廣泛存在于植物組織中,新鮮的水果、蔬菜,特別是棗、辣

1、維生素C是一種已糖醛基酸，有抗壞血病的作用，所以被人們稱做抗壞血酸，主要為還原型及脫氫型兩種，廣泛存在于植物組織中，新鮮的水果、蔬菜，特別是棗、辣椒、苦瓜、柿子葉、獼猴桃、柑橘等食品中含量較多。它是氧化還原酶之一，本身易被氧化，但在有些條件下又是一種抗氧化劑。 維生素C（還原型）純品為白色無臭結(jié)晶，熔點190192，溶于水或乙醇中，不溶于油劑。在水溶液中易被氧化，在堿性條件下易分解，在弱酸條件中較穩(wěn)定，維生素C開始氧化為脫氫型抗壞血酸（有生理作用）。如果進(jìn)一步水解則生成2，3-二酮古樂糖酸，失去生理作用。 根據(jù)它具有的還原性質(zhì)可以測定維生素C的含量。常用的測定方法有 （1）2，6-二氯靛酚法

2、（還原型VC） （2）2，4-二硝基苯肼法 （總VC） （3）碘量法 （4）熒光分光光度法 一、2，6-二氯靛酚滴定法 1、原理： 還原型抗壞血酸還原染料2，6-二氯靛酚，該染料在酸性中呈紅色，被還原后紅色消失。還原型 抗壞血酸還原2，6-二氯靛酚后，本身被氧化成脫氫抗壞血酸。在沒有雜質(zhì)干擾時，一定量的樣 品提取液還原標(biāo)準(zhǔn)2，6-二氯靛酚的量與樣品中所含維生素C的量成正比。 2、試劑 1%草酸溶液：稱取10g草酸，加水至1000ml； 2%草酸溶液：稱20g草酸，加水至1000ml； 維生素C標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱20mgVC溶于1%草酸中，并稀釋至100ml，吸5ml于50ml容量瓶中，加入1%草酸

3、至刻度，此溶液每毫升含有0.02mgVC； 0.02%2，6-二氯靛酚溶液：稱取2，6-二氯靛酚50mg，溶于200ml含有52mg碳酸氫鈉的熱水中，冷卻后，稀釋至250ml，過濾于棕色瓶中，貯存于冰箱內(nèi)，應(yīng)用過程中每星期標(biāo)定一次。 標(biāo)定一：吸標(biāo)液（VC）5ml于三角瓶加6%KI溶液0.5ml加1%淀粉3滴用0.001N KIO3標(biāo)液滴定到淡蘭色。 計算： 抗壞血酸濃度（mg/ml）= （V1 × 0.088）/ V2 V1 - 滴定時消耗0.001N KIO3標(biāo)液的體積（ml） V2 -維生素C重量（g） 0.088 -1ml0.001N KIO3標(biāo)液維生素C的量（mg/ml） 標(biāo)

4、定二：吸5ml已知濃度V C標(biāo)液 加5ml1%草酸 用染料2，6-二氯靛酚滴定至溶液呈粉紅色，在15秒不褪色為終點 計算：每毫升2，6-二氯靛酚相當(dāng)于維生素C的毫克數(shù)等于滴定度（T） T= （C × V1）/ V2 C - 維生素C的濃度（mg/ml） V1 -維生素C的體積（ml） V2 -消耗2，6-二氯靛酚的體積（ml） 0.001N KIO3標(biāo)液：吸0.1N KIO3溶液5ml于500ml容量瓶內(nèi)加水至刻度，每毫升相當(dāng)于VC0.008mg； 0.5%淀粉溶液； 6%KI溶液； 3、操作方法 提取：稱樣50g加2%草酸100ml到入搗碎機(jī)中處理過濾顏色若深可加白陶土 滴定：吸5

