Survivin靶向siRNA重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

1、survivin靶向sirna重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定楊紅劉月波 黃桂云 張鈾（通訊作者）（云南昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科 云南昆明 650101）【摘要】目的 構(gòu)建survivin靶向sirna重組表達(dá)載體。方法 根據(jù)genebank 數(shù)據(jù)庫提供的survivin基因所有變異體的共同核昔酸序列，選擇設(shè)計(jì)一對帶發(fā)夾 結(jié)構(gòu)的核昔酸序列,克隆到空載體psiren-dnr-dsred-express中,轉(zhuǎn)化dh5 a菌 株，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測序分析以及菌落pcr。結(jié)果 經(jīng)質(zhì)粒pcr、菌落 pc及測序證實(shí)survivin靶向sirna重組表達(dá)載體結(jié)果與設(shè)計(jì)完全一致。結(jié)論 survivin靶向

2、sirna重組表達(dá)載體構(gòu)建成功?！娟P(guān)鍵詞】rna干擾surviving基因治療survivn是凋亡抑制蛋白家族（laps）的新成員，獨(dú)立于b型淋巴瘤細(xì)胞 因子2 （bcl-2）家族，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的凋亡抑制因子。survivin蛋 白調(diào)節(jié)所有細(xì)胞分裂和存活，并且廣泛表達(dá)于人類大多數(shù)惡性腫瘤組織中，因 此特異性針對survivin的基因治療具有良好的靶向性、特異性和安全性。木實(shí)驗(yàn) 用基因克隆技術(shù)構(gòu)建survivin靶向的小干擾rna即sirna重組表達(dá)載體，探討 用rna干擾方法干擾腫瘤細(xì)胞中的survivin基因的表達(dá)，從而為腫瘤的基因治療 提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1大腸桿菌d

3、h5 a ,質(zhì)粒psiren-dnr-dsred-express購自大連寶生物 公司,t4dna連接酶，bamh i限制酶ecor i限制酶，dna marker均購自大連寶 牛物公司。1.2靶向survivin基因sirna的設(shè)計(jì)survivin基因序列來自genebank（編 號nm001168）,利用genechemtmsirna設(shè)計(jì)工具,參照sirna設(shè)計(jì)原則，在 survivin的序列中選取理論上最佳的一段作為靶序列為：5, -ggaccaccgcatctctaca-3, （78-96）,針對這段靶序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的dna序列，經(jīng)blast分析證明與人類其他編碼序列無同源性。在設(shè)計(jì)的寡核

4、昔酸鏈中，兩端分 別為bamh i和ecor i的酶切位點(diǎn)，能夠與線性化的載體直接連接。人工合成2 對互補(bǔ)并編碼相應(yīng)短發(fā)夾sirna的寡核甘酸鏈。shrna-survivinl邙日性）5-gatccggaaccaccgcatctctacatcgtgctcctggttgtgtagagatgcggtggtccttttttg-3,（正義鏈），5-aattcaaaaaaggaaccaccgcatctctacacaaccaggagcactatgtagagatgcggtggtccg-3,（反義鏈）；shrna-survivin2（陰性）：5-gatcccccaacgatctgcacacgttagtgctv

5、vtggttgacgtgtgcagatcgttgggttttttg-3,（正義鏈），5-aattcaaaaaacccaacgatctgcacacgtcaaccaggagcactaacgtgtgcagatcgttgggg-3,（反義鏈）；下劃線為連接酶位點(diǎn)。1.3線性化載體的制備 將質(zhì)粒psiren-dnr-dsred-express用bamh i和ecor i雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物并冋收大片段。1.4單鏈0的基因survivn片段的退火連接 各用50μl退火緩沖液溶 解上述合成2 0d的單鏈目的基因片度，稀釋成0.010d/μlo各取l&mu

6、;l （即 lμl正義鏈+lμl反義鏈）+lμl退火緩沖液混勻。94°c水浴退火，自然 冷卻至室溫，30°c水浴90min, 4°c保存。1.5重組表達(dá)載體的連接與轉(zhuǎn)化 將稀釋的survivn退火片段與線性化 的psiren-dnr-dsred-express質(zhì)粒表達(dá)載體連接。連接反應(yīng)條件為：稀釋的 survivin 退火片段 1μl,顯性化的 psiren-dnr-dsred-express 質(zhì)粒載體 1μl, 10x連接酶緩沖液lμl, t4dna連接酶lμl,

7、h20 6μl, 22°c水浴反應(yīng) 過夜。重組表達(dá)載體分別命名為survivin-1, survivn-2o各取5μl過夜連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞dh5 a。1.6陽性克隆篩選和鑒定設(shè)計(jì)測序引物序列，由人連寶生物合成。psiren-pl:5,tgggctatgaactaatgacc-3, psiren-p2:5,-taattt ctt g g gtagttt g c-3,將菌液涂布于含氨茉霉素抗性的lb平板上，37°c恒溫箱培養(yǎng)過夜。然后各挑取 8個單克隆菌落，浸泡在含20μl 0.1%triton液中置100°c加熱2mi

