MBP不同cDNA序列真核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

1、mbp不同cdna序列真核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定摘要目的 以pegfp-n 1質(zhì)粒載體為介導(dǎo)，構(gòu)建針對 髓鞘堿性蛋白(mbp)不同isoform cdna的表達(dá)載體。 方 法 將三段不同mbp cdna序列克隆入pegfp-nl質(zhì)粒，轉(zhuǎn) 化dh5a感受態(tài)細(xì)胞，酶切鑒定及測序。 結(jié)果 測序結(jié)果 顯示插入的三段目的片段的序列與理論序列一致。 結(jié)論 筆者成功構(gòu)建了 pegfp-n 1-mbp21. 5, pegfp-nl-mbp18. 5 和 pegfp-n1-mbp17. 3三個重組真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研 究不同mbp cdna在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況和功能差異奠定 基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞mbp cdna；真核

2、表達(dá)；pegfp-nl質(zhì)粒；載 體構(gòu)建中圖分類號r-33 文獻(xiàn)標(biāo)識碼a 文章編號 1674-4721 (2012) 12 (c) -0005-03髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein, mbp)是脊 椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突細(xì)胞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)雪旺細(xì)胞合 成的一種膜蛋白，含有多種堿性氨基酸，為髓鞘的構(gòu)成蛋白。 mbp對人腦發(fā)育、神經(jīng)細(xì)胞分化、髓鞘發(fā)生與髓鞘形成具有 重要生理作用llo 1962年，laatsch rh等2首先從豚鼠 腦中分離出mbp,隨后國內(nèi)外學(xué)者在生理、生化及分子水平 上對mbp進(jìn)行了廣泛而深入的研究。人和鼠的mbp基因均位 于第18號染色體遠(yuǎn)端即18q2223

3、,跨度3234 kb,含 有7個外顯子。人腦中有21. 5, 20, 18. 5, 17. 3和14 kda 等mrna拼接產(chǎn)物，除21. 5 kda外，其余缺失外顯子ii、 iii或vi,成人髓鞘中18. 5 kda mbp含量最高3-7 o1材料與方法1.2.3連接及轉(zhuǎn)化 線性載體與目的片段序列用t4 dna ligase, 4£連接過夜，cac12法制備轉(zhuǎn)化大腸埃希菌 感受態(tài)細(xì)胞dh5a,涂布于卡那抗性lb平板，37匸恒溫培養(yǎng) 箱培養(yǎng)過夜。1.2.4質(zhì)粒篩選及鑒定挑選克隆，提取質(zhì)粒（按 takara公司說明書），hindhi和sal i雙酶切鑒定挑選陽性 重組子，上海生工公司測

4、序。2結(jié)果2. 1 mbp cdna pcr 擴(kuò)增結(jié)果2. 3質(zhì)粒測序結(jié)果3討論3種mbp cdna的表達(dá)在不同組織細(xì)胞和發(fā)育階段中，具有較大差異。現(xiàn)階段我們對不同mbp蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)的生 長發(fā)育和分化過程中的具體作用和功能差異還缺乏了解。筆 者將3個不同長度mbp cdna片段插入攜帶綠色熒光蛋白標(biāo) 記基因的pegfp-nl真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)酶切及測序鑒定，成 功構(gòu)建 pegfp-nl-mbp21.5 、 pegfp-nl-mbp18.5 和 pegfp-nl-mbp17. 3三個質(zhì)粒載體，為進(jìn)一步研究不同mbp cdna在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)1 rumsby m

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