5、ml樣液于三角瓶用染料滴定至粉紅色15秒內(nèi)不褪色 計算： VC（mg/100g）=（V × T）/ W × 100 V -消耗染料體積（ml） T -1ml染料所能氧化維生素C的毫克數(shù) W- 滴定時所有濾液中含有樣品的克數(shù) 4、注意事項 所有試劑的配制最好都用重蒸餾水； 滴定時，可同時吸二個樣品。一個滴定，另一個作為觀察顏色變化的參考； 樣品進(jìn)入實驗室后，應(yīng)浸泡在已知量的2%草酸液中，以防氧化，損失維生素C； 貯存過久的罐頭食品，可能含有大量的低鐵離子（Fe2+），要用8%的醋酸代替2%草酸。這時如用草酸，低鐵離子可以還原2，6-二氯靛酚，使測定數(shù)字增高，使用醋酸可以避免這

6、種情況的發(fā)生； 整個操作過程中要迅速，避免還原型抗壞血酸被氧化； 在處理各種樣品時，如遇有泡沫產(chǎn)生，可加入數(shù)滴辛醇消除； 測定樣液時，需做空白對照，樣液滴定體積扣除空白體積。 熒光法 1原理 樣品中還原型抗壞血酸經(jīng)活性炭氧化成脫氫型抗壞血酸后，與鄰苯二胺（OPDA）反應(yīng)生成具有熒光的喹喔啉（quinoxaline）,其熒光強(qiáng)度與脫氫抗壞血酸的濃度在一定條件下成正比，以此測定食物中抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量。 脫氫抗壞血酸與硼酸可形成復(fù)合物而不與OPDA反應(yīng)，以此排除樣品中熒光雜質(zhì)所產(chǎn)生的干擾。本方法的最小檢出限為0.022 g/ml。 2適用范圍 GB12392-90 本方法適用于蔬菜、水果

7、及其制品中總抗壞血酸的測定 3儀器 31實驗室常用設(shè)備。 32熒光分光光度計或具有350nm及430nm波長的熒光計。 33打碎機(jī)。 4試劑 本實驗用水均為蒸餾水，試劑不加說明均為分析純試劑。 （1）偏磷酸乙酸液：稱取15g偏磷酸，加入40ml冰乙酸及250ml水，攪拌，放置過夜使之逐漸溶解，加水至500ml。4冰箱可保存710天。 （2）0.15 mol/L硫酸：取10ml硫酸，小心加入水中，再加水稀釋至1200ml。 （3）偏磷酸乙酸硫酸液：以0.15mol/L硫酸液為稀釋液，其余同4.1.配制。 （4）50 乙酸鈉溶液：稱取500g乙酸鈉（CH3COONa3H2O），加水至1000ml。

8、 （5）硼酸-乙酸鈉溶液：稱取3g硼酸，溶于100ml乙酸鈉溶液（4.4）中。臨用前配制。 （6） 鄰苯二胺溶液：稱取20mg鄰苯二胺，于臨用前用水稀釋至100ml。 （7） 0.04%百里酚藍(lán)指示劑溶液：稱取0.1g百里酚藍(lán)，加0.02mol/L氫氧化鈉溶液，在玻璃研缽中研磨至溶解，氫氧化鈉的用量約為10.75ml，磨溶后用水稀釋至250ml。 變色范圍：pH=1.2 紅色 pH=2.8 黃色 pH4.0 蘭色 （8） 活性炭的活化：加200g炭粉于1L 1+9鹽酸中，加熱回流12h，過濾，用水洗至濾液中無鐵離子為止，置于110120烘箱中干燥，備用。 （9）標(biāo)準(zhǔn) 抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（1mg/