8、n,取2μl 作模板，以psiren-pl和psiren-p2為引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增,取10pcr產(chǎn)物，進(jìn) 行1%瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外光投射下進(jìn)行凝膠照相。采用引物系列，上游 弓i物 5,gttttcccagtcacgac-3,下游弓i物:5,gagttagctcactcattaggc-3, 進(jìn)行pcr擴(kuò)增，產(chǎn)物為6700bp, 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，同吋從瓊脂糖凝膠電 泳中冋收擴(kuò)增產(chǎn)物，由大連寶生物測序鑒定，判斷插入的堿基序列是否正確。2結(jié)果2.1重組質(zhì)粒測序鑒定本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了表達(dá)shrna-survivin的重組質(zhì)粒載體，經(jīng)測序證實(shí)插 入的shrna-survivin

9、序列正確（圖1）。2.2菌落pcr結(jié)果（見圖2）m: dl2000marker:2000bp/1000bp,750bp,500bp/250bp?100bp左陽性質(zhì)粒survivin-1菌落pcr產(chǎn)物 右1&陰性質(zhì)粒survivin-2菌落pcr產(chǎn)物圖22.3 pcr方法鑒定重組質(zhì)粒用pcr擴(kuò)增后，得到6700bp的產(chǎn)物，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，如圖3 所示。m： supercoiled dna ladder marker： 2,087 bp 3,049 bp> 3,997 bp、5,026 bp、6,133 bp 8,023 bp> 10,085 bp> 11,849

10、bp； 1 陽性質(zhì)粒 survivin-1； 2 陰性質(zhì) 粒 survivin-2圖33討論在細(xì)胞增殖周期中，survivin基因主要表達(dá)于g2/m期，起調(diào)節(jié)基因作 用，可對抗g2/m期凋亡的誘導(dǎo)，在癌癥中的過度表達(dá)克服凋亡的關(guān)卡(checkpoint),抑制細(xì)胞凋亡效應(yīng)性蛋白酶caspase3,通過有絲分裂分裂促進(jìn)轉(zhuǎn) 化細(xì)胞的異常增殖(aberrant progression) 2；同時引起細(xì)胞c-myc和cyclindl 的表達(dá)水平增高，激活端粒酶，從而延長細(xì)胞的壽命，導(dǎo)致細(xì)胞癌變，在腫瘤的 發(fā)生發(fā)展中起重要作用。rna干擾(rna interference, rnai)是指細(xì)胞中導(dǎo)入與

11、內(nèi)源性mrna編碼區(qū)某段序列同源的雙鏈rna (double-stranded rna,dsrna), 可致該mrna發(fā)生特異性講解從而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象3。近幾年來，rnai 研究取得了突破性的進(jìn)展，被science雜志評為2001年的十大科學(xué)進(jìn)展之一，并 名列2002的十人科學(xué)進(jìn)展之首。高效特異性的rnai技術(shù)具有傳統(tǒng)反義技術(shù)不可 比擬的優(yōu)勢，近年來進(jìn)行了大量的研究并取得了豐富的成果，成為基因功能研究 及基因治療研究的全新手段。但是rnai技術(shù)本身具有不足之處，如rnai的特異 性是相對的，在某些情況下，sirna能在翻譯水平抑制與之不完全相關(guān)的基因表 達(dá)即脫靶效應(yīng)4,須從sirna的

12、設(shè)計(jì)，sirna的為止特異性修飾等方面研究解決 的方法。而且，有研究表明，sirna被導(dǎo)入細(xì)胞后，還可能和細(xì)胞內(nèi)原有的微笑 rna形成競爭，因此可以影響原本由微小rna控制的一些基因的表達(dá)，從而對 細(xì)胞的一些生理或者病理過程產(chǎn)生影響。此外，在臨床應(yīng)用中如何有效地把sirna 導(dǎo)入細(xì)胞或者體內(nèi)尚是難題，雖然現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展起來很多技術(shù)促使此問題的解決 方案嶄露頭角，但是都還未從根本上克服，同吋rnai這一方法的具有嚴(yán)重的副 作用，從而導(dǎo)致了臨床應(yīng)用的局限，但是我們還是有理由相信隨著在理論與技術(shù) 的源頭上長久不懈的努力會給這項(xiàng)技術(shù)帶來光明的前程。參考文獻(xiàn)1 ambrosini g, adida c,

13、altieri dc, et al. a novel anti-apoptosis gene survivin, expressed in cancer and lymphoma j.nat med, 1997, 3:917.2 an drade f, roy s, nichols on d, et al. gran zyme b directly efficiently cleaves several downstream caspase substrates implications for ctl-induced apoptosisj.immunity, 1998, &4):4512-4560.3 唐富酬，薛友紡.rna干擾與基