這時可用分液漏斗或吸管等儀器將二者 分開。教師可以根據(jù)學校的條件讓學生自己設計實驗方案，比較實驗結果。5. dna的鑒定二苯胺法二苯胺試劑的配制及鑒定dma的方法參見

11、教科書。需要注意的是，二苯胺試劑 在冰箱內可保存6個刀，使用前需搖勻。紫外燈照射法川蒸謂水配制質量分數(shù)為0.05%的溟化乙錠（eb）溶液，將玻璃棒上纏繞的 白色絮狀物抹到蠟紙上，再滴1滴eb溶液染色。將蠟紙放在紫外燈（260nm）下照射（暗室中）, 可呈現(xiàn)橙紅色的螢光（dna的紫外吸收高峰在260nm處）。電泳法此方法適合鑒立純度較高的dnao有條件的學校可以參考本專題課題2的實驗案 例和參考資料部分。案例二以菜花為實驗材料進行dna的粗提取課前準備將新鮮菜花和體積分數(shù)為95%的乙醇溶液放入冰箱冷凍室24ho提取dna的具體步驟1. 取材稱取30g菜花，去梗取花，切碎。2. 研磨將碎菜花放入研

12、缽中，倒入10汕研磨液，充分研磨lomino研磨液的配制方法如下。將10. igtris （三輕甲基氨基甲烷）加入到50ml蒸憾水中, 使其溶解，然后，用2mol/l的hc1溶液調節(jié)ph至8. 0,再加入876gnacl、37 2gedta、20gsds。 待上述藥品全部溶解后，再用蒸懈水定容至looomlo教材中建議采用洗發(fā)香波、洗滌劑等一些去污劑，使植物細胞膜破碎，釋放d7a。學生 可以設直対照實驗，比較哪一種方法可以提取到純度更高的dnao 般實驗室提取高純度的 dna都采用一種陽離子去污劑十六烷三甲基滉化做分離緩沖液，使細胞脫破碎，同時將 dna與植物中多糖等雜質分開，再用氯仿一異丙醇

13、混合液（體積比為24： 1）抽提去除雜質 蛋白,得到高純度的dnao3. 過濾在漏斗中墊上尼龍紗布，將菜花研磨液過濾到燒杯中（冇條件的學?？蓪V液倒 入塑料離心管中進行離心，用looor/min的轉速，離心25min,取上清液放入燒杯中）。 在4°c冰箱中放置幾分鐘后，再取上淸液。4. 沉淀將一倍體積的上清液倒入兩倍體積的體積分數(shù)為95%的預冷乙醇溶液中，并用 玻璃棒緩緩、輕輕地攪拌溶液（玻璃棒不要直插到燒杯底部）。沉淀35minjn,可見白色的 dna絮狀物出現(xiàn)。用玻璃棒緩緩旋轉，將絮狀物纏繞在玻璃棒上。要點4疑難解答（1）為什么加入蒸飾水能使雞血細胞破裂？蒸溜水對于雞血細胞來說是

14、一種低滲液體，水分可以大量進入血細胞內，使血細胞脹裂, 再加上攪扌半的機械作用，就加速了雞血細胞的破裂（細胞膜和核膜的破裂），從而釋放出dnao（2）在切碎的洋蔥加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細胞膜，冇利于dna的釋放；食鹽的主要成分是nacl, 有利于dna的溶解。（3）提取洋蔥dna時如果研磨不充分，會對實驗結果產(chǎn)生怎樣的影響？研磨不充分會使細胞核內的dma釋放不完全，提取的dna量變少，影響實驗結果，導致 看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍色等。（4）為什么反復地溶解與析出dna,能夠去除雜質？用高鹽濃度的溶液溶解dm,能除去在高鹽中不能溶解的雜質；用低鹽濃度使dna析出, 能除去溶解在低鹽溶液中的雜質。因此，通過反復溶解與析出dna,就能夠除去與dna溶解 度不同的多種雜質。要點5參考資料1. 二苯