9、ml）：準(zhǔn)確稱取50mg抗壞血酸，用溶液（4.1）溶于50ml容量瓶中，并稀釋至刻度。 抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)使用液（100g/ml）: 取10ml抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)液，用偏磷酸-乙酸溶液稀釋至100ml。定容前試pH值，如其pH2.2時，則應(yīng)用溶液（4.3）稀釋。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取下述"標(biāo)準(zhǔn)"溶液（抗壞血酸含量10g/ml）0.5、1.0、1.5和2.0ml標(biāo)準(zhǔn)系列，取雙份分別置于10ml帶蓋試管中，再用水補(bǔ)充至2.0ml。 5.操作步驟 5.1 樣品制備 全部實驗過程應(yīng)避光。 稱取100g鮮樣，加100g偏磷酸-乙酸溶液，倒入打碎機(jī)內(nèi)打成勻漿，用百里酚藍(lán)指示劑調(diào)試勻漿酸堿度。如呈紅色

10、，即可用偏磷酸-乙酸溶液稀釋，若呈黃色或蘭色，則用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀釋，使其pH為1.2。勻漿的取量需根據(jù)樣品中抗壞血酸的含量而定。當(dāng)樣品液含量在40100g/ml之間，一般取20g勻漿，用偏磷酸-乙酸溶液稀釋至100ml，過濾，濾液備用。 5.2 氧化處理：分別取樣品濾液及標(biāo)準(zhǔn)使用液各100ml于帶蓋三角瓶中，加2g活性炭，用力振搖1min，過濾，棄去最初數(shù)毫升濾液，分別收集其余全部濾液，即樣品氧化液和標(biāo)準(zhǔn)氧化液，待測定。 5.3 各取5ml標(biāo)準(zhǔn)氧化液于2個50ml容量瓶中，分別標(biāo)明"標(biāo)準(zhǔn)"及"標(biāo)準(zhǔn)空白"。 5.4 各取5ml樣品氧化液于2個50

11、ml容量瓶中，分別標(biāo)明"樣品"及"樣品空白"。 5.5 于"標(biāo)準(zhǔn)空白"及"樣品空白"溶液中各加5ml硼酸-乙酸鈉溶液，混合搖動15min，用水稀釋至50ml，在4冰箱中放置2h，取出備用。 5.6 于"樣品"及"標(biāo)準(zhǔn)"溶液中各加入5ml50%乙酸鈉溶液，用水稀釋至50ml，備用。 5.7 熒光反應(yīng) 取"標(biāo)準(zhǔn)空白"溶液，"樣品空白"溶液及（5.6）中"樣品"溶液各2ml，分別置于10ml帶蓋試管中。在暗室中迅速向各管中

12、加入5ml鄰苯二胺，振搖混合，在室溫下反應(yīng)35min，用激發(fā)光波長338nm、發(fā)射光波長420nm測定熒光強(qiáng)度。標(biāo)準(zhǔn)系列熒光強(qiáng)度分別減去標(biāo)準(zhǔn)空白熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的抗壞血酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或進(jìn)行相關(guān)計算，其直線回歸方程供計算時使用。 6. 計算 X=（c×V/m）×F×(100/1000) 式中：X-樣品中抗壞血酸及脫氫抗壞血酸總含量，mg/100g； c-由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得或由回歸方程算得樣品溶液濃度，g/ml； m-試樣質(zhì)量，g； F-樣品溶液的稀釋倍數(shù)； V-熒光反應(yīng)所用試樣體積，ml。 例： 測定每一制備溶液的熒光強(qiáng)度。用標(biāo)準(zhǔn)溶液每ml含2.5g

13、、5.0g、7.5g及10.0g，各標(biāo)準(zhǔn)濃度管讀數(shù)減去相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)空白讀數(shù)的各平均值做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 由樣品液讀數(shù)減去樣品液空白讀數(shù)之值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的抗壞血酸（g/ml），按取樣量及稀釋率計算樣品中抗壞血酸的含量。 如：取制備好的辣椒樣品2.138g，稀釋到100ml，氧化后分別取10ml濾液稀釋到50ml 樣品讀數(shù)為23.34，樣品空白讀數(shù)為3.188，樣品讀數(shù)減去樣品空白讀數(shù)為20.152，查熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸的2.23g。 2.23×100× 50× 100 - -= 52（mg/100g） 2.138× 10 ×1000

14、7. 注意事項 7.1 大多數(shù)植物組織內(nèi)含有一種能破壞抗壞血酸的氧化酶，因此，抗壞血酸的測定應(yīng)采用新鮮樣品并盡快用偏磷酸-醋酸提取液將樣品制成勻漿以保存維生素C。 7.2 某些果膠含量高的樣品不易過濾，可采用抽濾的方法，也可先離心，再取上清液過濾。 7.3活性炭可將抗壞血酸氧化為脫氫抗壞血酸，但它也有吸附抗壞血酸的作用，故活性炭用量應(yīng)適當(dāng)與準(zhǔn)確，所以，應(yīng)用天平稱量。我們的實驗結(jié)果證明，用2g活性炭能使測定樣品中還原型抗壞血酸完全氧化為脫氫型，其吸附影響不明顯。 2，4-二硝基苯肼法 1原理 總抗壞血酸包括還原型、脫氫型和二酮古樂糖酸。樣品中還原型抗壞血酸經(jīng)活性炭氧化為脫氫抗壞血酸，再與2，4-

15、二硝基苯肼作用生成紅色脎，脎的含量與總抗壞血酸含量成正比，進(jìn)行比色測定。 2適用范圍 GB12392-90 本方法適用于蔬菜、水果及其制品中總抗壞血酸的測定。 3. 儀器 3.1恒溫箱：37±0.5 3.2可見-紫外分光光度計 3.3打碎機(jī) 4試劑 本實驗用水均為蒸餾水，試劑純度均為分析純。 4.1 4.5mol/L硫酸：謹(jǐn)慎地加250ml硫酸（比重1.84）于700ml水中，冷卻后用水稀釋至1000ml。 4.2 85%硫酸：謹(jǐn)慎地加900ml硫酸（比重1.84）于100ml水中。 4.3 2%2，4-二硝基苯肼溶液：溶解2g 2，4-二硝基苯肼于100ml4.5mol/L硫酸內(nèi)，

16、過濾。不用時存于冰箱內(nèi)，每次用前必須過濾。 4.4 2%草酸溶液：溶解20g草酸于700ml水中，稀釋至1000ml。 4.5 1%草酸溶液：稀釋500ml 2%草酸溶液到1000ml。 4.6 1%硫脲溶液：溶解5g硫脲于500ml 1%草酸溶液中。 4.7 2%硫脲溶液：溶解10g硫脲于500ml1%草酸溶液中。 4.8 1mol/L鹽酸：取100ml鹽酸，加入水中，并稀釋至1200ml。 4.9 活性炭：將100g活性炭加到750ml 1mol/L鹽酸中，回流12h，過濾，用水洗數(shù)次，至濾液中無鐵離子（Fe3+）為止，然后置于110烘箱中烘干。 4.10 標(biāo)準(zhǔn) （1）抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（1

17、mg/ml）：溶解100mg純抗壞血酸于100ml 1%草酸溶液中。 （2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 加1g活性炭于50ml標(biāo)準(zhǔn)溶液中，搖動1min，過濾。 取10ml濾液放入500ml容量瓶中，加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀釋至刻度?？箟难釢舛葹?0g/ml。 取5，10，20，25，40，50，60ml稀釋液，分別放入7個100ml容量瓶中，用1%硫脲溶液稀釋至刻度，使最后稀釋液中抗壞血酸的濃度分別為1，2，4，5，8，10及12g/ml。 按樣品測定步驟形成脎并比色。 以吸光值為縱坐標(biāo)，以抗壞血酸濃度（g/ml）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 5. 操作步驟 5.1樣品制備 全部實驗過程應(yīng)避光。 5.1

18、.1鮮樣制備：稱100g鮮樣和100g2%草酸溶液，倒入打碎機(jī)中打成勻漿，取10-40g勻漿（含1-2mg抗壞血酸）倒入100ml容量瓶中，用1%草酸溶液稀釋至刻度，混勻。 5.1.2干樣制備：稱1-4g干樣（含1-2mg抗壞血酸）放入乳缽內(nèi)，加入1%草酸溶液磨成勻漿，倒入100ml容量瓶中，用1%草酸溶液稀釋至刻度，混勻。 5.1.3將上述兩液過濾，濾液備用。不易過濾的樣品可用離心機(jī)沉淀后，傾出上清液，過濾，備用。 5.2氧化處理：取25ml上述濾液，加入0.5g活性炭，振搖1min，過濾，棄去最初數(shù)毫升濾液。取10ml此氧化提取液，加入10ml 2%硫脲溶液，混勻。 5.3呈色反應(yīng) 5.3

19、.1于三個試管中各加入4ml稀釋液。一個試管作為空白，在其余試管中加入1.0ml 2%2，4-二硝基苯肼溶液，將所有試管放入37±0.5恒溫箱或水浴中，保溫3h。 5.3.2 3h后取出，除空白管外，將所有試管放入冰水中?？瞻坠苋〕龊笫蛊淅涞绞覝?，然后加入1.0ml 2%2，4-二硝基苯肼溶液，在室溫中放置1015min后放入冰水內(nèi)。其余步驟同樣品。 5.3.3 85%硫酸處理：當(dāng)試管放入冰水后，向每一試管中加入5ml85%硫酸，滴加時間至少需要1min，需邊加邊搖動試管。將試管自冰水中取出，在室溫放置30min后比色。 5.3.4 比色：用1cm比色杯，以空白液調(diào)零點，于500nm

20、波長測吸光值。 6. 計算 同熒光法。 7. 注意事項 7.1 大多數(shù)植物組織內(nèi)含有一種能破壞抗壞血酸的氧化酶，因此，抗壞血酸的測定應(yīng)采用新鮮樣品并盡快用2%草酸溶液制成勻漿以保存維生素C。 7.2 若溶液中含有糖，硫酸加得太快，溶解熱會使溶液變黑。 7.3 試管自冰水中取出后，顏色會繼續(xù)變深，所以，加入硫酸后30分鐘應(yīng)準(zhǔn)時比色。 碘滴定法 一、目的及原理 本試驗是利用碘酸鉀做氧化劑。即在一定量的鹽酸酸性試液中加碘化鉀淀粉指示劑，用已知濃度的碘酸鉀滴定。當(dāng)?shù)馑徕浀稳牒蠹瘁尫懦鲇坞x的碘，此碘被維生素C還原，直至維生素C完全氧化后，再滴以碘酸鉀液時，釋放出的碘因無維生素C的作用，可使淀粉指示劑呈藍(lán)

21、色，即為中點，其反應(yīng)如下： KIO3 + 5KI + 6HCl6KCl + 3H2O + 3 I2 二、藥品與器材 柑橘、鮮棗、洋蔥、甘藍(lán)、辣椒等。 碘酸鉀、碘化鉀、淀粉，2%鹽酸。 研缽、燒杯、100ml容量瓶、0.5、2、5ml移液管、滴定管、漏斗、紗布、分析天平。 三、操作與步驟 1.試劑制備 （1）0.5%淀粉液：稱取可溶性淀粉0.5g，用蒸餾水調(diào)成漿狀，注入100ml蒸餾水，煮沸至透明狀，冷后用棉花過濾。 （2）0.001N KIO3液：精確稱取KIO3 0.3568g（KIO3預(yù)先在102烘2小時，在干燥器中冷卻備用）， 準(zhǔn)確配成1000ml，得到0.01N KIO3液。再稀釋10倍即為0.001N。 2.樣品試液的制備： 將果蔬樣品洗凈，用紗布拭干其外部所附著的水分，若樣品清潔可不必洗滌。樣